Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Dannelse av human prostata Epitel hjelp Tissue rekombinasjon av gnager Urogenitale Sinus mesenchyme og menneskelige stamceller

Published: June 22, 2013 doi: 10.3791/50327
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Surgery, Section of Urology, University of Chicago, 2Committee on Cancer Biology, University of Chicago

Summary

For å løse de tidligste molekylære mekanismene bak prostatakreft initiering, roman og innovative menneskelige modellsystemer og tilnærminger er desperat behov. Potensialet i pre-prostatahyperplasi urogenitale sinus mesenchyme (UGSM) for å overtale pluripotente stamceller populasjoner for å danne menneskelige prostata epitel er et kraftig eksperimentelt verktøy i prostata forskning.

Abstract

Progress in prostatakreft forskning er sterkt begrenset av tilgangen på human-deriverte og hormon-naive modellsystemer, som begrenser vår evne til å forstå genetiske og molekylære hendelser som ligger til grunn prostata sykdom innvielse. Mot å utvikle bedre modellsystemer for å studere menneskelig prostata av kreft, har vi og andre tatt nytte av den unike pro-prostatahyperplasi induktive potensialet i embryonale gnager prostata stroma, kalt urogenitale sinus mesenchyme (UGSM). Når rekombineres med visse pluripotente cellepopulasjoner som embryonale stamceller, induserer UGSM dannelse av normal human prostata epitel i en testosteron-avhengig måte. En slik human modell-system kan brukes til å undersøke og eksperimentelt teste evnen av kandidat prostatakreft mottakelighet gener i en akselererende tempo, sammenlignet med vanlige gnagere transgene studier. Siden humane embryonale stamceller (hESCs) kan genmodifisert i kultur using induserbar genekspresjon eller siRNA knock-down vektorer før vevet rekombinasjon, letter en slik modell teste de funksjonelle konsekvensene av gener, eller kombinasjoner av gener, som antas å fremme eller hindre kreftutvikling.

Teknikken med å isolere rene bestander av UGSM celler, derimot, er utfordrende og læring ofte krever en person med tidligere kompetanse til personlig lære. Videre kan vaksinasjon av celle blandinger under nedsatt kapsel av en immunkompromittert host være teknisk utfordrende. Her vil vi skissere og illustrere riktig isolering av UGSM fra gnagere embryoer og nedsatt kapsel implantasjon av vev blandinger å danne menneskelige prostata epitel. En slik tilnærming, på sitt nåværende stadium, krever in vivo xenografting av embryonale stamceller, fremtidige applikasjoner kan potensielt omfatte in vitro kjertel formasjon eller bruk av induserte pluripotente stamceller populasjoner (iPSCs).

Introduction

Det er et enormt behov for bedre menneskelig modellsystemer for prostatakreft. Spesielt ville relevante menneskelige modellsystemer av normal, ikke-ondartet prostata vev som kan være genetisk manipulert til direkte skjelne rollen av spesifikke gener i initiering av prostatakreft være utrolig lærerikt. Ankomsten av genomisk æra har identifisert en rekke gener som kan ha en rolle i kreft formasjon. Mangel på eksperimentelle menneskelige modellsystemer, men svekker alvorlig vår evne til funksjonelt teste og karakterisere kandidat prostatakreft mottakelighet gener. En ideell modell system ville lette den raske og raskere funksjonelle analyser av kreft mottakelighet gener i kombinasjon med egnede transgene gnager modellsystemer. Videre ville en slik menneskelig modell system muliggjøre molekylær karakterisering av de signaliserer mekanismer for prostata karsinogenisitetsstudier mot oppdagelsen og validering av nye behandlingsformer for åforebygge prostatakreft formasjon.

Humane embryonale stamceller (hESCs) er i stand til å danne humane prostatiske vev som xenografter. I 2006 Taylor, et al. Rapporterte at hESCs kan bli overtalt til å danne prostatahyperplasi epithelia in vivo når re-kombinert med gnager urogenitale sinus mesenchyme (UGSM) innen en periode på 8-12 uker. 1 Disse studiene var basert på tidligere arbeid av den Cunha lab viser at gnager embryonale UGSM kan fremme prostata differensiering av stamceller og embryonale epiteliale celle populasjoner in vivo. 2,3 Prostata utvikler seg fra en embryonale anlagen kalt urogenitale sinus (UGS), og før embryonale dag 17 (mus E17 ; dag E18 i rotte) de UGS kan fjernes og fysisk delt inn epitel (UGSE) og mesenchyme (UGSM) 4 Dette vevet rekombinasjon tilnærmingen har betydelig forbedret vår forståelse av prostata utvikling og kreftutvikling, spesielt.ly vekstfaktor og hormonelle signalveier og de ​​molekylære relasjonene mellom prostata stroma og epitel. 5-8 Denne metoden innebærer ex vivo kombinasjon av UGSM med stilk eller epitelceller fra samme eller forskjellige arter, og disse cellulære / vev rekombinantar er implantert og vokst og xenografter i mus vert. 4,9 Etter en periode med in vivo vekst, inneholder implantatet prostata epiteliale kjertelstrukturer innleiret i stromal vev. Ytterligere fargingen kan gjennomføres for å bestemme om slike strukturer er virkelig i prostata og av human opprinnelse. 10,11

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av University of Chicago Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, protokoll tallene 72066 og 72231). Alle operasjoner ble utført under narkose, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Den menneskelige embryonale stamceller linje WA01 (H1; NIH-registrering # 0043) ble kjøpt fra WiCell (Madison, Wisconsin) og kultivert bruker materen-uavhengig protokoll hjelp mTeSR1 media (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). ES-celler ble anvendt i løpet av ti passasjer av tining.

En. Isolering av Urogenitale Sinus fra mus eller rotte Embryos

  1. Avlive en tidsbestemt-gravide mus (dag 17,5) eller rotte (dag 18,5) ved innånding av CO 2 for 5 min. Døden er bekreftet ved opphør av vitale tegn hos rotter. Deretter bryte nakken humant. Rpå er avlivet på dette punktet. Spray 70% etanol for å sterilisere abdominal hud og flankene. Skjær abdominal hud og muskel lag og deretter kutte livmoren, skille rotte embryoer fra amniotic sac, og klippe navlestrengen. Overfør embryoene til en 50 ml Falcon rør som inneholder iskald Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) og holde på is. Fostre avlives ved halshogging med kirurgisk saks.
  2. Plasser embryo i 100 mm petriskål. Halvere fosteret med saks på nivå med navlen (figur 1A). Fjern magen og tynntarmen. Avslør eggstokkene hos kvinnen embryo og testis i den mannlige fosteret (Figur 1B og 1C). (Ovariene er plassert på caudal poler av nyrene. Testiklene omtrent på nivået av blæren). På dette utviklingsmessige stadiet, UGSM isolert fra både mannlige og kvinnelige embryoer er i stand til å indusere en prostatisk epitelial linjen i nærvær av vertentestosteron. 4 Etter dette utviklingsmessig tidspunkt, men prostata knoppene begynner å danne i UGSM, og isolering av ren UGSM er svært utfordrende. 4
  3. Under disseksjon mikroskop, kuttet bukveggen i midten tråd med Vännäs saks for å avsløre blæren og bakre veggen av magen. Gratis øvre kjønnsorgan fra vedlegg (i mannlige embryoer, klipp ureter, Wolffian duct og Mullerian kanalsystem, i kvinnelige fostre, klipp ureter og Mullerian kanal). Frigjøre blæren fra navlestrengen. Skjær skambenet og uten omsvøp atskilt fra fremre vegg av urogenitale sinus med Dumont fin spiss tang. Til slutt separere bakre veggen av urogenitale sinus fra rektum. Skjær urogenitale sinus med blæren ved den nedre enden (fra urethra) og lagre den urogenitale sinus en bloc (med blæren) i iskald HBSS.

2. Separasjon av Urogenitale Sinus mesenchyme

    (figur 1D).
  1. Overfør urogenitale sinus til en falk rør som inneholder 1% trypsin i Calcium (Ca 2 +) og magnesium (Mg 2 +) gratis HBSS. Plasser røret i et kjøleskap ved 4 ° C i 75 min.
  2. Fjern trypsin og nøytralisere trypsinization med 10% Fetal Bovin Serum (FBS) i DMEM/F12 medium.
  3. Nøye erte den klebrige mesenchymal ermet fra epiteliale rør med en nål eller Dumont fin spiss tang (opprettholde epiteliale tube intakt reduserer sjansene for epitelcelle forurensning av mesenchyme, og dette kan resultere i gnager kjertler danner sammen med stamcelle-avledet menneskelig kjertel epitel) (figur 1D). 12.
  4. Overfør UGSM inn i en ny Falcon rør som inneholder DMEM/F12 medium + 10% FBS + 1% Penicillin / streptomycin (Pen / Strep, 0,5 mg / ml) + 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) pluss 1nm R1881. Pless røret i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 over natten.
  5. Sentrifuger vev ved 200 xg og kast supernatanten. Vask med fosfatbuffer saltvann (PBS) (ikke forstyrr vevet pellet).
  6. Legg 0.2% collagenase (i DMEM/F12) å re-suspendere vev. Inkuber i 37 ° C med forsiktig vuggende i 1 time.
  7. Kraftig vortex fordøyelsen vev tre ganger før det blir homogen encellede blandingen og tilsett DMEM/F12 medium + 10% FBS + 1% P / S + 1% NEAA + 1nm R1881 å nøytralisere collagenase.
  8. Sentrifuger ved 200 xg og vask deretter ved å re-suspendere de UGSM celler i HBSS, og gjenta tre ganger for å fullt vaske UGSM. Endelig suspendere mesenchymalceller i DMEM/F12 og telle cellene ved hjelp av en hemocytometer eller Celletellingen enhet.
  9. Distansere HMS celler dyrket ved hjelp av mater-fri protokoll med mTeSR1 medier (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) ved hjelp av en Accutase fordøyelsen (Millipore; Billerica, MA). Vask HMS celleri logaritmisk fase av deres vekst i varme DMEM/F12 medium, og deretter legge varme 1x Accutase løsning, og inkuber ved 37 ° C i 15-20 min inntil enkeltceller er jevnt dissosiert fra kolonier. Legg en lik mengde 1x definert trypsininhibitor (Invitrogen, Grand Island, New York) for å nøytralisere Accutase og forsiktig pipette opp og ned for å blande og bryte opp celle klumper. Pipette celler i en sentrifuge rør og sentrifuger i 3 min ved 200 xg, og re-suspendere cellepelleten i DMEM/F12 media. Sentrifuger røret i 3 min ved 200 xg igjen og fjern supernatanten, deretter re-suspendere i kalde HBSS eller DMEM/F12 på ønsket volum.
  10. Legg HMS celler med 1:2.5 forholdet mellom HMS / mesenchymalceller. 3 Dette vil være en mobil sammensetning 1E 5 UGSM celler med 4E 4 hESCs per 10 ml injeksjon (én rotte UGS vanligvis gir ca 2E 6 mesenchymalceller). Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter og så kaste supernatanten. Re-suspendere med 75% Matrigel (BD Biosciences,San Jose, CA, blandet med 25% kaldt HBSS for enklere håndtering) og plasser røret i isen for sub-renal kapsel injeksjon.

3. Transplantasjon av vev rekombinant Under Nedsatt Capsule

  1. Forbered en steril kirurgisk område.
  2. Anesthetize en mannlig atymiske naken mus med ketamin / xylazin ip, bruke en frisk blanding som inneholder en 01:01:08 ratio av ketamin: xylazin: saltvann. Doseringen vil være 100 mg / kg ketamin og 2,5 mg / kg xylazin. Dyr som ikke svarer til en tå-pinch bør være fullt etter for 20-30 min.
  3. Kirurgisk forberede musen ved å barbere det kirurgiske området (hvis du ikke bruker en naken mus), rensing med tre vekslende kluter av 70% alkohol etterfulgt av betadine løsning og bruke et kirurgisk drapere.
  4. Sett eye fuktighet salve (Altalube øyesalve) for øynene på musen for å hindre uttørking under anestesi.
  5. Under operasjonen, er pusterytme og kjernen kroppstemperatur av musene overvåkes. De respirasjonsmålinger should være stødig og opprettholdes innenfor 40-90 åndedrag / min. Kjernen kroppstemperatur overvåkes med observasjon av fargen på slimhinner og de rosa fotsålene.
  6. Lag en 1,0 cm lang langsgående snitt i huden på ryggen. Fortsetter å kutte bukveggen i en 0,5 cm langsgående snitt.
  7. Klem forsiktig på nyre ut av magen og holde nyrene overflaten fuktig ved hjelp av dråper sterilt saltvann.
  8. Forsiktig punktere nyre kapsel med en tom 27-gauge kanyle. En meget grunt punktering er tilstrekkelig. Dette vil være der du setter inn sløv nål til å injisere din mobil blanding.
  9. Fyll en 28-gauge stump kanyle med 10 mL av cellen blandingen. Sett den langsomt stikkstedet og trenge nyrene parenchyma å nå et område under nedsatt kapsel. Injiser 10 pl av den cellulære blandingen for å danne en bolus på nyrene under den renale kapselen. Uttak nålen.
  10. Returner nyrene til abdoterminalen hulrom. Fest muskulære laget av peritoneum med 4-0 nylon suturer.
  11. Lukk huden med enten sutur eller stift.
  12. Rengjør blod fra huden ved hjelp av sterilt saltvann.

4. Post-operative Smertelindring og overvåking

  1. Injiser dyret med buprenorfin (0,1 mg / kg hver 12. time) eller ketoprofen (3-5 mg / kg i fysiologisk saltvann hver 12 time) for å behandle postoperativ smerte, og 1 ml 37 ° C saltvann IP for å holde dyret varm og hindre dehydrering.
  2. Legge dyret i et rent bur og plassere den på en mild varmepute.
  3. Send dyrene tilbake til dyrerom når de gjenvinne bevissthet og beveger buret.
  4. Observere dyret daglig for uventede tegn på sykdom og smitte for følgende tre dager. Musene overvåkes med observasjon av aktiviteter i bur inkludert aksesserer mat og vann en dag postoperativt. Dersom musene vise færre aktiviteter, er Ketoprofen intraperitonealt annonsebetjente igjen en gang om dagen.
  5. Fjern skinnet stifter eller sting to uker etter operasjonen.
  6. Xenograft vev kan høstes så tidlig som 8 uker etter operasjonen. Xenografts kan avbildes in vivo ved hjelp av små ultralyd-dyr (figur 2A), og faste vev kan være seksjonert og farget for forskjellige proteiner ved hjelp av immunhistokjemi (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bygge på den spennende rapport fra Taylor, et al., Har vår lab utviklet en pode protokollen med brukte H1 (WA01 NIH-utpekte, genetisk mannlige) humane embryonale stamceller linje. 1 Denne linjen har blitt grundig testet for kvalitetskontroll og er karyotypically normal 13 Når dyrket riktig, kan HMS-celler bli opprettholdt, utvidet og cryopreserved i en udifferensiert og pluripotente tilstand ved hjelp av en mater-fri kultur metode (mater-frie systemer kommersielt tilgjengelige via Stem Cell Technologies, Vancouver BC).. 14. Vår protokoll sysselsetter encellede suspensjoner av hESCs kombinert med encellede suspensjoner av E18 rotte UGSM og injiseres under nedsatt kapsel av voksne mannlige immunsupprimerte mus. Som viktige kontroller, implantert USGM alene gir ingen merkbar vekst, mens hESCs implantert uten UGSM danner store teratomas (figur 2B). 15. I vår erfaring, implantatasjon av UGSM uten forurensende rotte epitelceller aldri resulterer i vev vekst, mens rekombinasjon av UGSM pluss hESCs resulterer i sterk vekst over 80% av tiden (etter 8 uker størrelsene varierer fra 1 mm til 5 mm, med over 80% av vevet inneholder kjertel epitel). I rekombinantar inneholder både hESCs og UGSM, er tidlig kjertel dannelse observert etter fire uker, og etter åtte uker fullt dannet, er prostata spesifikt antigen (PSA)-positive menneskelige prostata epitel dannet (figur 3). Disse kjertlene inneholder androgen Receptor (AR)-positive luminal-sekresjonscellene som ikke finnes én uke etter vert kastrering. Viktigere, disse kjertlene er positivt for human-spesifikke og prostata-spesifikt protein PSA. Ytterligere fargingsegenskaper dokumenter at slike human kjertler synes å være ikke-ondartet siden de ikke uttrykke alfa-methylacyl-CoA-racemase (AMACR), som er en prostatakreft-spesifikk markør. 16.

ether.within-page = "always"> Figur 1
Figur 1. Isolering av Urogenitale Sinus fra en E18.5 Rat Embryo. A. E18.5 rotte embryo. Den hvite heltrukne linjen angir posisjonen til halvere embryo. B. E18.5 hannrotter embryo. De sorte stiplede linjene indikerer blæren, urogenitale sinus, endetarm, og utviklingsland testiklene. C. E18.5 hunnrotte embryo. De sorte brutte linjer viser blæren, urogenitale sinus-og livmor. D. blæren og urogenitale sinus fjernet fra E18.5 rotte embryo. Den mens heltrukne linjen indikerer posisjonen for å fjerne blæren. Den svarte stiplede linjen og hvit pil indikerer epiteliale tube. Den hvite pilen hodet indikerer urogenitale sinus mesenchyme.

7/50327fig2.jpg "alt =" Figur 2 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Ultralyd og brutto morfologi in vivo vev xenografts avledet fra UGSM og hESCs. A. Ultralyd avbildning av voksende xenografter tillate levende animalske analyser i løpet av eksperimentet. Bildet ble tatt åtte uker etter operasjonen ved hjelp av en Vevo 2100 små dyr ultralyd (Visualsonics, Toronto, ON). . Sirklet området representerer den voksende vev xenograft på nyrene overflaten B. På den eksperimentelle endepunktet, HMS celler kombinert med rotte UGSM (rUGSM) danner en synlig vev masse på nyrene overflaten (venstre panel), HMS celler implantert alene danne store teratomas som forventet (midtre panelet), og UGSM implantert alene ikke klarer å danne noen merkbar struktur (høyre panel).

. Jpg "alt =" Figur 3 "fo: content-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Dannelse av human prostata epitel fra Human embryonale stamceller linje WA01 (H1). ES-celler ble saman med gnager UGSM og implantert under nedsatt kapsel av intakte mannlige nakne mus. Etter en vekst periode på åtte uker, er menneskelig prostata kjertel epitel dannet som dokumentert av AR, p63, og human-restricted PSA farging. En uke etter vert kastrering, er AR-positive, PSA-positive luminal lag ikke er tilstede, dokumentere karakteristisk androgen-avhengighet. Prostata vev er ikke-ondartet som demonstrert av en mangel på AMACR farging. I tillegg var Chra-positive nevroendokrine celler oppdages. Ikke-ondartet humant prostatavev ble anvendt som en kontroll for AR, PSA, og p63, et prostata svulst ble brukt som en positiv kontroll for cancer-spesifikk AMACR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tissue rekombinasjon hjelp UGSM er en utrolig nyttig teknikk for å undersøke utviklingen av prostata og de molekylære hendelser som fører til prostatakreft innvielse. Den induktive potensialet i UGSM har vært brukt i en rekke applikasjoner i prostata forskning, og disse inkluderer styrke svulst ta av prostata cellelinjer og svulster, studerer stromal-epitel interaksjoner, og danner kryss-arter prostata rekombinantar 7,17-20 Riktig forberedelse av UGSM. , er imidlertid avgjørende for eksperimentell suksess som kontaminerende gnager epitel vil resultere i kjertel-dannelse og kan forvirre resultater. Således, er separasjonen av UGSM fra UGSE (trinn 2.4) langt den mest kritiske, og også mest vanskelige trinn i protokollen. For å kontrollere for slik forurensning, er bruk av teknikker for å skjelne mellom arter sterkt oppmuntret, samt en ekstra eksperimentelle armen ved hjelp UGSM alene for å dokumentere ingen kjertel dannelse fra mobilnettetr forurensninger. 12

Den siste utviklingen av mater-frie HMS dyrking reagenser og metoder tillate rene bestander HMS celler til å være kultivert, utvidet og cryopreserved. 14. Videre gir den utvidede bruken av lentiviral genet levering stallen genomisk innlemmelse og uttrykket av gener av interesse. 21,22 Disse kombinerte fremskritt tillate for genetisk manipulasjon av rene kulturer HES og, når kombinert med den induktive potensialet av prostatisk embryonale UGSM, vil tillate in vivo-produksjon av humane prostatiske kjertler som uttrykker spesifikke gener av interesse. Videre vil denne teknikken være mottakelig for indusert-pluripotente stamceller linjer (iPSCs) avledet fra voksne vertene og fra genmodifiserte celler. 23,24 Bruke definerte proteiner, viser vi at en slik hESC-avledet menneskelig prostata epitel vises veldig lik voksen human prostata epitel, men på en global molekylært nivå er sikker på å værenoen forskjeller i genuttrykk som bør tas i betraktning. For å veie opp for dette, bør etterforskerne bruke en utvidet prøve størrelse og vurdere laser-fangst mikrodisseksjon (LCM)-baserte tilnærminger og komparative genuttrykk analyser plattformer for å validere de molekylære profiler av sine vev sammenlignet med voksne menneskelig vev. Likevel har dannelsen av menneskelig prostata kjertel epitel ved hjelp av et serielt-kultivert og mater-fri stamceller linje potensial til å forenkle mange molekylære studier knyttet til prostata funksjon og kreft initiering.

Vår teknikken benytter encellede suspensjoner av både UGSM og hESCs, som muliggjør bruk av lentiviral infeksjon og flyt sortering tilnærminger, samt mer nøyaktig kontroll over mobilnettet mengder. Dette kan imidlertid minske den induktive potensialet av UGSM. En alternativ tilnærming har vært å bruke ikke-dissosiert UGSM (etter trinn 2,5), før collagenase fordøyelsen)og enten direkte inkubasjon med ES-celler, eller embedding celler innenfor en kollagen løsning. 4 Hvis du vil implantere disse vev under nedsatt kapsel, ville en alternativ teknikk være å lage et snitt i nyre kapsel, lage en liten lomme under nedsatt kapsel på toppen i nyre, og fysisk plassere cellemasse innenfor denne lomme. 4,20

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt med arbeidet som presenteres.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke våre ved University of Chicago Seksjon for urologi ledet av Dr. Arieh Shalhav, og direktør for urologiske Forskning Dr. Carrie Rinker-Schaeffer. Vi ønsker også å takke våre ved University of Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) ledet av Dr. Michelle Le Beau. Vi har også med å takke ekspert teknisk assistanse av Human Tissue Resource Center kjerne anlegget ledet av Dr. Mark Lingen, og ved hjelp av Leslie Martin og Mary Jo Fekete. Vi takker også den Immunohistochemistry Kjerne Facility drevet av Terri Li. Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Chicago Kirurgisk avdeling, Seksjon for urologi, en American Cancer Society Institutional Forskning Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004), en Cancer Center Support Grant (P30 CA14599), The Brinson Foundation, den Alvin Baum Family Fund, The University of Chicago Cancer Research Foundation Kvinner styre; S. Kregel er støttet av en HHMI: Med-inn-Grad Fellowship (56006772) og en Cancer Biology Training Grant (T32-CA09594). Til slutt vil vi takke Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan, og Nathan Stadick for deres kritisk vurdering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO 14170
DMEM/F12 GIBCO 11330
R1881 Sigma 965-93-5 Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)
NEAA GIBCO 11140
Pen-Strep Solution GIBCO 15070 100x stock
Matrigel BD Biosciences 354230
KETASET (ketamine hydrochloride) Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
AnaSed (xylazine) VET-A-MIX, Inc. NADA 139-236 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
Trypsin BD Biosciences 215240
Collagenase Sigma C2014
Ketoprofen Fort Dodge NDC 0856-4396-01 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline
Altalube eye ointment Altaire Pharmaceuticals, Inc. NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Stereomicroscope Leica Any good dissecting scope can be used.
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15001-08
Syringe Hamilton 84855
Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) Hamilton 7803-02 Custom Needle
Ethanol Prep Pads Fisher Scientific 06-669-62
Sterile Gauze Pads Fisher Scientific 22-415-469
Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) MedVet International J392H Needle-in, dissolvable suture
Autoclip 9 mm Wound Clips Becton Dickenson 427631
PVP Iodine Prep Pads Fisher Scientific 06-669-98
Dissector scissor with blunt end Fine Science Tools 14072-10
Dumont fine tip forceps Fine Science Tools 11252-50
Needle holder with Scissor Fine Science Tools 12002-14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
  2. Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
  3. Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
  4. Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
  5. Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
  6. Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
  7. Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
  8. Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
  9. Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
  10. Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
  11. Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
  12. Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
  13. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  14. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
  15. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
  16. Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
  17. Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
  18. Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
  19. Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
  20. Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).
  21. Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
  22. Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
  23. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  24. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).

Tags

Stem Cell Biology medisin Biomedical Engineering bioteknologi Cancer biologi molekylærbiologi cellebiologi anatomi fysiologi kirurgi embryonale stamceller ESCs Disease Models Animal celledifferensiering urogenitale system prostata Urogenitale Sinus mesenchyme stamceller dyremodell
Dannelse av human prostata Epitel hjelp Tissue rekombinasjon av gnager Urogenitale Sinus mesenchyme og menneskelige stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cai, Y., Kregel, S., Vander Griend,… More

Cai, Y., Kregel, S., Vander Griend, D. J. Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50327, doi:10.3791/50327 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter