Summary
Um zu entwirren die frühesten molekularen Mechanismen Prostatakrebs Initiation, neuartige und innovative menschlich Systeme und Ansätze dringend benötigt werden. Das Potenzial der pre-Prostata Urogenitalsinus Mesenchym (UGSM) an pluripotenten Stammzellen Zellpopulationen induzieren die menschliche Prostata-Epithel zu bilden ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Prostata experimentellen Forschung.
Abstract
Die Fortschritte bei der Prostatakrebs-Forschung ist stark durch die Verfügbarkeit von Menschen stammenden und Hormon-naiven Modell-Systeme, die unsere Fähigkeit zur genetischen und molekularen Ursachen Prostata-Erkrankungen Einleitung verstehen begrenzen begrenzt. Gegen die Entwicklung besserer Modellsysteme für das Studium der menschlichen Prostata-Krebsentstehung, haben wir und andere Vorteile der einzigartigen Pro-Prostata-induktiven Potenzial von embryonalen Nagetier Prostata Stroma genommen, genannt Sinus urogenitalis Mesenchym (UGSM). Wenn bestimmte pluripotenten Zellpopulationen wie embryonalen Stammzellen rekombiniert induziert UGSM die Bildung von normalen menschlichen Prostata-Epithelzellen in einem Testosteron-abhängigen Weise. Solch ein Modell menschlichen System kann verwendet werden, um zu untersuchen und experimentell testen die Fähigkeit der Bewerber Prostatakrebs Suszeptibilitätsgene in beschleunigtem Tempo im Vergleich zu typischen Nagetier transgenen Studien werden. Seit Menschliche embryonale Stammzellen (hES) können in Kultur genetisch modifiziert werden using induzierbare Genexpression oder siRNA knock-down-Vektoren vor Gewebe Rekombination erleichtert ein solches Modell Testen der funktionalen Folgen der Gene oder Kombinationen von Genen, die vermutlich fördern oder Vorbeugung einer Karzinogenese verwendet werden.
Die Technik der Gewinnung von reinem Populationen UGSM Zellen, jedoch ist eine Herausforderung und Lernen erfordert oft jemand mit früheren Know-how, um persönlich zu unterrichten. Darüber hinaus kann der Impfung Zellgemischen unter der Nierenkapsel eines immungeschwächten Gastgeber technisch anspruchsvoll. Hier beschreiben wir veranschaulichen und ordnungsgemäße Isolierung UGSM von Nagetier Embryonen und Nierenkapsel Implantation von Gewebe Mischungen menschlichen Prostata-Epithel zu bilden. Ein solches Vorgehen, bei ihrer aktuellen Phase, erfordert in vivo xenografting von embryonalen Stammzellen; zukünftige Anwendungen könnten in vitro Drüse Bildung oder die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzell-Populationen (iPS) umfassen.
Introduction
Es gibt einen enormen Bedarf für eine bessere menschliche Modellsysteme von Prostatakrebs. Insbesondere wäre relevanten menschlichen Modellsysteme von normalen, gutartigen Prostata-Gewebe, die genetisch manipuliert werden, um direkt zu erkennen, die Rolle von spezifischen Genen in der Einleitung von Prostatakrebs kann unglaublich informativ. Das Aufkommen der genomischen Ära hat zahlreiche Gene, die eine Rolle bei der Entstehung von Krebs haben können, identifiziert. Ein Mangel an experimentellen menschlichen Modellsystemen jedoch stark beeinträchtigt unsere Fähigkeit, funktionell zu testen und zu charakterisieren Kandidat Prostatakrebs Suszeptibilitätsgene. Ein ideales Modellsystem wäre die rasche und schnelle funktionelle Analysen von Krebs Suszeptibilitätsgene in Kombination mit geeigneten transgenen Tiermodell zu erleichtern. Darüber hinaus würde eine solche menschlichen Modell zu ermöglichen molekulare Charakterisierung der Mechanismen der Signalisierung Prostatakarzinogenese zur Entdeckung und Validierung von neuartigen Therapien zurProstatakrebs verhindern Bildung.
Menschliche embryonale Stammzellen (HES) bilden können menschliche Prostata-Gewebe als Xenotransplantate. 2006 Taylor, et al. Berichtet, dass HES induziert werden, um Prostata-Epithelzellen in vivo zu bilden, wenn mit Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym (UGSM) innerhalb eines Zeitraums von 8-12 Wochen wieder kombiniert werden. 1 Diese Studien wurden liegen vorangehende basierend das Cunha Labor zeigen, dass die Nager embryonalen UGSM fördern können Prostatahyperplasie Differenzierung von Stammzellen und embryonalen epithelialen Zellpopulationen in vivo. 2,3 Die Prostata entwickelt sich aus einer embryonalen anlagen bezeichnet die Sinus urogenitalis (UGS), und vor dem embryonalen Tag 17 (Maus E17 ; Tag E18 in der Ratte) die UGS kann entfernt werden und physisch aufgeteilt in Epithel (UGSE) und Mesenchym (UGSM) 4 Dieses Gewebe Rekombination Ansatz hat wesentlich unser Verständnis der Entwicklung und Prostata-Krebsentstehung, insbesondere verbessert.ly Wachstumsfaktor und hormonelle Signalwege und die molekularen Verhältnisse zwischen Prostata Stroma und Epithel. 5-8 Dieses Verfahren umfasst die ex vivo Kombination UGSM mit Stammzellen oder epithelialen Zellen aus den gleichen oder unterschiedlichen Arten und diese zellulären / Gewebe Rekombinanten implantiert gewachsen und Xenotransplantate innerhalb Mäusewirt. 4,9 Nach einer in vivo Wachstum enthält das Implantat Prostataepithelzellen Drüsenstrukturen in stromalen Gewebe eingebettet. Weitere Färbung durchgeführt werden, um festzustellen, ob solche Strukturen wirklich Prostata und des menschlichen Ursprungs sind. 10,11
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Protocol
Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of Chicago Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC, Protokoll-Nummern 72066 und 72231) zugelassen. Jede Operation wurde unter Vollnarkose durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, nicht so lange leiden. Die menschlichen embryonalen Stammzellen Linie WA01 (H1; NIH-registration # 0043) wurde von WiCell (Madison, WI) und kultivierten erworben über den Einzug-unabhängiges Protokoll mit mTeSR1 Medien (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). ES-Zellen wurden innerhalb von zehn Durchgängen Auftauen verwendet.
1. Isolation des Sinus urogenitalis aus Maus oder Ratte Embryonen
- Euthanize eine Zeitfahr-schwangeren Maus (Tag 17,5) oder Ratte (Tag 18,5) durch die Inhalation von CO 2 für 5 min. Der Tod wird durch die Einstellung der Vitalfunktionen in der Ratte bestätigt. Dann brechen den Hals menschlich. Die rbei an dieser Stelle eingeschläfert. Sprühen Sie 70% Ethanol, um die Bauchhaut und Flanken zu sterilisieren. Schneiden Sie die Bauchhaut und Muskelschichten und dann schneiden die Gebärmutter, trennen Sie die Ratte Embryonen aus der Fruchtblase, und schnitt die Nabelschnur. Übertragen Sie die Embryonen in einem 50 ml Falcon Röhrchen mit eiskaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) und halten auf dem Eis. Föten werden durch Enthauptung mit chirurgischer Schere eingeschläfert.
- Setzen Sie den Embryo in 100 mm Petrischale. Halbieren des Embryos mit einer Schere in der Höhe des Nabels (1A). Entfernen Sie den Magen und Dünndarm. Reveal die Eierstöcke in den weiblichen Embryo und Hoden in der männlichen Embryo (Abbildung 1B und 1C). (Die Eierstöcke sind am kaudalen Pole der Nieren. Die Hoden sind etwa in Höhe der Blase). In diesem Entwicklungsstadium, isoliert UGSM sowohl von männlichen und weiblichen Embryonen zu induzieren vermag eine Prostataepithelzellen Linie in Gegenwart von Host sindTestosteron. 4 Nach diesem Entwicklungsstadium Zeitpunkt beginnt jedoch Prostatahyperplasie Knospen bilden in den UGSM und Isolierung von reinem UGSM ist sehr herausfordernd. 4
- Unter dem Dissektionsmikroskop, schneiden die Bauchdecke in der mittleren Zeile mit Vannas Schere, um die Blase und hinteren Bauchwand freizulegen. Free the oberen Genitaltrakt von Anhängen (bei männlichen Embryonen, schneiden Sie den Harnleiter, Urnierengang und Müller-Gang; in weiblichen Embryonen, schneiden Sie den Harnleiter und Müller-Gang). Befreie die Blase aus der Nabelschnur. Cut Schambein und unverblümt getrennt von der vorderen Wand des Sinus urogenitalis mit Dumont feine Spitze Pinzette. Schließlich trennt die hintere Wand des Urogenital-Sinus aus dem Rektum. Schneiden Sie den Sinus urogenitalis mit der Blase am unteren Ende (aus der Harnröhre) und speichern Sie die Sinus urogenitalis en bloc (mit der Blase) in eiskaltem HBSS.
2. Trennung des Sinus urogenitalis Mesenchym
- Übertragen Sie die Sinus urogenitalis einem Falcon-Röhrchen mit 1% Trypsin in Calcium (Ca 2 +) und Magnesium (Mg 2 +) kostenlos HBSS. Das Röhrchen wird in einem Kühlschrank bei 4 ° C für 75 min.
- Entfernen Sie die Trypsin und Trypsin neutralisiert mit 10% fötalem Bovin Serum (FBS) in DMEM/F12 Medium.
- Sorgfältig necken die klebrige mesenchymalen Hülse von der epithelialen Rohr mit einer Nadel oder Dumont feine Spitze Pinzette (Aufrechterhaltung der epithelialen Röhre intakt verringert die Chancen der Epithelzellen Kontamination des Mesenchym, dies kann in Nagetier Drüsen führen bilden zusammen mit Ihrem Stammzellen abgeleiteten menschlichen Drüsenepithel) (1D). 12
- Übertragen UGSM in ein neues Falcon-Röhrchen mit DMEM/F12-Medium + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep, 0,5 mg / ml) + 1% Non-Essential Amino Acids (NEAA) zzgl. 1 nM R1881. Place das Rohr in einem Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht.
- Zentrifuge das Gewebe bei 200 xg und den Überstand verwerfen. Waschen mit Phosphatpuffer Saline (PBS) (nicht stören das Gewebe Pellet).
- In 0,2% Kollagenase (in DMEM/F12) zu resuspendieren des Gewebes. Inkubation in 37 ° C unter leichtem Schütteln für 1 Stunde.
- Energisch Wirbel die Verdauung Gewebe dreimal, bis es homogen einzellige Mischung wird und fügen DMEM/F12-Medium + 10% FBS + 1% P / S + 1% + 1 nM R1881 NEAA die Kollagenase neutralisieren.
- Zentrifuge bei 200 xg und dann waschen durch erneute Aussetzung der UGSM Zellen in HBSS, und wiederholen dreimal vollständig waschen UGSM. Schließlich auszusetzen mesenchymalen Zellen in DMEM/F12 und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder Zellzählung Gerät.
- Dissociate hES-Zellen kultiviert mit Feeder-freies Protokoll mit mTeSR1 Medien (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) unter Verwendung eines Accutase Verdauung (Millipore; Billerica, MA). Waschen Sie die hES-Zellenwährend der log-Phase ihres Wachstums in warmen DMEM/F12-Medium, dann fügen warmen 1x Accutase Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 15-20 min, bis einzelne Zellen gleichmäßig losgelöst von Kolonien sind. In die gleiche Menge definiert 1x Trypsin Inhibitor (Invitrogen; Grand Island, NY), um die Accutase neutralisieren und sanft Pipette auf und ab zu mischen und brechen Zellklumpen. Pipette Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellpellet in DMEM/F12-Medium. Reaktionsgefäßständer für 3 min bei 200 xg erneut und entfernen Sie den Überstand, dann in kaltem HBSS oder DMEM/F12 resuspendieren auf gewünschte Lautstärke.
- In hES-Zellen mit 1:2,5 Verhältnis von hES / mesenchymalen Zellen. 3 Dies wird eine zelluläre Zusammensetzung von 1E 5 UGSM Zellen mit 4E 4 hESCs pro 10 ml Injektionslösung (eine einzelne Ratte UGS Regel ergibt etwa 2E 6 mesenchymalen Zellen) sein. Zentrifuge bei 200 xg für 5 min und dann den Überstand verwerfen. Mit 75% Matrigel (BD Biosciences Re-suspend,San Jose, CA; mit 25% kaltem HBSS für eine einfachere Handhabung) und legen Sie den Schlauch in Eis für Sub-Nierenkapsel Injektion.
3. Transplantation von Gewebe Rekombinante Unterhalb der Nierenkapsel
- Bereiten Sie eine sterile OP-Bereich.
- Anesthetize einen männlichen athymischer Maus mit Ketamin / Xylazin ip; verwenden eine frische Mischung mit einem Verhältnis von 01.01.08 Ketamin: Xylazin: Kochsalzlösung. Dosierung beträgt 100 mg / kg Ketamin und 2,5 mg / kg Xylazin sein. Tiere reagieren nicht auf einer Zehe-Prise sollte vollständig unter 20-30 min.
- Chirurgisch bereiten die Maus durch Rasieren das OP-Gebiet (wenn nicht mit einem nackten Maus), Reinigung mit drei abwechselnden Tücher von 70% Alkohol, gefolgt von betadine Lösung und Anlegen eines Operationstuch.
- Setzen Auge Feuchtigkeit Salbe (Altalube Augensalbe) an den Augen der Maus Austrocknen zu verhindern während der Narkose.
- Während der Operation werden Atemfrequenz und Körpertemperatur der Mäuse beobachtet. Die Atemfrequenz shoULD stabil sein und gewartet werden innerhalb 40-90 Atemzüge / min. Die Körperkerntemperatur wird mit Beobachtung der Farbe der Schleimhäute und der rosa Fußsohlen überwacht.
- Machen Sie einen 1,0 cm langen Hautschnitt längs auf der Rückseite. Fahren Sie mit der Bauchdecke in einer 0,5 cm Längsschnitt geschnitten.
- Drücken Sie vorsichtig die Niere aus dem Bauch und halten die Niere Oberfläche feucht mit Tropfen steriler Kochsalzlösung.
- Sanft Punktion der Nierenkapsel mit einem leeren 27-Gauge-Injektionsnadel. Eine sehr flache Punktion genügt. Diese werden, wo Sie Ihre stumpfen Nadel einsetzen, um Ihren zellularen Mischung injizieren.
- Füllen Sie eine 28-Gauge-Nadel stumpf Spritze mit 10 ul Ihr Handy Mischung. Langsam legen Sie die Einstichstelle und dringen in die Nierenparenchyms um einen Bereich unterhalb der Nierenkapsel zu erreichen. Anschließend werden 10 ul der zellulären Mischung, um einen Bolus auf die Niere unter der Nierenkapsel zu bilden. Zurücknahme der Nadel.
- Bringen Sie die Niere zur abdominal Hohlraum. Sichern Sie die Muskelschicht des Bauchfells mit 4-0 Nylonnaht.
- Schließen Sie die Haut mit jeder Naht oder Grundnahrungsmittel.
- Reinigen Sie das Blut aus der Haut mit steriler Kochsalzlösung.
4. Postoperative Analgesie und Überwachung
- Injizieren Sie das Tier mit Buprenorphin (0,1 mg / kg alle 12 h) oder Ketoprofen (3-5 mg / kg in Kochsalzlösung alle 12 h), um postoperative Schmerzen, und 1 ml 37 ° C zu halten Kochsalzlösung ip das Tier warmen verwalten und Austrocknung zu verhindern.
- Setzen Sie das Tier in einem Käfig sauber und legen Sie sie an einem milden Heizkissen.
- Senden Sie die Tiere zurück zu Tierraum sobald sie das Bewusstsein wieder zu erlangen und sind innerhalb des Käfigs zu bewegen.
- Beachten Sie das Tier täglich für unerwartete Anzeichen von Krankheiten und Infektionen für die folgenden drei Tage. Die Mäuse werden mit der Beobachtung von Aktivitäten in Käfigen einschließlich Zugriff auf Nahrung und Wasser 1 Tag postoperativ überwacht. Wenn die Mäuse weniger Aktivitäten anzuzeigen, ist Ketoprofen intraperitoneal adwieder einmal ein Tag diente.
- Entfernen Sie die Haut Klammern oder Nähte 2 Wochen nach der Operation.
- Xenograft Gewebe können bereits nach 8 Wochen nach der Operation entnommen werden. Xenografts können in vivo abgebildet werden mit Kleintier-Ultraschall (2A) und fixierten Geweben kann geschnitten und gefärbt für verschiedene Proteine mittels Immunhistochemie (Abbildung 3).
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Representative Results
Aufbauend auf den spannenden Bericht von Taylor et al. Hat unser Labor eine engrafting Protokoll über die gängigen H1 (NIH-designated WA01, genetisch männlich) mit menschlichen embryonalen Stammzellen Linie. 1 Diese Linie wurde konsequent für die Qualitätskontrolle getestet und entwickelt ist karyotypisch normalen 13 Wenn kultiviert angemessen, hES-Zellen aufrechterhalten, ausgebaut und kryokonserviert in einem undifferenzierten und pluripotenten Zustand mit einem Feeder-freie Kultur-Methode (Feeder-freie Systeme kommerziell erhältlich über Stem Cell Technologies, Vancouver BC).. Unsere 14 Protokoll beschäftigt Einzelzellsuspensionen von HES mit einzelnen Zellsuspensionen von E18 Ratte UGSM kombiniert und injiziert unter der Nierenkapsel von erwachsenen männlichen immungeschwächten Mäusen. Als wichtige Bedienelemente, implantiert USGM allein ergibt keinen erkennbaren Wachstum, während hESCs ohne UGSM bilden große Teratome (2B) implantiert. 15 Nach unserer Erfahrung Implantatation von UGSM ohne Kontamination Ratte Epithelzellen nie Ergebnisse im Gewebe Wachstum, während Rekombination UGSM zzgl. hESCs Ergebnisse in ein robustes Wachstum über 80% der Zeit (nach 8 Wochen Größen reichen von 1 mm bis 5 mm, mit mehr als 80% des Gewebes enthält Drüsenepithel). In Rekombinanten, die sowohl hESCs und UGSM wird früh Drüsenbildung nach 4 Wochen beobachtet, und nach 8 Wochen voll ausgebildet, Prostata-spezifischen Antigens (PSA)-positiven menschlichen Prostata-Epithel gebildet wird (Abbildung 3). Diese Drüsen enthalten Androgen-Rezeptor (AR)-positive-luminale sekretorische Zellen, die nicht vorhanden sind, eine Woche nach Host Kastration. Wichtig ist, dass diese Drüsen positiv für die human-spezifischen und Prostata-spezifisches Protein PSA. Weitere Dokumente, die Färbung wie menschliche Drüsen als nicht-maligne, da sie nicht exprimieren Alpha-methylacyl-CoA-Racemase (AMACR), die eine Prostatakrebs-spezifische Marker angezeigt. 16
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Abbildung 1. Isolation des Sinus urogenitalis von einer Ratte E18.5 Embryo. A. E18.5 Rattenembryo. Der weiße durchgezogene Linie zeigt die Position, um den Embryo halbieren. B. E18.5 männlichen Ratten Embryo. Die schwarzen gestrichelten Linien zeigen die Blase, Sinus urogenitalis, Rektum und Entwicklung Hoden. C. E18.5 weiblichen Ratte Embryo. Die schwarzen gestrichelten Linien zeigen die Blase, Sinus urogenitalis und Gebärmutter. D. Die Blase und Urogenitalsinus vom E18.5 Rattenembryo entfernt. Die während durchgezogene Linie zeigt die Position, um die Blase zu entfernen. Die schwarz gestrichelte Linie und weißer Pfeil zeigen die Epithelzellen Rohr. Der weiße Pfeil zeigt den Kopf Urogenitalsinus Mesenchym.
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Abbildung 2. Ultraschall-Bildgebung und grobe Morphologie in vivo Gewebe Xenotransplantate von UGSM und hESCs abgeleitet. A. Ultraschall-Bildgebung der wachsenden Xenotransplantate ermöglichen Live-Tier-Analysen im Verlauf des Experiments. Das Bild wurde 8 Wochen nach der Operation wurden mit einer Vevo 2100 Kleintier-Ultraschall (Visualsonics; Toronto, ON). . Eingekreiste Bereich stellt die wachsende Gewebe Xenograft auf die Niere Oberfläche B. Bei der experimentellen Endpunkt bilden hES-Zellen mit Ratten UGSM (rUGSM) kombiniert eine sichtbare Körpermasse auf die Niere Oberfläche (links); hES-Zellen implantiert allein bilden große Teratome als erwartet (Mitte), und UGSM implantiert allein nicht, um jede erkennbare Struktur (rechts) bilden.
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Abbildung 3. Formation of Human Prostate Epithel aus der humanen embryonalen Stammzellen Linie WA01 (H1). ES-Zellen wurden mit Nagetier UGSM rekombiniert und implantiert unter der Nierenkapsel von intakten männlichen Nacktmäusen. Nach einem Wachstum von 8 Wochen, ist die menschliche Prostata Drüsenepithel gebildet, wie durch AR, p63 und menschliche eingeschränkten PSA Färbung dokumentiert. Eine Woche nach Host Kastration ist die AR-positiv, PSA-positive luminalen Schicht nicht vorhanden ist, dokumentieren charakteristische Androgen-Abhängigkeit. Prostata Gewebe nicht-maligne, wie durch einen Mangel an AMACR Färbung nachgewiesen. Darüber hinaus waren Chra-positiven neuroendokrinen Zellen nachweisbar. Nicht-malignen menschlichen Prostata-Gewebe wurde als Kontrolle für AR, PSA, und p63 verwendet, ein Prostata-Tumor wurde als positive Kontrolle für die Krebs-spezifische AMACR verwendet.
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Discussion
Tissue Rekombination unter Verwendung UGSM ist eine unglaublich nützliche Technik, um die Entwicklung der Prostata und die molekularen Ereignisse, die zu Prostatakrebs Einleitung zu untersuchen. Der induktive Potential UGSM hat für zahlreiche Anwendungen in der Forschung Prostata eingesetzt, dazu gehören die Verbesserung Tumor der Prostata-Zelllinien und Tumoren nehmen, Studium Stroma-Epithel-Wechselwirkungen und bilden cross-species Prostata Rekombinanten 7,17-20 richtige Vorbereitung von UGSM. jedoch ist entscheidend für experimentelle Erfolg als Verunreinigung Nagetier Epithel wird in Drüsen-Bildung führen und kann Ergebnisse zu verwechseln. Somit ist die Trennung des UGSM vom UGSE (Schritt 2.4) bei weitem die wichtigste und heikelste Schritt auch in dem Protokoll. Um eine solche Verschmutzung zu steuern, ist die Verwendung von Techniken, um zwischen den Arten unterscheiden stark gefördert, sowie eine zusätzliche experimentellen Arm mit UGSM allein keine Drüsenbildung von cellula dokumentierenr Verunreinigungen. 12
Die jüngste Entwicklung der Feeder-freie Kultivierung hES Reagenzien und Methoden ermöglichen reine Populationen hES-Zellen kultiviert werden, erweiterte und kryokonservierten. 14 Darüber hinaus ist die erweiterte Nutzung von lentiviralen Gentransfer die stabile genomische Einarbeitung und Expression von Genen von Interesse ermöglicht. 21,22 Diese kombinierten Fortschritte ermöglichen zur genetischen Manipulation von reinem HES-Kulturen und, wenn mit dem induktiven Potential Prostatahyperplasie embryonalen UGSM kombiniert, wird die in vivo Erzeugung von menschlichen Prostata-Drüsen Expression spezifischer Gene von Interesse zu ermöglichen. Darüber hinaus würde diese Technik zugänglich sein induzierten pluripotenten Stammzellen-Zelllinien (iPS) aus adulten Hosts und von gentechnisch veränderten Zellen. 23,24 Anhand definierter Proteine zeigen wir, dass solche hES-abgeleiteten menschlichen Prostata-Epithel erscheinen sehr ähnlich Erwachsenen menschlichen Prostata-Epithel, sondern auf globaler molekularer Ebene gibt es sicher zu seineinige Unterschiede in der Genexpression, die berücksichtigt werden sollten. Um dies zu berücksichtigen, sollten die Ermittler verwenden eine erweiterte Stichprobe und überlegen, Laser-Mikrodissektion (LCM)-basierte Ansätze und vergleichende Genexpressionsanalysen Plattformen, um die molekularen Profile ihrer Gewebe im Vergleich zu erwachsenen menschlichen Geweben zu validieren. Dennoch hat die Bildung der menschlichen Prostata Drüsenepithel mit einem seriell-kultivierten und Feeder-freie Stammzellen Linie das Potenzial, zahlreiche molekulare Untersuchungen in Bezug auf Funktion der Prostata und Krebs Einleitung zu erleichtern.
Unsere Technik nutzt Einzelzellsuspensionen sowohl UGSM und hESCs, die die Verwendung von lentiviralen Infektion und Durchfluss ermöglicht Sortierung Ansätze sowie eine genauere Steuerung der zellulären Mengen. Dies kann jedoch verringert die induktive Potential UGSM. Ein alternativer Ansatz ist, um nichtdissoziierten UGSM (nach Schritt 2.5), bevor Kollagenaseverdau verwenden)und entweder direkt Inkubation mit ES-Zellen, oder Einbettung Zellen innerhalb eines Kollagen-Lösung. 4 Um diese Gewebe unter der Nierenkapsel implantieren, eine alternative Technik wäre, um einen Einschnitt in der Nierenkapsel machen, erstellen eine kleine Tasche unter der Nierenkapsel oben der Niere und physisch Küvette Masse innerhalb dieser Tasche. 4,20
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt mit der Arbeit vorgestellt.
Acknowledgments
Wir wollen die Unterstützung der Universität von Chicago Abschnitt der Urologie von Dr. Arieh Shalhav führte, und der Direktor der Urologischen Forschung Dr. Carrie Rinker-Schaeffer anzuerkennen. Wir würden auch gerne die Unterstützung der Universität von Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) von Dr. Michelle Le Beau führte zu bestätigen. Wir arbeiten auch mit den Experten der technischen Hilfe des Human Tissue Resource Center Core Facility Dr. Mark Lingen führte, und der Unterstützung von Leslie Martin und Mary Jo Fekete danken. Wir danken auch der Core Facility Immunhistochemie von Terri Li laufen. Diese Arbeit wurde von der University of Chicago Department of Surgery, die Abteilung für Urologie finanziert, ein American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004), ein Krebs-Center Support Grant (P30 CA14599); Der Brinson Foundation, die Alvin Baum Family Fund; The University of Chicago Cancer Research Foundation Frauen Platine; S. Kregel wird von einem HHMI unterstützt: Med-in-Grad Fellowship (56006772) und ein Krebs-Biologie Ausbildung Grant (T32-CA09594). Schließlich möchten wir Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan und Nathan Stadick für ihre kritische Beurteilung des Manuskripts danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
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