Summary
Te ontrafelen de vroegste moleculaire mechanismen prostaatkanker initiatie, nieuw en innovatief model van de mens systemen en benaderingen zijn hard nodig. Het potentieel van de pre-prostaat urogenitale sinus mesenchym (UGSM) naar pluripotente stamcel populatie bewegen om menselijke prostaat epitheel vormen is een krachtig experimenteel hulpmiddel in prostate onderzoek.
Abstract
Vooruitgang bij prostaatkanker onderzoek is ernstig beperkt door de beschikbaarheid van mensen afgeleide en hormoon-naïeve modelsystemen, die ons vermogen om genetische en moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen prostaataandoeningen initiatie begrijpen beperken. Naar het ontwikkelen van betere modelsystemen voor de studie van de menselijke prostaat carcinogenese, hebben wij en anderen gebruik gemaakt van het unieke pro-prostaat inductieve potentieel van embryonale knaagdieren prostaat stroma, genoemd urogenitale sinus mesenchym (UGSM). Bij gerecombineerd met bepaalde pluripotente celpopulaties zoals embryonale stamcellen, UGSM induceert de vorming van normale menselijke prostaat epitheel in een testosteron-afhankelijke wijze. Een dergelijk menselijk model kan worden gebruikt om te onderzoeken en experimenteel testen van het vermogen van de kandidaat prostaatkanker genen in versneld tempo ten opzichte van typische transgene knaagdieren studies. Sinds Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) genetisch kunnen worden gemodificeerd in cultuur using induceerbare genexpressie of siRNA neerhalen vectoren voor weefsel recombinatie, zoals een model maakt het testen van de functionele gevolgen van genen of combinaties van genen, die worden verondersteld om kanker te voorkomen of te bevorderen.
De techniek van het isoleren van zuivere populaties van cellen UGSM echter een uitdaging en leren vaak vereist iemand met eerdere ervaring persoonlijk leren. Bovendien kan inoculatie van celmengsels onder de renale capsule van een immuungecompromitteerde gastheer technisch uitdagend. Hier schetsen we en illustreren goede isolatie van UGSM van knaagdieren embryo's en niercapsule implantatie van weefsel mengsels voor de menselijke prostaat epitheel te vormen. Een dergelijke benadering, in de huidige fase, vereist in vivo xenografting van embryonale stamcellen; toekomstige toepassingen zou kunnen omvatten in vitro klier oprichting of het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen populaties (iPSCs).
Introduction
Er is een enorme behoefte aan betere menselijke modelsystemen van prostaatkanker. Met name zou de relevante menselijke modelsysteem van normale, niet-maligne prostaatweefsels die genetisch kunnen worden gemanipuleerd om direct onderscheiden de rol van specifieke genen in de inleiding van prostaatkanker ongelooflijk informatief. De komst van de genoomtijdperk heeft talrijke genen die een rol spelen bij de vorming van kanker kunnen hebben geïdentificeerd. Een gebrek aan experimenteel menselijk modelsystemen echter ernstig schaadt ons vermogen om functioneel te testen en karakteriseren kandidaat prostaatkanker gevoelige genen. Een ideaal model systeem zou de snelle en snellere functionele analyses van kanker gevoelige genen in combinatie met de juiste transgene knaagdieren modelsystemen te vergemakkelijken. Bovendien zou een dergelijk menselijk modelsysteem moleculaire karakterisering van de signalerende mechanismen van prostate kanker naar de identificatie en validatie van nieuwe therapieën zodatvoorkomen prostaatkanker formatie.
Humane embryonale stamcellen (hESCs) kunnen vormen menselijke prostaat weefsels xenografts. In 2006 Taylor et al.. Gemeld dat hESCs kan worden geïnduceerd prostaat epitheel vorming in vivo bij gerecombineerd met knaagdieren urogenitale sinus mesenchym (UGSM) binnen een tijdsperiode van 8-12 weken. 1 Deze werden gebaseerd op eerder werk van Cunha lab blijkt dat knaagdier embryonale UGSM kan prostaathyperplasie differentiatie van stamcellen en embryonale epitheliale celpopulaties in vivo te bevorderen. 2,3 De prostaat ontwikkelt zich uit een embryonale anlagen zogenaamde urogenitale sinus (UGS) en vóór embryonale dag 17 (E17 muis , dag E18 rat) de UGS kan worden verwijderd en fysiek verdeeld in epitheel (UGSE) en mesenchym (UGSM) 4 Dit weefsel recombinatie benadering is aanzienlijk verbeterd ons begrip van prostate ontwikkeling en carcinogenese bijzonder.ly groeifactor en hormonale signaalwegen en de moleculaire verbanden tussen prostaat epitheel en stroma. 5-8 Deze werkwijze omvat het ex vivo combinatie van UGSM met stamcellen of epitheliale cellen van dezelfde of verschillende soorten en deze cellulaire / weefsels recombinanten worden geïmplanteerd en gekweekt en xenotransplantaten binnen muisgastheer. 4,9 Na een periode van in vivo, het implantaat bevat prostaat epitheliale klierstructuren ingebed in stromale weefsel. Verder kleuring kan worden uitgevoerd om te bepalen of deze al dan werkelijk prostaat en van menselijke oorsprong. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Chicago Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC, protocol nummers 72066 en 72231). Alle operatie werd uitgevoerd onder verdoving, en alle pogingen werden gedaan lijden te bekorten. De menselijke embryonale stamcellen lijn WA01 (H1; NIH-registratie # 0043) werd overgenomen van WiCell (Madison, WI) en gekweekt met behulp van de feeder-onafhankelijk protocol met behulp mTeSR1 media (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). ES-cellen werden binnen tien passages van ontdooien gebruikt.
1. Isolatie van de urogenitale sinus van Muis of Rat embryo
- Euthanize een time-zwangere muis (van 17.5) of ratten (dag 18.5) door inademing van CO2 gedurende 5 minuten. Dood wordt bevestigd door het stilleggen van vitale functies in de rat. Dan breekt haar nek humane manier. De rbij wordt geëuthanaseerd op dit punt. Spuit 70% ethanol aan de buikhuid en flanken steriliseren. Snijd de buikhuid en spieren lagen en snijd de baarmoeder, scheid de rat embryo's uit de vruchtzak, en knipte de navelstreng. Overdracht van de embryo's in een 50 ml Falcon buis met ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) en blijf op ijs. Foetussen worden gedood door onthoofding met chirurgische schaar.
- Plaats het embryo in 100 mm petrischaal. Halveren de embryo met een schaar op het niveau van de umbilicus (Figuur 1A). Verwijder de maag en dunne darm. Onthul de eierstokken in de vrouwelijke embryo en testis in de mannelijke embryo (Figuur 1B en 1C). (De eierstokken zijn bij de caudale polen van de nieren. De testes ongeveer ter hoogte van de blaas). In dit ontwikkelingsstadium, geïsoleerd UGSM zowel mannelijke als vrouwelijke embryo kunnen induceren een prostaat epitheliale lijn in aanwezigheid van gastheertestosteron. 4 Na deze ontwikkelingsstoornis tijdstip echter prostaat knoppen beginnen vormen in de UGSM, en isolatie van zuivere UGSM is zeer uitdagend. 4
- Onder de dissectie microscoop, snijd de buikwand in de middelste lijn met Vannas schaar om de blaas en de achterste wand van de buik bloot. Gratis de bovenste geslachtsorganen van bijlagen (in mannelijke embryo's, snijd de urineleider, Wolffian duct en Müllerian koker; bij vrouwelijke embryo's, snijd de urineleider en Müllerian duct). Bevrijd de blaas uit de navelstreng. Knip schaambeen en botweg gescheiden van de voorste wand van de urogenitale sinus met Dumont fijne punt pincet. Tenslotte, scheid de achterwand van de urogenitale sinus uit het rectum. Snijd de urogenitale sinus de blaas aan het ondereinde (de urethra) en bewaar de urogenitale sinus en bloc (de blaas) in ijskoud HBSS.
2. Scheiding van de urogenitale sinus Mesenchym
- Breng de urogenitale sinus een falcon buis met 1% trypsine in Calcium (Ca 2 +) en magnesium (Mg 2 +) gratis HBSS. Plaats de buis in een koelkast bij 4 ° C gedurende 75 minuten.
- Verwijder de trypsine en trypsine te neutraliseren met 10% foetaal Bovin Serum (FBS) in DMEM/F12-medium.
- Plagen de kleverige mesenchymale huls voorzichtig uit de epitheliale buis met een naald of Dumont fijne punt pincet (het handhaven van de epitheliale tube intact vermindert de kans op epitheliale cellen verontreiniging van het mesenchym, dit kan resulteren in een knaagdier klieren vormen samen met uw stamcellen afgeleide humane klier-epitheel) (figuur 1D). 12
- Breng UGSM in een nieuwe Falcon-buis met DMEM/F12 medium + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine (pen / strep, 0,5 mg / ml) + 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA) plus 1 nM R1881. Place de buis in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende de nacht.
- Centrifugeer het weefsel bij 200 xg en gooi het supernatant. Wassen met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (niet storen het weefsel pellet).
- Voeg 0,2% collagenase (in DMEM/F12) opnieuw te schorten het weefsel. Incubeer bij 37 ° C onder zacht schudden gedurende 1 uur.
- Krachtig vortex de spijsvertering weefsel drie keer totdat het homogeen eencellige mengsel en voeg DMEM/F12-medium + 10% FBS + 1% P / S + 1% NEAA + 1 nM R1881 aan de collagenase neutraliseren.
- Centrifugeer bij 200 xg en daarna wassen door opnieuw schorsing van de UGSM cellen in HBSS, en herhaal dit drie keer om de UGSM volledig wassen. Tenslotte schorsen mesenchymale cellen in DMEM/F12 en tel de cellen met een hemocytometer of mobiele telinrichting.
- Distantiëren hES cellen gekweekt met behulp van feeder-free protocol met mTeSR1 media (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) met behulp van een Accutase spijsvertering (Millipore, Billerica, MA). Was de hES cellenin de log fase van de groei in warme DMEM/F12 media, voeg warm 1x Accutase oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 15-20 min tot enkelvoudige cellen gedissocieerd zijn uniform van kolonies. Voeg een gelijke hoeveelheid 1x gedefinieerde trypsine-remmer (Invitrogen, Grand Island, NY) om de Accutase neutraliseren en voorzichtig pipet op en neer om te mixen en breken celklonten. Pipetteer cellen in een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 3 min bij 200 xg en resuspendeer celpellet in DMEM/F12 media. Centrifugebuis gedurende 3 min bij 200 weer xg en verwijder het supernatant, vervolgens opnieuw te schorten in koud HBSS of DMEM/F12 op gewenste volume.
- Voeg hES cellen met 1:2,5 verhouding van HES / mesenchymale cellen. 3 Dit zal een cellulaire samenstelling van 1E 5 UGSM cellen met 4E 4 hESCs per 10 ml injectie (een enkele rat UGS meestal levert ongeveer 2E 6 mesenchymale cellen) zijn. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten en dan gooi het supernatant. Re-schorten met 75% Matrigel (BD Biosciences,San Jose, CA, gemengd met 25% koud HBSS een eenvoudige bediening) en plaats de buis in ijs voor sub-renale capsule injectie.
3. Transplantatie van weefsel Recombinant Onder de Nier Capsule
- Bereid een steriel chirurgisch gebied.
- Verdoven een mannelijke athymische naakt muis met ketamine / xylazine ip; gebruik een frisse mix met een 01:01:08 verhouding van ketamine: xylazine: zoutoplossing. Dosering wordt 100 mg / kg ketamine en 2,5 mg / kg xylazine zijn. Dieren die niet reageren op een teen-snuifje moet volledig onder gedurende 20-30 minuten.
- Chirurgisch voorbereiding van de muis door het scheren van de operatiewond (indien niet met behulp van een naakt muis), reiniging met drie afwisselende doekjes van 70% alcohol, gevolgd door betadine oplossing en het toepassen van een chirurgische doek.
- Zet eye vocht zalf (Altalube oogzalf) voor de ogen van de muis drogen tijdens de anesthesie te voorkomen.
- Tijdens de operatie, zijn ademhaling en de lichaamstemperatuur van de muizen gecontroleerd. De ademhaling shoULD zijn stabiel en gehandhaafd binnen 40-90 ademhalingen / min. Kerntemperatuur van het lichaam wordt bewaakt met waarneming van de kleur van de slijmvliezen en de roze voetzolen.
- Maak een 1.0 cm lang longitudinale incisie in de huid op de rug. Blijf de buikwand in een 0,5 cm longitudinale incisie te snijden.
- Knijp voorzichtig in de nieren uit de buik en houden de nieren oppervlak vochtig met druppels steriele zoutoplossing.
- Voorzichtig doorboren de nier capsule met behulp van een lege 27-gauge naald. Een zeer ondiepe punctie voldoende is. Dit zal zijn waar je je botte naald om uw mobiele mengsel moet inspuiten.
- Vul een 28-gauge stompe naald met 10 ul van uw mobiele mengsel. Langzaam steek de prikplaats en dringen de nierparenchym om een gebied onder de renale capsule bereiken. Injecteer 10 ul van de cellulaire mengsel bolus op de nier onder de renale capsule vormen. Terugtrekking van de naald.
- De terugkeer van de nier naar de abdominal holte. Beveilig de spierlaag van het buikvlies met 4-0 nylon hechtingen.
- Sluit de huid met ofwel hechtingen of nietjes.
- Schoon bloed uit de huid met behulp van een steriele zoutoplossing.
4. Post-operatieve analgesie en Monitoring
- Injecteer het dier met buprenorfine (0,1 mg / kg elke 12 uur) en ketoprofen (3-5 mg / kg in zoutoplossing elke 12 uur) tot post-operatieve pijn, en 1 ml van 37 ° C zoutoplossing ip het dier warm beheerder en uitdroging te voorkomen.
- Zet het dier in een schone kooi en plaats deze op een milde verwarming pad.
- Sturen de dieren terug naar dierlijke kamer zodra ze weer bij bewustzijn en bewegen binnen de kooi.
- Observeer de dieren dagelijks voor onverwachte tekenen van ziekte en besmetting voor de volgende drie dagen. De muizen worden bewaakt met observatie van de activiteiten in kooien, waaronder toegang te verschaffen tot voedsel en water 1 dag postoperatief. Als de muizen weer minder activiteiten, Ketoprofen is intraperitoneaal advertentieopnieuw diende een keer per dag.
- Verwijder de nietjes of hechtingen 2 weken na de operatie huid.
- Xenograft weefsels kunnen worden geoogst Reeds 8 weken na de operatie. Xenotransplantaten kunnen worden afgebeeld in vivo gebruik van kleine dieren ultrasound (Figuur 2A), en vaste weefsels secties en gekleurd voor verschillende eiwitten middels immunohistochemie (figuur 3) zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voortbouwend op het spannende verslag door Taylor, et al.., Heeft ons lab een engrafting protocol met behulp van de algemeen gebruikte H1 (NIH-aangewezen WA01, genetisch mannelijk) aan menselijke embryonale stamcellen lijn. 1 Deze lijn is uitgebreid getest voor de kwaliteitscontrole en ontwikkeld is karyotypisch normaal 13 bij een juiste gekweekt, kan hES cellen worden gehandhaafd, uitgebreid, en ingevroren in een ongedifferentieerde en pluripotente toestand met behulp van een feeder-vrije cultuur-methode (feeder-free systemen commercieel verkrijgbaar via Stem Cell Technologies, Vancouver BC).. 14 Onze protocol maakt gebruik van enkele cel suspensies van hESC 's in combinatie met enkele cel suspensies van E18 rat UGSM en geïnjecteerd onder de renale capsule van volwassen mannelijke immuungecompromitteerde muizen. Als belangrijke bedieningselementen, USGM geïmplanteerd alleen levert geen waarneembare groei, terwijl hESCs geïmplanteerd zonder UGSM vormen grote teratomas (Figuur 2B). 15 In onze ervaring, implantaatatie van UGSM zonder vervuilen rat epitheelcellen nooit resulteert in de groei van weefsel, terwijl de recombinatie van UGSM plus hESCs resulteert in een robuuste groei meer dan 80% van de tijd (na 8 weken maten variëren van 1 mm tot 5 mm, met meer dan 80% van het weefsel bevattende klieren epitheel). In recombinanten die zowel hESCs en UGSM is vervroegde glandulaire vorming waargenomen na 4 weken en na 8 weken volledig gevormd is prostaatspecifiek antigeen (PSA)-positieve menselijke prostaat epitheel gevormd (figuur 3). Deze klieren bevatten androgeenreceptor (AR)-positieve luminale-uitscheidende cellen die niet aanwezig een week na ontvangst castratie. Belangrijk is dat deze klieren zijn positief voor de menselijke-specifieke en prostaat-specifiek eiwit PSA. Verdere kleuring documenten die zulke menselijke klieren verschijnt goedaardige beschouwd aangezien zij geen expressie Alpha-methylacyl CoA-racemase (AMACR), een prostaatkanker-specifieke marker 16.
ether.within-page = "altijd"> 
Figuur 1. Isolatie van de urogenitale sinus van een E18.5 Rat Embryo. A. E18.5 rat embryo. De witte vaste lijn geeft de positie om de embryo halveren. B. E18.5 mannelijke rat embryo. De zwarte stippellijnen geven de blaas, urogenitale sinus, rectum, en het ontwikkelen van testes. C. E18.5 vrouwelijke rat embryo. De zwarte stippellijnen geven de blaas, urogenitale sinus en baarmoeder. D. De blaas en de urogenitale sinus verwijderd uit het E18.5 rat embryo. De while, ononderbroken lijn geeft de positie om de blaas te verwijderen. De zwarte gestippelde lijn en witte pijl geven de epitheliale buis. De witte pijlpunt geeft de urogenitale sinus mesenchym.
7/50327fig2.jpg "alt =" Figuur 2 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig2highres.jpg "/>
Figuur 2. Echografie en grove morfologie van in vivo weefsel xenograften ontleend UGSM en hESCs. A. Echoscopie van groeiende xenotransplantaties dat de levende dier-analyses in de loop van het experiment. Beeld is vastgelegd 8 weken na de operatie met behulp van een Vevo 2100 klein dier echografie (VisualSonics, Toronto, ON). . Omcirkelde gebied vertegenwoordigt de groeiende weefsel xenograft op de nieren oppervlak B. Op de experimentele eindpunt, hES cellen in combinatie met ratten UGSM (rUGSM) vormen een zichtbare weefsel massa op de nieren oppervlak (linker paneel); hES cellen geïmplanteerd alleen vormen grote teratomas als verwacht (middelste paneel), en UGSM alleen geïmplanteerd niet aan een waarneembare structuur (rechter paneel) te vormen.
Jpg "alt =" Figuur 3 "fo: content-width =". 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/50327/50327fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Vorming van menselijke prostaat epitheel van de menselijke embryonale stamcellen Line WA01 (H1). ES-cellen werden opnieuw gecombineerd met knaagdieren UGSM en geïmplanteerd onder de renale capsule intact mannelijk naakt muizen. Na een groeiperiode van 8 weken, wordt de menselijke prostaat klier-epitheel gevormd zoals gedocumenteerd door AR, p63, en mens-restricted PSA kleuring. Een week na ontvangst castratie, de AR-positieve, PSA-positieve luminaal layer is niet aanwezig, documenteren karakteristieke androgeen-afhankelijkheid. Prostate weefsels goedaardige zoals aangetoond door een gebrek aan AMACR kleuring. Daarnaast chra-positieve neuro-endocriene cellen detecteerbaar waren. Niet-maligne humane prostaatweefsel gebruikt als controle voor AR, PSA, en p63, een prostate tumor werd gebruikt als een positieve controle voor kanker-specifieke AMACR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tissue recombinatie met UGSM een ongelooflijk handige techniek om de ontwikkeling van de prostaat en de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot prostaatkanker initiatie onderzoeken. De inductieve potentieel van UGSM is gebruikt voor talrijke toepassingen in prostate onderzoek, onder meer verbetering tumor nemen prostaat cellijnen en tumoren bestuderen stroma epitheliale interacties en verknopingen species prostate recombinanten 7,17-20 goede voorbereiding van UGSM. is echter essentieel voor experimentele succes contaminerende knaagdieren epithelium leidt tot klier vorming en kan resultaten verwarren. Aldus, de scheiding van de UGSM de UGSE (stap 2.4) is veruit de meest kritische en ook het meest lastige stap in het protocol. Om te controleren voor dergelijke besmetting, wordt het gebruik van technieken om onderscheid te maken tussen soorten sterk aangemoedigd, evenals een extra experimentele arm met UGSM alleen om geen klier vorming van cellula documenterenr verontreinigingen. 12
De recente ontwikkeling van de feeder-vrije hES kweken reagentia en methoden kunt zuivere populatie hES cellen te kweken, uitgebreid en gecryopreserveerde. 14 Bovendien is het uitgebreide gebruik van lentivirale gentherapie kan de stabiele genomische integratie en expressie van genen van belang. 21,22 Deze gecombineerde vooruitgang kan de genetische manipulatie van pure HES culturen en in combinatie met de inductieve potentieel van prostaat embryonale UGSM, het mogelijk wordt het in vivo genereren van humane prostaat klieren expressie van specifieke genen van belang. Bovendien zou deze techniek vatbaar geïnduceerde pluripotente stamcellijnen (iPSCs) afkomstig van volwassen gastheren en genetisch-gemodificeerde cellen. 23,24 hand van gedefinieerde eiwitten wordt aangetoond dat dergelijke hESC-afgeleide menselijke prostaat epitheel lijken sterk op volwassen menselijke prostaat epitheel, maar op mondiaal moleculair niveau is er zeker van te zijnenkele verschillen in genexpressie die in aanmerking moeten worden genomen. Om rekening te houden dit, moet de onderzoekers gebruik maken van een uitgebreide steekproef en overwegen laser-capture microdissectie (LCM)-gebaseerde benaderingen en vergelijkende genexpressie analyses platforms om de moleculaire profielen van hun weefsels te valideren ten opzichte van volwassen menselijke weefsels. Niettemin, de vorming van menselijke prostaat glandulaire epitheel met een serieel gekweekt en voedingsvrije stamcellenvariëteit het potentieel vele moleculaire studies met betrekking tot prostate functie en het ontstaan van kanker vergemakkelijken.
De techniek maakt gebruik van enkelvoudige celsuspensies van zowel UGSM en hESCs, die het gebruik van lentivirale infectie en stroom kunnen sorteren benaderingen en nauwkeuriger controle van cellulaire hoeveelheden. Dit kan echter verminderen de inductieve potentieel van UGSM. Een alternatieve benadering is het niet-gesplitste UGSM (na stap 2.5), gebruikt voor collagenase digestie)en hetzij rechtstreeks incubatie met ES-cellen, of inbedding cellen binnen een collageen oplossing. 4 Om deze weefsels implanteren onder de renale capsule, zou een alternatieve techniek om een incisie te maken in de nier capsule, maak een klein zakje onder de renale capsule bovenop van de nier, en fysiek plaats de celmassa binnen die zak. 4,20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten met het gepresenteerde werk.
Acknowledgments
Wij willen de steun van de Universiteit van Chicago Sectie Van Urologie geleid door Dr Arieh Shalhav, en de directeur van Urologic Research Dr Carrie Rinker-Schaeffer erkennen. We willen ook graag de steun van de Universiteit van Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) onder leiding van dr. Michelle Le Beau erkennen. We hebben ook met dank aan deskundige technische bijstand van de Human Tissue Resource Center kern faciliteit onder leiding van dr. Mark Lingen, en de hulp van Leslie Martin en Mary Jo Fekete. We danken ook de Immunohistochemistry Core Facility gerund door Terri Li. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Chicago afdeling Heelkunde, de afdeling Urologie, een American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004), een Cancer Center Ondersteuning Grant (P30 CA14599); De Brinson stichting, de Alvin Baum Family Fund, The University of Chicago Board Cancer Research Foundation Vrouwen; S. Kregel wordt ondersteund door een HHMI: Med-in-Grad Fellowsheup (56006772) en een Kankerbiologie Training Grant (T32-CA09594). Tot slot willen we Robert Clark, Dr VenkateshKrishnan, en Nathan Stadick bedanken voor hun kritische beoordeling van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
- Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
- Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
- Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
- Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
- Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
- Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
- Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
- Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
- Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
- Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
- Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
- Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
- Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
- Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
- Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).
- Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
- Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).
