Summary
Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken
Abstract
Monocyt-afgeleide macrofagen een belangrijke celtype van het aangeboren immuunsysteem. Muismodellen bestuderen macrofaag biologie lijden de fenotypische en functionele verschillen tussen muizen en humane monocyt-afgeleide macrofagen. Daarom beschrijven we hier een in vitro model voor primaire humane macrofagen produceren en te bestuderen. Kort na dichtheidsgradiënt centrifugering van perifeer bloed getrokken uit een onderarm ader, monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen met negatieve magnetische bead isolatie. De monocyten worden vervolgens gekweekt gedurende zes dagen in bepaalde omstandigheden verschillende macrofaag differentiatie of polarisatie induceren. Het model is gemakkelijk te gebruiken en omzeilt de problemen veroorzaakt door species-specifieke verschillen tussen muis en mens. Bovendien is dichter bij de in vivo omstandigheden dan het gebruik van geïmmortaliseerde cellijnen. Kortom, de hier beschreven model is geschikt om te studeren macrophage biologie, identificeren ziektemechanismen en nieuwe therapeutische doelwitten. Hoewel niet volledig experimenten met dieren of menselijke weefsels verkregen post-mortem vervangen, de hier beschreven model maakt de identificatie en validatie van de ziekte mechanismen en therapeutische doelwitten die zeer relevant zijn voor verschillende ziekten bij de mens kunnen zijn.
Introduction
Monocyt-afgeleide macrofagen een belangrijke cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem en bijdragen aan vele acute of chronische ontstekingsprocessen 1. Macrofagen spelen een belangrijke rol in vele inflammatoire ziekten zoals atherosclerose of kanker 2. Macrofagen een hoge plasticiteit en kunnen verschillende fenotypes afhankelijk van de plaatselijke micromilieu 3 nemen. Aldus bestuderen macrofaag differentiatie en heterogeniteit is essentieel voor het verhogen van de kennis van de pathofysiologie van vele ziekten en identificatie van nieuwe therapeutische doelwitten en ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk.
In veel gevallen worden muismodellen gebruikt om de pathofysiologie van bepaalde ziektebeelden. Echter, het bestuderen macrofaag biologie gebruikt muismodellen vergezeld door verscheidene tekortkomingen: (1) Het aantal leukocyten deelverzameling getallen (bijvoorbeeld monocyten en granulocyten) in raHeral bloed van muizen of mensen verschilt sterk suggereert verschillende rollen van monocyten in muizen en menselijke pathofysiologie. (2) Er bestaan aanzienlijke verschillen in genexpressie tussen muis en mens perifere bloed monocyten suggereert substantiële verschillen in hun functie tijdens gezondheid en ziekte 4. (3) een aantal markers die worden gebruikt om murine monocyten en macrofagen (F4/80, LYC, etc.) Identificeren bestaat niet in humane myeloïde cellen, die de overdracht van de bevindingen in muismodellen de menselijke situatie nogal moeilijk.
Dus, om ons inzicht in macrofaag differentiatie en ongelijkmatig menselijke ziekte te verhogen, moeten we gebruik van modellen werken met menselijke macrofagen maken. Daarom beschrijven we hier een model van menselijke primaire macrofagen generatie die gemakkelijk te gebruiken en maakt studie van humane monocyt-afgeleide macrofagen in vitro onder verschillende omstandigheden die leiden tot verschillende macrofaag posatie types. In verscheidene studies hebben we de in vitro model van monocyt-afgeleide primaire humane macrofagen macrofaag biologie en het potentiële relevantie voor de menselijke atherosclerose 5-7 analyseren.
Hoewel niet volledig experimenten met dieren of menselijke weefsels verkregen post-mortem vervangen, de hier beschreven model maakt de identificatie en validatie van de ziekte mechanismen en therapeutische doelwitten die zeer relevant zijn voor verschillende ziekten bij de mens kunnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protocol
- Buffers Bereid als volgt:
- Bereid buffer voor PBMC isolatie: "Was buffer" = 0,02% EDTA in PBS (gebruik 0,5 M EDTA).
- Bereid buffer voor monocyt isolatie: "MACS spoelbuffer" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 pl) + PBS (50 ml). Degas de buffer.
- Bereid buffer voor FACS kleuring en opslag van cellen: "FACS buffer" = 10% FCS in PBS en "fixatie buffer" = 1% PFA in PBS.
- Trek 30 ml bloed uit een ader onderarm. Gebruik EDTA als antistollingsmiddel.
- Isoleer PBMC (histopaque) als volgt:
- Bereid twee steriele 50 ml buizen (geen poly-styreen).
- Verdunnen het bloed van stap 2 met PBS 01:01.
- Voeg 25 ml histopaque + 25 ml bloed / PBS per tube. Zorg ervoor dat histopaque en bloed gaan niet samen.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem.
- Aspireren plasma en gooi het weg.
- Aspireren ondoorzichtige interface en pipet in schone 50 ml bade.
- Voeg 20 ml van 0,02% EDTA in PBS.
- Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Gooi supernatant.
- Voeg 10 ml van 0,02% EDTA in PBS.
- Telling cellen als volgt:
- Meng goed door vortexen gedurende 10 sec.
- Neem 200 pi celsuspensie + 300 pi 0,02% EDTA in PBS + 500 pi van trypan blauw (200-500 cellen/10 pleinen, anders verandert verdunningsfactor).
- Voer negatieve isolatie van monocyten als volgt:
- Centrifugeer cellen verkregen in stap 3.10 gedurende 10 min, 120 x g. Gooi supernatant.
- Wassen celpellet 2x met 10 ml PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer gedurende 10 min, 120 x g.
- Voeg 9 ml steriel water voor 3 seconden, voeg 1 ml 10X PBS.
- Nogmaals wassen met PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer 10 min, 120 x g.
- Telling tijdens centrifugeren.
- Verdunnen EasySep buffer bij 5 x 10 7 / ml.
- Voeg 50 ul / ml monocyten verrijking pikstaart.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Vortex kralen voor 30 sec.
- Voeg 50 ul / ml korrels.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Vul met EasySep buffer volume van 2,5 ml voltooien. De oplossing lijkt nu bruinachtig.
- Zet in magneet.
- Wacht 2,5 min bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd niet-monocytcellen gebonden aan de magnetische kraal zal verhuizen naar de buiswand en plakken daar.
- Giet buffer met niet-bindende monocyten in de frisse steriele buis. Deze oplossing ziet er witachtig.
- Was eenmaal met PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer gedurende 10 min, 120 x g.
- Cellaag in een plastic schaal of meerwandige plaat bij een dichtheid van 0,5 x 10 6 / cm 2. Voeg 1 ml kweekmedium / 1 x 10 6 cellen.
- Cultuur cellen onder omstandigheden van belang zijn voor 6-14 dagen.
- Wijzig media na 3 dagen door het vervangen van 50% van de media met verse media (zie tabel 1 voor details).
- Na zes dagen oogst cellen voor mRNA isolatie, flowcytometrie, Western blotting, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de hierboven beschreven protocol, we routinematig 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml bloed (gemiddelde ± standaard fout van 26 onafhankelijke experimenten, figuur 1A) te verkrijgen. Monocyt zuiverheid zoals bepaald door flow cytometrische kleuring voor CD14 is routinematig meer dan 95% (97.1 ± 0.4%, gemiddelde ± standaard fout van 3 onafhankelijke experimenten, figuur 1B). Levensvatbaarheid van vers geïsoleerde monocyten cel zoals bepaald door trypan blauw kleuring routinematig meer dan 95% (gegevens niet getoond). Terwijl aanvankelijk cellen zijn ronde vorm en vlotter, ze beginnen meestal vastzit binnen een paar uur. Therapietrouw wordt geassocieerd met een vormverandering in de richting van een "gebakken ei" of spindel-achtige vorm (Figuur 2). Na zes dagen in kweek met M-CSF (100 ng / ml) met of zonder toevoeging van geoxideerd LDL (100 ug / ml gedurende de laatste 24 uur), ongeveer 80% van de cellen niet blootgesteld aan oxLDL levensvatbaar zijn, terwijl treatment met oxLDL resulteerde in ongeveer 70% levensvatbare cellen (Figuur 3). Flowcytometrie na zes dagen kweek met M-CSF te zien dat het de cellen houden de expressie leukocyten marker CD45RO, zij downregulate de monocyt marker CD14 (Figuur 4). Specifieke voorwaarden macrofaag polarisatie leiden - aldus M1-of M2-gepolariseerde macrofagen expressie typische merkers zoals IL-6, TNF-alfa (M1) of CD36 en CD206 (M2) (Figuur 5). Macrofagen kunnen verder worden onderzocht in functionele experimenten. Bijvoorbeeld kan de opname van geoxideerd LDL bestudeerd door fluorescent labels LDL (figuur 6).
Figuur 1. (A) Nummers van perifere monocyten verkregen na negatieve kraal isolement. Mobiele nummers zijn normaliserend van 100 ml perifeer bloed. Gegevens van 26 onafhankelijke experimenten. (B) Zuiverheid van monocyten verkregen met negatieve kraal isolatie zoals bepaald door middel van flowcytometrie. Vertegenwoordiger forward kant scatterplot en histogram van CD14 kleuring, negatieve controle weergegeven als stippellijn.
Figuur 2. Cellen na 3 en 6 dagen cultuur met M-CSF. Schaal bar = 50 micrometer.
Figuur 3. Levensvatbaarheid van macrofagen na 6 dagen in kweek met M-CSF of na 6 dagen in kweek met M-CSF en oxLDL (100 ug / ml) toegevoegd voor de laatste 24 uur zoals bepaald met propidium jodide (PI) kleuring. Representatieve naar linksvoor scAtter kavels en histogrammen voor PI kleuring.
Figuur 4. Flowcytometrie de monocyt marker CD14 op vers geïsoleerde monocyten of monocyt-afgeleide macrofagen na zes dagen in kweek met M-CSF (100 ng / ml).
Figuur 5. Genexpressie van IL-6, TNF-alpha, CD36 en CD206 (mannose receptor) in primaire humane macrofagen gedifferentieerd M-CSF (100 ng / ml, 6 dagen) en de gepolariseerde richting van een M1 fenotype (LPS, 100 ng / ml en IFN-gamma, 20 ng / ml, voor de laatste 18 uur) of M2 (IL-4, 20 ng / ml gedurende de laatste 18 uur). Genexpressie wasgemeten met kwantitatieve PCR. * P <0,05, ** p <0,01.
Figuur 6. (A) Immunofluorescentie beeld van M-CSF-geïnduceerde macrofagen menselijke macrofagen. Cellen werden blootgesteld aan 10 ug / ml Dil-gelabelde oxLDL gedurende 4 uur. Kernen werden gekleurd met DAPI. Schaal bar = 50 micrometer. (B) Vertegenwoordiger histogram van flowcytometrische meting van Dil-oxLDL opname door M-CSF-geïnduceerde humane macrofagen. Grijs = onbehandelde controle, zwarte lijn = oxLDL behandelde macrofagen.
| Type | Voorwaarden | Refs |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2a |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2b |
| 8 |
| M2c |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-Hb |
| 11 |
| M-ox | 12 | |
| Andere typen macrofaag |
| 13 |
Tabel 1. Voorbeeld voor de voorwaarden en de typische markers van gevestigde M1 of M2 macrofaag polarisatie types (zie verwijzingen naar specifieke isolatie procedures of celkweekomstandigheden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monocyt-afgeleide macrofagen vertegenwoordigen de belangrijkste celtype van het aangeboren immuunsysteem. Zij spelen een belangrijke rol in vele ontstekingsziekten waaronder atherosclerose of kanker 2. Aldus bestuderen macrofaag biologie is essentieel voor het vergroten van onze kennis over de pathofysiologie van vele ziekten en ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk.
Vele studies toepassing van muismodellen overexpressie of ontbreken bepaalde genen van belang. Bij monocyt-afgeleide macrofagen, lijkt dit niet de beste manier om processen te bestuderen om menselijke ziekten relevant aangezien er aanzienlijke verschillen tussen muizen en humane monocyten en monocyt-afgeleide cellen 4. Aldus geldt modellen maken gebruik van primaire humane cellen lijkt een goed alternatief voor ziekte-relevante mechanismen van macrofaag differentiatie te bestuderen.
Een duidelijk voordeel van het in vitro model hier gepresenteerde dat niet afhankelijk immortalized cellijnen zoals THP-1 of anderen 14-15. Terwijl cellijnen kan gemakkelijk verkregen en omzeilen de noodzaak voor regelmatig bloed trekt, cellijnen zijn fenotypisch en functioneel niet identiek zijn aan primaire cellen. Zo Cho et al.. Hebben het gen handtekeningen van primaire humane macrofagen vergeleken en vergeleken met eerder gepubliceerde gegevens van THP-1 12,14. Zij vonden een significante, maar matige correlatie tussen beide celtypes suggereert dat THP-1-cellen niet het ideale model om macrofaag differentiatie en heterogeniteit te bestuderen in veel gevallen mogelijk. Ook zijn er verschillende modellen hoe niet-hechtende monocyten als THP-1-cellen differentiëren tot macrofagen. Zelfs bij gebruik van de waarschijnlijk meest toepasselijke protocol waarbij THP-1 cellen worden behandeld met PMA gevolgd door vijf dagen rust in cultuur zonder PMA (PMAr), hoeft cellen niet geheel gedragen als primaire cellen 16. Tezamen bieden deze bevindingen suggereren dat voor de studie van de menselijke ziektemechanismen op een cellulair niveau, primaire macrofagen lijken geschikter dan cellijnen.
Men moet zich bewust zijn van andere methoden die isolatie van primaire humane monocyten toestaan: vasthouden aan plastic, positieve kraal isolatie, of tegenstroom centrifugeren elutriatie 17. De monocyt verrijkingscocktail hier gebruikt bevat antilichamen tegen CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycoforine A en dextran beklede magnetische deeltjes. Deze antilichamen binden aan epitopen op andere dan monocyten die vervolgens kan binden magnetische deeltjes leukocyten en worden gehouden in de buis door het magnetische veld terwijl alle ongebonden monocyt in een tweede buis kan worden overgedragen. Bovendien is de verrijkingscocktail bevat antilichamen tegen humaan Fc-receptoren (die sterk uitgedrukt monocyten) die niet-specifieke binding te voorkomen monocyten. Dienovereenkomstig, de hier gepresenteerde methode levert "ongerepte" niet-geactiveerde monocyten met een hoge zuiverheidsgraad.
Er zijn enkele punten die moeten in gedachten worden gehouden bij het toepassen van dit model. Ficoll / Histopaque centrifugeren moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. EDTA in de wasbuffer is noodzakelijk integrine-afhankelijke binding van bloedplaatjes te remmen monocyten. Het is belangrijk om zaad monocyten op de juiste dichtheid om een optimale differentiatie bereiken. Beide zaaien monocyten te los of te dicht resulteert in suboptimale groei en differentiatie. Mogelijkheden voor veranderingen omvatten zaaien de cellen op specifieke substraten of in een andere groeifactoren (zoals GM-CSF 18) of toevoeging van specifieke cel activatoren (bijvoorbeeld cytokinen of LPS 8, tabel 1).
Cuvetten verkregen uit verschillende individuen kan een grotere mate van variatie met betrekking tot specifieke celfuncties. Aldus Martín-Fuentes et al.. Hebben aangetoond dat monocyt-afgeleide macrofagen van verschillende individuen tonen verschillende capaciteiten van LDL opname 19. Interessant is dat deze verschillen blijven stabiel in de tijd suggereert dat variatie tussen cellen van verschillende donoren zijn nietwegens verschillende experimentele omstandigheden, maar tijdens individuele genetische of epigenetische verschillen. Aan de ene kant is dit grotere variatie vereist grotere aantallen om significante resultaten te verkrijgen in bepaalde experimenten zoals oxLDL opname. Daarentegen deze verschillen ook onderzoekers in staat om verschillen tussen gezonde en zieke personen op celniveau waardoor nieuwe ziektemechanismen onthullen bestuderen.
Kortom, de hier beschreven protocol is eenvoudig te gebruiken, reproduceerbaar zijn en voor zeer zuivere monocyten populaties, die vervolgens kan worden gedifferentieerd naar macrofagen te verkrijgen. Afhankelijk van de kweekomstandigheden kunnen verschillende soorten monocyt-afgeleide macrofagen bestudeerd voor de identificatie van specifieke fysiologische of pathofysiologische processen menselijke ziekten tegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hoeven niet te eventuele belangenconflicten bekendmaken.
Acknowledgments
Wij danken Nadine Wambsganss voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) en deels door een subsidie van het Innovatiefonds FRONTIER (Universiteit van Heidelberg) naar CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
