Summary
, Blodmonocyttavledede makrofager er viktige celler i det medfødte immunsystemet. Her beskriver vi en lett å bruke
Abstract
, Blodmonocyttavledede makrofager er en viktig celletype av det medfødte immunsystemet. Musemodeller studerer makrofag biologi lider av de fenotypiske og funksjonelle forskjeller mellom murine og humane, blodmonocyttavledede makrofager. Derfor har vi her beskriver en in vitro-modell for å generere og studere primære humane makrofager. Kort, etter tetthetsgradient-sentrifugering av perifert blod trekkes fra en underarm vene, er monocytter isolert fra perifere mononukleære celler ved hjelp av negativ magnetiske kuler isolasjon. Disse monocyttene blir deretter dyrket i seks dager under bestemte forhold for å fremkalle forskjellige typer av makrofag differensiering eller polarisering. Modellen er enkel å bruke og omgår problemene forårsaket av artsspesifikke forskjeller mellom mus og menneske. Videre er det nærmere den in vivo-betingelser enn bruk av immortaliserte cellelinjer. I konklusjonen, er modellen beskrevet her egnet til å studere macrophage biologi, identifisere sykdomsmekanismer og nye terapeutiske mål. Selv om ikke fullt ut erstatte eksperimenter med dyr eller menneskelige vev innhentet post mortem, gjør at modellen er beskrevet her identifisering og validering av sykdomsmekanismer og terapeutiske mål som kan være svært relevant for ulike menneskelige sykdommer.
Introduction
, Blodmonocyttavledede makrofager representerer en viktig cellulær komponent i det medfødte immunsystemet, og bidra til mange akutte og kroniske inflammatoriske prosesser en. Makrofager spiller en viktig rolle i mange inflammatoriske sykdommer som aterosklerose eller kreft 2.. Makrofager viser en høy grad av plastisitet, og er i stand til å anta forskjellig fenotype avhengig av den lokale micromilieu 3.. Således studere makrofag differensiering og heterogenitet er viktig for å øke vår kunnskap om patofysiologien for en rekke sykdommer og for å tillate identifisering av nye terapeutiske mål og utviklingen av nye terapier.
I mange tilfeller er murine modellene benyttet for å undersøke patofysiologien av spesifikke sykdommer. Men studerer makrofag biologi ved hjelp av mus modeller ledsaget av flere svakheter: (1) Andelen av leukocytter undergruppe tall (dvs. monocytter og granulocytter) i peripHéral blod av mus eller mennesker skiller seg vesentlig foreslå ulike roller monocytter i murine og menneskelige patofysiologi. (2) Det er betydelige forskjeller i genuttrykk mellom murine og humane perifere blod monocytter tyder på betydelige forskjeller i sin funksjon under helse og sykdom fire. (3) En rekke markører som brukes til å identifisere murine monocytter og makrofager (F4/80, LYC, etc.) Ikke finnes i humane myeloidceller, foretar overføringen av funnene i musemodeller til den menneskelige situasjon ganske vanskelig.
Derfor, for å øke vår forståelse av makrofager differensiering og heterogenitet i menneskelig sykdom, må vi gjøre bruk av modeller som arbeider med menneskelige makrofager. Derfor har vi her beskriver en modell av human makrofag primære generasjon som er lett å bruke og tillater undersøkelse av humane monocytt-avledede makrofager in vitro, under forskjellige forhold, som resulterer i forskjellige makrofag polarisering typer. I flere studier, har vi brukt in vitro modell av blodmonocyttavledede primære humane makrofager å analysere makrofag biologi og dens potensielle relevans for mennesker aterosklerose 5-7.
Selv om ikke fullt ut erstatte eksperimenter med dyr eller menneskelige vev innhentet post mortem, gjør at modellen er beskrevet her identifisering og validering av sykdomsmekanismer og terapeutiske mål som kan være svært relevant for ulike menneskelige sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Protokoll
- Forbered buffere som følger:
- Forbered buffer for PBMC isolasjon: "Vask buffer" = 0,02% EDTA i PBS (bruk 0,5 M EDTA).
- Forbered buffer for monocytt isolasjon: "skylling MACS-buffer" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 pl) + PBS (50 ml). Avgasse buffer.
- Forbered buffer for FACS farging og lagring av celler: "FACS-buffer" = 10% FCS i PBS og "fiksering buffer" = 1% PFA i PBS.
- Tegn 30 ml fullblod fra en underarm vene. Bruk EDTA som antikoagulant.
- Isoler PBMC (Histopaque) som følger:
- Forbered to sterile 50 ml rør (ingen poly-styren).
- Fortynne blodet fra trinn 2 med PBS 01:01.
- Tilsett 25 ml Histopaque + 25 ml fullblod / PBS per tube. Sørg for at Histopaque og blod ikke blander.
- Sentrifuger ved 400 xg i 30 min ved RT, ingen brems.
- Sug plasma og kast.
- Sug ugjennomsiktig grensesnitt og pipette i ren 50 ml tube.
- Tilsett 20 ml av 0,02% EDTA i PBS.
- Sentrifuger ved 250 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Kast supernatanten.
- Tilsett 10 ml 0,02% EDTA i PBS.
- Tell cellene som følger:
- Bland godt ved å virvle i 10 sek.
- Ta 200 ul celle suspensjon + 300 mL 0,02% EDTA i PBS + 500 mL av Trypan blå (200-500 cells/10 torg, ellers endre fortynning faktor).
- Utfør negativ Isoleringen av monocytter som følger:
- Sentrifuger cellene oppnådd i trinn 3.10 i 10 minutter, 120 x g. Kast supernatanten.
- Vask cellepelleten 2x ved tilsetning av 10 ml PBS + 0,02% EDTA og sentrifuger i 10 minutter, 120 x g.
- Legg til 9 ml sterilt vann i 3 sekunder, tilsett 1 ml 10X PBS.
- Vask en gang med PBS + 0,02% EDTA og sentrifugeres 10 minutter, 120 x g.
- Telle under sentrifugering.
- Fortynn i EasySep-buffer ved 5 x 10 7 / ml.
- Tilsett 50 mL / ml monocyte berikelse kukhale.
- Inkuber i 10 min ved 4 ° C.
- Vortex perler for 30 sek.
- Legg 50 ul / ml perler.
- Inkuber i 5 min ved 4 ° C.
- Fyll opp med EasySep buffer for å fullføre volum på 2,5 ml. Løsningen ser nå brunaktig.
- Sett inn magnet.
- Vent i 2,5 min ved RT. I løpet av denne tiden ikke-monocyttisk celler bundet til magnetiske kuler vil bevege seg til rørveggen og holde fast der.
- Hell buffer med ikke-bindende monocytter inn i frisk sterilt rør. Denne løsningen ser hvitaktig.
- Vask en gang med PBS + 0,02% EDTA og sentrifuger i 10 min, 120 x g.
- Plate celler i en plastisk tallerken eller multiwall plate ved en densitet på 0,5 x 10 6 / cm 2. Tilsett 1 ml vekstmedium / 1 x 10 6 celler.
- Kultur celler under forhold av interesse for 6-14 dager.
- Endre media etter 3 dager ved å erstatte 50% av media med friske medier (se tabell 1 for detaljer).
- Etter seks dager høste celler for mRNA isolert, flowcytometri, Western blotting, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hjelp av protokollen beskrevet ovenfor, vi rutinemessig innhente 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml blod (gjennomsnitt ± standard feil fra 26 uavhengige eksperimenter, figur 1A). Monocyte renhet som bestemmes av flowcytometrisk farging for CD14 er rutinemessig større enn 95% (97,1 ± 0,4%, gjennomsnittlig ± standard feil fra tre uavhengige eksperimenter, Figur 1B). Cellelevedyktighet nylig isolerte monocytter som bestemt ved trypan blå farging er rutinemessig høyere enn 95% (data ikke vist). Mens utgangspunktet celler er avrundet og flottør, de vanligvis begynne å følge i løpet av få timer. Tilslutning er forbundet med en form for bevegelse mot en "stekt egg" eller spindel-lignende form (figur 2). Etter seks dager i kultur med M-CSF (100 ng / ml) med eller uten tilsetning av oksidert LDL (100 ug / ml for de siste 24 timer) ble omtrent 80% av cellene som ikke var eksponert til oxLDL er levedyktige, mens treatment med oxLDL resulterte i omtrent 70% levedyktige celler (figur 3). Flow-cytometri etter seks dagers dyrking med M-CSF viser at selv om cellene beholde uttrykker leukocytt markør CD45RO, nedregulere de monocytt markør CD14 (figur 4). Spesifikke betingelser kan indusere makrofag polarisering - således-M1 eller M2-polarisert makrofager uttrykke typiske markører som IL-6, TNF-alfa-(M1) eller CD36 og CD206 (M2) (figur 5). Makrofager kan videre bli studert i funksjonelle forsøk. For eksempel kan binding av oksidert LDL bli studert ved hjelp av fluorescensmerket etiketter LDL (figur 6).
Figur 1. (A) ANTALL perifere monocytter innhentet etter negative perle isolasjon. Celle tall er normalisered for 100 ml perifert blod. Data for 26 uavhengige eksperimenter. (B) Renhet av monocytter oppnådd ved bruk av negativ vulsten isolert som bestemt ved strømningscytometri. Representant frem side spredningsdiagram og histogram av CD14 flekker, negativ kontroll vist som stiplet linje.
Figur 2. Celler etter 3 og 6 dager kultur med M-CSF. Scale bar = 50 mikrometer.
Figur 3. Levedyktigheten til makrofager etter 6 dager i kultur med M-CSF eller etter 6 dager i kultur med M-CSF og oxLDL (100 mikrogram / ml) tilsatt for den siste 24-timers som bestemmes av propidium jodid (PI) farging. Representant frem side scAtter tomter og histogrammer for PI farging.
Figur 4. Flowcytometri for monocyte markør CD14 på nylig isolerte lymfocytter eller blodmonocyttavledede makrofager etter seks dager i kultur med M-CSF (100 ng / ml).
Figur 5. Gene ekspresjon av IL-6, TNF-a, CD36 og CD206 (mannose-reseptor) i primære humane makrofager differensiert med M-CSF (100 ng / ml, 6 dager), og den polariserte mot en M1 fenotype (LPS, 100 ng / ml , var-og IFN-y, 20 ng / ml, til den siste 18 timer) eller M2 (IL-4, 20 ng / ml i de siste 18 timer). Genuttrykkmålt ved kvantitativ PCR. * P <0,05, ** p <0,01.
Figur 6. (A) Immunfluorescens bilde av M-CSF-induserte makrofager humane makrofager. Celler ble eksponert for 10 ug / ml DII-merket oxLDL i 4 timer. Atomkjerner ble farget med DAPI. Scale bar = 50 mikrometer. (B) Representant histogram av flowcytometrisk måling av DII-oxLDL opptak av M-CSF-indusert menneskelige makrofager. Grå = ubehandlet kontroll, svart linje = oxLDL-behandlede makrofager.
| Type | Forhold | Refs |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2a |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2B |
| 8 |
| M2C |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-Hb |
| 11 |
| M-ox | 12 | |
| Andre makrofag typer |
| 13 |
Tabell 1. Eksempel på forhold og typiske markører for etablerte M1 eller M2 makrofag polarisering typer (se referanser for konkrete isolasjon prosedyrer eller cellekultur forhold).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
, Blodmonocyttavledede makrofager representerer nøkkelen celletype av det medfødte immunsystemet. De spiller en viktig rolle i mange inflammatoriske sykdommer omfattende aterosklerose eller kreft 2.. Således studere makrofag biologi er viktig for å øke vår kunnskap på patofysiologien for en rekke sykdommer og for å tillate utvikling av nye behandlingsformer.
Mange studier gjelder mus modeller overekspresjon eller mangler visse gener av interesse. I tilfelle av, blodmonocyttavledede makrofager, synes dette ikke den beste måten for å studere prosesser relevante for menneskelig sykdom som det er store forskjeller mellom murine og humane monocytter og monocytt-avledede celler 4. Dermed gyldige modeller gjør bruk av primære humane celler synes et godt alternativ for å studere sykdom-relevante mekanismer for makrofag differensiering.
En klar fordel med den in vitro-modellen som er presentert her, er at den ikke er avhengig av immortalized cellelinjer som THP-1 eller andre 14-15. Mens cellelinjer kan være lett skaffes og omgå behovet for regelmessig blodprøver, cellelinjer er fenotypisk og funksjonelt ikke identisk med primære celler. Dermed Cho et al. Har sammenlignet genet signaturer av primære humane makrofager og sammenlignet dem med tidligere publiserte data fra THP-1 12,14. De fant en signifikant, men moderat sammenheng mellom begge celletyper som tyder på at THP-1 celler ikke kan være den ideelle modell for å studere macrophage differensiering og heterogenitet i mange tilfeller. Dessuten er det ulike modeller hvordan å skille ikke-heftende monocyte-lignende THP-1 celler mot makrofager. Selv når du bruker nok mest aktuelt protokoll der THP-1 celler er behandlet med PMA etterfulgt av fem dager hvile i kultur uten PMA (PMAr), gjør cellene ikke helt oppfører seg som primære celler 16. Samlet utgjør disse funnene tyder på at for studiet av menneskelig sykdommekanismer på cellenivå, primære makrofager synes mer egnet enn cellelinjer.
Man må være oppmerksom på andre metoder som tillater isolering av primære humane monocytter: tilslutning til plast, positiv perle isolasjon, eller motstrøm sentrifugering elutriation 17. Den monocyte berikelse cocktail brukt her inneholder antistoffer mot CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin A og dekstran-belagte magnetiske partikler. Disse antistoffene binder seg til epitoper på leukocytter andre enn monocytter som så kan bindes de magnetiske partiklene og holdes i røret av det magnetiske felt, mens alt ubundet monocytt kan overføres inn i et andre rør. Videre inneholder berikelse cocktail antistoff til humane Fc-reseptorer (som er sterkt uttrykt av monocytter) som hindrer at ikke-spesifikk binding til monocytter. Følgelig gir fremgangsmåten presentert her "urørte" ikke-aktiverte monocytter med en høy grad av renhet.
Det er noen punkter som må holdes i bakhodet når du søker denne modellen. Ficoll / Histopaque sentrifugering bør utføres ved romtemperatur. EDTA i vaskebufferen jegs er nødvendig for å inhibere integrin-avhengig binding av blodplater til monocytter. Det er viktig å frø monocyttene til riktig tetthet for å oppnå optimal differensiering. Begge seeding monocytter for løst eller for tett resultater i suboptimal vekst og differensiering. Alternativer for endringene er seeding cellene på spesielle underlag eller ved hjelp av ulike vekstfaktorer (f.eks GM-CSF 18) eller legge til spesifikke celle activators (f.eks cytokiner eller 8 LPS, Tabell 1).
Ved hjelp av celler oppnådd fra forskjellige individer kan resultere i en større grad av variasjon om spesifikke cellulære funksjoner. Således, Martin-Fuentes et al. Har vist at, blodmonocyttavledede makrofager fra forskjellige individer vise forskjellige kapasiteter av LDL-opptak 19.. Interessant, disse forskjellene være stabilt over tid tyder på at variasjonen mellom celler fra forskjellige givere er ikkepå grunn av forskjellige eksperimentelle betingelser, men snarere gjenspeiler de enkelte genetiske eller epigenetisk forskjeller. På den ene side krever dette større variasjon større antall for å oppnå signifikante resultater i spesifikke eksperimentene som oxLDL uptake. Derimot, disse forskjellene også at forskere å studere forskjeller mellom friske og syke individer på cellenivå og dermed avsløre nye sykdomsmekanismer.
Totalt sett er protokollen som er beskrevet her enkel å bruke, reprodusere, og nyttig å få ekstremt rene monocytter populasjoner som kan da bli differensiert mot makrofager. Avhengig av kultur forholdene, kan ulike typer, blodmonocyttavledede makrofager bli studert tillater identifikasjon av spesifikke fysiologiske eller patofysiologiske prosesser som er relevante for human sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne trenger ikke å avsløre noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Nadine Wambsganss for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) og delvis av en bevilgning fra Innovation Fund FRONTIER (University of Heidelberg) til CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
