הנוזל השדרתי חדרית (CSF) רוחץ את בתאים קליפת מוח neuroepithelial ומוחות במהלך ההתפתחות המוקדמת של מוח בעובר. כאן אנו מתארים שיטה שפתחה לבודד CSF חדרית מעוברים מכרסמים בגילים שונים כדי לחקור הפונקציה הביולוגית שלה. בנוסף, אנו מדגימים נתיחתנו מוחות קליפת מוח explant וטכניקת התרבות שמאפשרת לצמיחת explant עם כמויות מינימאליות של תרבות בינונית או CSF.
CSF הוא נוזל מורכב עם Proteome דינמי משתנה לאורך התפתחות ובבגרות. במהלך התפתחות עוברית, CSF המתהווה מבדיל ממי השפיר על סגירתו של הצינור העצבי הקדמי. נפח CSF ואז מגביר את הימים הבאים כבתאים neuroepithelial מרפדים את החדרים ודמו עין המקלעת ליצור CSF. את מגעי CSF העובריים, משטח חדרית האפיקלי של תאי גזע העצביים של המוח המתפתח וחוט שדרה. CSF מספק לחץ נוזל חיוני להרחבת המוח המתפתח ומפיצת צמיחה חשובה לקידום גורמי בתאים עצביים באופן זמני ספציפי. כדי לחקור את תפקידו של CSF, חשוב לבודד דגימות טהורות של CSF העוברי ללא זיהום מדם או רקמות telencephalic פיתוח. כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד דגימות יחסית טהורות של חדרית העוברית CSF שיכולים לשמש עבורמגוון רחב של מבחנים ניסיוניים כולל ספקטרומטריית מסה, אלקטרופורזה חלבון, ותא ותרבות explant העיקרית. אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות explants קליפת המוח על קרומי פוליקרבונט נקבוביים במטרה לגדל רקמת קליפת המוח מתפתח עם נפחים מופחתים של תקשורת או CSF. בשיטה זו, ניסויים יכולים להתבצע באמצעות CSF מגילים או מצבים שונים כדי לחקור את הפעילות הביולוגית של CSF Proteome על תאי המטרה.
CSF הוא נוזל מורכב שרוחץ neuroepithelium פיתוח 1-6 ומספק 7 חיוניים לחץ וקידום צמיחת אותות למוח המתפתח 8-12. ללמוד CSF במהלך התפתחות מוח, פתחו טכניקות לבודד CSF חדרית מלפתח עוברי חולדה או עכבר במהלך שלבים שונים של פיתוח 6,9. שיטות קודמות של בידוד כללו שימוש בזכוכית מייקרו מחט ובידוד CSF באמצעות מייקרו הזרקת 1,2. השיטה שלנו מנצלת כוס טפטפה מייקר נימי טיפ שכבר משך ליצור נקודת ultrafine לחדירת רקמה משופרת. הכוס טפטפה מייקר הנימים מחובר לaspirator כך ניתן לשלוט שבאוסף CSF חדרית עם שינויים עדינים בלחץ. כדי לחקור את ההשפעות של תאי הגזע של אותות CSF, אנו מחלקים explants קליפת המוח, מניחים אותם על קרומי פוליקרבונט, ולהציף אותם במ"ק המתאיםבינוני lture השלים עם דגימות CSF 9. בעזרת טכניקה זו, נפחים נמוכים של תקשורת מספיקים לתרבות הרקמה, המאפשרים ניצול יעיל של 9 CSF.
השיטה שתוארה לאוסף CSF חדרית הניבה דגימות יחסית טהורות של CSF העוברי עם הרכב יציב חלבונים ובפעילות עקבית במספר המבחנים סלולריים 9. עם טכניקה טובה וגודל אוסף המלטה של 10 E14.5 עכברים, ניתן לצפות לאיסוף 10-15 μl של CSF, ומהמלטה של E16 חולדות, ניתן לצפות לאיסוף על 50-90 μl של …
The authors have nothing to disclose.
אנו אסירי תודה לתמיכה מ-NIH (מספרי הפרס R00 NS072192 לMKL, HD029178 לAS.L., ו 2 RO1 NS032457 לCAW). MKL הוא הנמען של מלגה בבית החולים לילדים בבוסטון פיתוח קריירת המלגה / הספר לרפואת הארוורד שור ועמית פ אלפרד סלואן הקרן. CAW הוא חוקר של הווארד יוז הרפואי במכון.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |