Summary
O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explantes com volumes mínimos de meio de cultura ou do LCR.
Abstract
A CSF é um fluido complexo, com uma proteoma dinamicamente variáveis ao longo do desenvolvimento e na idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, a CSF nascente diferencia do líquido amniótico no fechamento do tubo neural anterior. Volume de LCR, então aumenta ao longo do dia subsequentes como as células progenitoras gliais que revestem os ventrículos e plexo coróide gerar CSF. Os contactos embrionárias CSF a superfície apical ventricular, das células estaminais neurais do cérebro e da medula espinal em desenvolvimento. CSF fornece pressão de fluido crucial para a expansão do cérebro em desenvolvimento e distribui crescimento importante promover factores de células progenitoras neurais de uma forma temporal específico. Para investigar a função do LCR, é importante isolar amostras puras de CSF embrionário sem contaminação a partir do sangue ou do tecido em desenvolvimento telencefálica. Aqui, nós descrevemos uma técnica para isolar amostras relativamente puras de ventricular embrionário CSF que podem ser usados parauma vasta gama de ensaios experimentais, incluindo a espectrometria de massa, electroforese de proteínas, e de células e cultura de explantes primários. Demonstramos como dissecar e cultura explantes corticais em membranas porosas de policarbonato para crescer desenvolvimento do tecido cortical com volumes reduzidos de mídia ou CSF. Com este método, as experiências podem ser realizadas utilizando CSF a partir de diferentes idades ou condições para investigar a actividade biológica do proteoma CSF nas células-alvo.
Introduction
A CSF é um fluido complexo que banha o neuroepitélio desenvolvimento 1-6 e fornece 7 pressão essenciais e promover o crescimento pistas para o cérebro em desenvolvimento 8-12. Para o estudo da CSF ao longo do desenvolvimento do cérebro, desenvolvemos técnicas para isolar CSF ventricular de desenvolvimento de embriões de rato ou mouse durante vários estágios de desenvolvimento 6,9. Os métodos anteriores de isolamento incluiu o uso de um vidro de micro-agulha e isolando o CSF utilizando um micro-injector 1,2. O nosso método utiliza uma pipeta de vidro de micro-capilar, cuja ponta foi puxado para criar um ponto de penetração do tecido ultrafinas melhorada. A pipeta de vidro de micro-capilar é ligado a um aspirador, de modo que recolha CSF ventricular pode ser controlada com mudanças suaves de pressão. Para investigar a influência de células-tronco de sinais LCR, dissecamos cerebrais corticais explantes, colocá-los em membranas de policarbonato, e flutuar-los no cu apropriadasLTURE meio suplementado com 9 amostras de LCR. Com esta técnica, uma redução dos volumes de meios de cultura são suficientes para o tecido, o que permite um uso eficiente da CSF 9.
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Protocol
1. Isolamento embrião / Preparação
Esta técnica pode ser usada para ratinho ou rato. Neste protocolo que demonstram a técnica de coleta de LCR e dissecção explante cortical cerebral com o cérebro de rato embrionário. Vamos comentar sobre eventuais diferenças importantes para ratos contra ratos que existem dentro das técnicas gerais. Para o sistema de teste idade embrionária, E1 é classificado como o dia da ficha para ratos, E0.5 e é classificado como o dia da ficha para os ratos.
- Prepare um prato micro dissecção Sylgard com elastômero de silicone. Elastómero de Silicone Sylgard 184 é fornecido como um componente do líquido de duas partes, Parte A e Parte B. Parte A e Parte B são misturadas numa proporção de 10:1 em peso ou volume. Depois que os componentes líquidos são misturados, despeje o elastómero Sylgard em uma placa de Petri para cobrir toda a superfície do prato. Algumas bolhas de ar podem estar presentes que irá dissipar durante o processo de cura. Colocar a tampa no prato de Petri e permitir que o elastomer de curar. O elastómero pode ser curado à temperatura ambiente, durante 24 horas, ou a temperaturas mais elevadas (por exemplo 37 ° C) para uma mais rápida secagem. Uma vez que os componentes líquidos solidificar, o prato de dissecação está pronto para usar. O prato pode ser usado repetidamente por várias experiências, desde que seja feita bem após o procedimento.
- Preparação da pipeta micro-capilar (agulha). Micro-pipetas capilares são preparados pela aplicação de calor e puxar usando um extrator micropipeta Narishige PC-10 vertical com as seguintes configurações: Um puxão passo; Aquecedor # 2 ajustado para 58, 100 g de peso tração. A ponta fina da micropipeta é cuidadosamente agarrado fora usando finas # 55 fórceps. O diâmetro médio resultante interior da agulha é de 85 ^ m.
- Prepare a montagem aspirador de aspiração CSF. Insira micro-êmbolo provida de micro-pipetas capilares para dentro da agulha capilar. Alternativamente, anexar um filtro de plástico descartável para a extremidade do conjunto do tubo de aspiração que está ligado to o micro-pipeta capilar. Empurrar a agulha através da junta para a posição na extremidade oposta do conjunto do aspirador.
- Transferência de embriões isolados da maca para um prato dissecção micro-preparado com Sylgard.
- Remover as membranas extra-embrionárias e os tecidos de modo a que o embrião é claramente exposto. Cada tecido camada primeiro parede uterina e depois o. Decídua-pode ser dissecada com uma tesoura Iridectomia finas (Ferramentas Ciência ou seja Belas # 15000-02) Em cada local de implante, por um lado à parede do útero, em seguida, a decidua pode ser feita uma incisão paralela ao eixo longitudinal do útero, e a incisão pode então ser aberta ainda utilizando fórceps finos. A decídua pode ser removido depois de uma incisão semelhante, expondo as membranas fetais. Deve haver cuidado para que as membranas fetais não são incisão ou perfurado.
- Lavar com solução estéril de sal equilibrada de Hanks (HBSS) e remover o excesso de fluido que envolve o embrião, utilizando uma pipeta, bem como um filtro ou Kimwipepapel cortado em triângulos.
2. Colecção ventricular CSF
- Visualize embrião sob o microscópio de dissecção: para rato, o embrião deve ser deitado de lado, de tal forma que se tem uma vista sagital do embrião em desenvolvimento. Com embriões de ratos E16 ou mais, posicionar o embrião em sua coluna dorsal, ao longo de sua maior dimensão planar, a partir de um crânio com a direção caudal, como se o embrião está deitado de costas. Deste modo, o LCR pode ser recolhida a partir tanto da direita e da esquerda do ventrículo lateral.
- Firmemente inserir a pipeta micro-capilar para o ventrículo lateral, ventrículo mesencefálico ou cisterna magna, na tentativa de não contacto com as células neuroepiteliais uma vez que a pipeta foi inserida. Para os embriões de rato E14.5, ou mais, o LCR pode ser aspirado a partir do ventrículo direito e, em seguida, a agulha retirada e inserido no ventrículo esquerdo. Por causa da permeabilidade dos ventrículos e do tubo neural em embriões com menos de E14.5, ovolume de CSF inteira pode muitas vezes ser aspirado a partir dos ventrículos laterais com uma inserção de agulha única. No entanto, este não é sempre o caso, como tempos de desenvolvimento e de permeabilidade dos ventrículos de ligação pode variar ligeiramente, e, por conseguinte, o micro-pipeta capilar também pode ser inserido na cisterna magna de recolher o volume máximo CSF.
- Uma vez que a micro-pipeta capilar é inserido no ventrículo lateral, ventrículo mesencefálico ou cisterna magna, com cuidado e gentilmente comecem aspiração do CSF para a pipeta, utilizando o micro-êmbolo para criar pressão negativa e aspirar o LCR, ou fornecendo uma suave pressão negativa criada pela boca de modo que começa a CSF suavemente fluir para dentro da pipeta micro-capilar, de forma lenta e controlada. Recomendamos que o espectador verifica com seus próprios funcionários locais sobre as políticas institucionais sobre essas abordagens.
- Continuar a aplicar pressão negativa e recolher o CSF na pipeta micro-capilar.Em ambos os embriões de ratinho e rato de E16.5/E17 ou menos, é possível observar o colapso do ventrículo ligeiramente pelo aparecimento de um torrão formando no lado da cabeça do que a pipeta micro-capilar é dentro Em embriões mais velhos, devido ao aumento do tamanho do cérebro, pode não ser possível observar a cabeça em colapso.
- Parar de aplicar a pressão e remover suavemente a pipeta micro-capilar do ventrículo lateral.
- Suavemente expelir a amostra do LCR para um tubo Eppendorf que foi arrefecida em gelo.
- Continuar a recolher a CSF de uma ninhada inteira de animais e piscina as amostras no mesmo tubo.
- Centrifugar a 10.000 xg a 4 ° C durante 10 minutos para remover quaisquer células contaminantes.
- Analisar as amostras para detectar quaisquer sinais de contaminação de células neuroepiteliais e células vermelhas do sangue. Sinais de contaminação são geralmente indicados pelo fluido que aparece turvo ou vermelho / rosa, ou a presença de uma pastilha com uma mancha de sangue tingido. Após a centrifugação, o CSF podem ser analisados microscopicamente para qualquer evidência de células ou detritos celulares. Se houver sinais de contaminação do fluido deve ser descartada. Como um controle adicional, o teor de pellet pode também ser coradas para células. Uma amostra de CSF limpo pode ser utilizado para cultura de células, a cultura cortical, espectrometria, western blot, ELISA, e outros ensaios. O CSF clara deve ser transferido para um novo tubo Eppendorf estéril. A amostra pode agora ser utilizado para análise, combinada com as outras amostras, ou de snap congelados com azoto líquido e armazenado a -80 ° C. A congelação e descongelação de amostras pequenas de fluido pode resultar numa diminuição do volume pequeno e alterações na concentração de proteína. Isto pode ser evitado através de secagem por congelação das amostras.
3. Dissecção Explante cortical
- Transferir o embrião E14.5 isolado da maca em um prato de micro-dissecção preparado com Sylgard.
- Remover embrião de membranas extra-embrionárias e dos tecidos, tal como descrito no passo 1.5. <li> Lavar com solução estéril de sal equilibrada de Hanks (HBSS) e remover o excesso de fluido que envolve o embrião usando uma pipeta.
- Dissecar através da região cervical separação da cabeça do resto do embrião (figura 1A).
- Usando um bisturi fino (faca oftálmica), cortar a linha média do couro cabeludo. Agarrar cada um dos lados da incisão com uma pinça fina e remover a pele. Em seguida, use uma tesoura Iridectomia para fazer uma incisão que percorre toda a extensão da linha média do crânio em desenvolvimento. Subsequentemente, fazer duas incisões adicionais, cerca de 1/3 da distância das extremidades anterior e posterior do crânio em desenvolvimento. Use uma pinça fina para segurar as "abas" do crânio que resultam desta parte da dissecação, e remover o tecido em desenvolvimento crânio, expondo o córtex (Figura 1B).
- Usando o cérebro bisect bisturi ao longo da linha média do plano médio-sagital, separando os hemisférios direito e esquerdo corticais (Figuras1B, C). A pia-aracnóide e são deixados ligados ao córtex, e na dura-máter é removido juntamente com o crânio em desenvolvimento.
- Prepare cada hemisfério cortical separadamente. Coloque o lado medial do hemisfério acima de modo que você pode ver a eminência ganglionar e do córtex em desenvolvimento (Figuras 1C, D).
- Usando o bisturi, faça uma incisão coronal através do neuroepitélio cortical caudal para o bulbo olfativo desenvolvimento. Esta incisão deve começar no limite anterior das eminências lateral e medial ganglionares, e se estendem através da região cingulado anterior do rudimento desenvolvimento cortical (Figura 1E).
- Faça outra incisão coronal apenas caudal ao limite posterior da eminência ganglionar laterais (Figura 1F). Esta incisão também deve estender a partir do limite lateral da eminência ganglionar para a parede medial do rudimento desenvolvimento cortical.
- Retrair a cortical "flap" created pelas duas incisões feitas em passos de 3,7 e 3,8, usando um bisturi ou pressão de um fluxo suave de HBSS entregues com uma pipeta de 200 uL para evitar danos mecânicos ao córtex. Em seguida, fazer uma incisão transversal ao longo do limite que separa a eminência ganglionar lateral, a partir do córtex em desenvolvimento (Figuras 1G, H). Então, dissecar afastado do hipocampo em desenvolvimento e bainha cortical do telencéfalo medial, no vértice do neocórtex, onde a superfície cortical lateral encontra a parede inter.
- Fazer uma incisão transversal ao longo do limite que separa a eminência ganglionar lateral, a partir do córtex em desenvolvimento (Figura 1H).
- Remover qualquer tecido extra que é dissecado na placa a partir do explante Sylgard dissecados cortical. Pode-se usar pipetagem suave com tampão HBSS fresco para pipetar fora qualquer tecido extra dissecados. O córtex dissecado agora é com o lado meníngea voltado para baixo (Figura 1I).
- Prepara-se uma laçada de fio de platina ligado a uma pipeta de vidro. Aquece-se a pipeta de vidro com um fio de platina dobrada inserida na extremidade da pipeta de vidro. Por torção da extremidade do laço de fio de platina, o tamanho do laço pode ser aumentado ou diminuído, e o ciclo pode ser moldada para se ajustar ao tamanho do explante desejado. (Isto pode ser preparado antecipadamente e reutilizados.)
- Aquece-se a extremidade do fio de platina para esterilizar o circuito.
- Isolar o explante dissecados cortical e remova a mídia HBSS extras por pipetagem suave, deixando uma pequena quantidade para usar com a alça de arame.
- Coloque de 1 cm de membrana de policarbonato de 4 cm de diâmetro prato de imagem.
- Usando o lado da laçada do fio de platina, suavemente virar o córtex, de modo que o lado virado para cima está meníngea.
- Levantar o explante cortical fora do prato de dissecação, ao colocar o explante no meio do ciclo e com as forças hidrostáticas intrínsecaslevantar o explante em uma superfície plana.
- Coloque suavemente o explante sobre a membrana de policarbonato, e levantar a alça de fio de platina longe de tal modo que o explante permanece na membrana em uma superfície plana com a superfície ventricular fazendo contacto com a membrana.
- Levantar suavemente a membrana e pipetar 50 uL de CSF ou outros meios de comunicação com a membrana.
- Cobrir a placa de imagem, coloque-o num recipiente secundário humidificado, e incubando a 37 ° C em CO2 a 5% durante 24 h para suportar a proliferação de células e crescimento contínuos explante. Figura 2 representa um diagrama esquemático do prato preparação cortical do explante final.
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Representative Results
A coleção CSF deve produzir um líquido claro e transparente. Não deve haver qualquer evidência de contaminação do sangue, como foi demonstrado por um fluido tingido vermelho ou amarelo no aspirado e no tubo de Eppendorf. Também deve haver nenhuma evidência de tecido aspirado e no tubo de Eppendorf. Quando o CSF é centrifugado, pode-se igualmente avaliar a CSF microscopicamente para assegurar que não existe contaminação. Se houver sinais de contaminação, o QCA deve ser descartada. De uma ninhada de rato E14.5, se pode antecipar coleta 10-15 CSF ul. Tabela 1 apresenta valores médios de CSF coletados de crias média em ambos os camundongos e ratos de diversas idades embrionárias. Quando as amostras de LCR puras foram recolhidas, o LCR pode ser analisada utilizando um número de técnicas diferentes. Figura 3 mostra um gel corado com prata utilizando 2UG representante de rato E14.5 CSF.
Cerebrais corticais explantes podem ser cultivadas sagacidadeh variando os volumes de CSF, mais um meio basal, se necessário, de modo a que o volume total é de 50 pL. Figura 4 mostra explantes cultivados representativos com 50 ul de 100% embrionário CSF durante 24 horas. Os explantes foram mostrados para sobreviver e proliferar com CSF de 100% e tem a histologia do tecido semelhante aos embriões de roedores com a mesma idade gestacional 9, tal como indicado pela imunorreactividade ao fosfo-histona H3 (PH3), um marcador de divisão celular, ao longo do ventrículo superfície, BrdU, um marcador da síntese de ADN, incorporação ao longo da zona ventricular e TUJ1, um marcador neuronal, no desenvolvimento de placa cortical.
| Sprague Dawley ninhada Idade embrionárias | Volume por ninhada | CD1 Idade ninhada embrionárias | Volume por ninhada |
| E13 | 30-50 ul | E10.5 | 15-20 ul |
| E14 | 40-75 ul | E12.5 | 15-20 ul |
| E16 | 50-90 ul | E14.5 | 10-15 ul |
| E18 | 40-75 ul | E16.5 | 5-10 ul |
Tabela 1. Volumes médios de líquor obtido a partir de padrão Ninhadas porte.
Figura 1. Esquemático que Dissecção Explante cortical cerebral.
Figura 2. Diagrama esquemático de Preparação do prato final.
Figura 3. Prata mancha de rato E14.5 CSF. Esta é uma mancha de prata representante 2UG proteínas do rato CSF E14.5 executado em 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel gradiente de Invitrogen. Coloração de prata feito com SilverQuest kit de coloração de prata desenvolvido durante 5 min 40 sec.
Figura 4. E15 explantes corticais de ratos cultivados durante 24 h. Estas são imagens representativas dos explantes cerebrais corticais cultivados durante 24 horas em 100% embrionário CSF. Estes explantes foram fixadas pelo método de Carnoy, parafina seccionado, e preparado para a imunocoloração. PH3 (vermelho), e TUJ1 (verde), BrdU (azul).
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Discussion
O método descrito para a recolha ventricular CSF produziu amostras relativamente puras de CSF embrionário com composição e actividade da proteína estável consistente em uma série de ensaios celulares 9. Com uma técnica boa coleção e tamanho de leitegada de 10 E14.5 ratos, pode-se esperar para coletar 10-15 ul da CSF, e de uma ninhada de ratos E16, pode-se esperar para coletar cerca de 50-90 ul da CSF. Esta técnica minimiza a contaminação a partir de recolha de sangue e de tecidos, por meio de observação cuidadosa, centrifugação e descarte de amostras com nenhuma evidência de fragmentos celulares ou tinge de sangue. Analisamos a fluido microscopicamente para avaliar a detritos celulares ou células dentro do CSF, após a centrifugação, e descobriram que as amostras que não têm nenhum sedimento após centrifugação são livres de contaminação celular. Em contraste com o proteoma do tecido cerebral em desenvolvimento ou em amostras de CSF contaminado (dados não mostrados), utilizando-se este método de extracção CSF,o proteoma CSF não continha quaisquer proteínas mitocondriais quando analisados com um espectrómetro de massa 6.
Com base na localização física do CSF ventricular dentro das vesículas telencefálicos e tubo neural, o único método de isolamento é a furar através da pele em desenvolvimento, crânio e telencéfalo. Assim, a inserção da agulha através destes tecidos é uma fonte de contaminação possível. A ponta da agulha deve ser tão fina quanto possível, de tal modo que a agulha pode ser inserida sem problemas através do tecido e para o ventrículo. A pipeta micro-capilar pode recolher o tecido no interior do furo da agulha durante a inserção da agulha para dentro do ventrículo. Dependendo da idade do embrião, e se o plexo coróide se desenvolveu no interior do ventrículo, é importante não aspirar conteúdo do plexo coróide para a pipeta. No entanto, é importante criar uma pressão negativa suficiente para que a CSF recolhe em tele pipetar, sem perturbar o tecido cerebral circundante desenvolvimento ou do plexo coróide. A presença de contaminação dos tecidos podem ser visualizadas ao microscópio de dissecação, pipetando CSF numa lâmina de vidro com uma tampa de vidro deslizante e directamente para visualizar os restos celulares.
Os métodos que descrevemos para isolamento CSF fornecer amostras relativamente puras de CSF como já determinado a data. Quando as amostras de LCR conhecido contaminados foram analisadas utilizando espectrometria de massa, que revelaram a presença de proteínas mitocondriais (dados não mostrados). Uma falha inerente na técnica é que o LCR é obtido através de punção do crânio em desenvolvimento e córtex, e, por conseguinte, as células e os tecidos pode estar presente no CSF. Por centrifugação do CSF, o ensaio para um pellet, e analisar microscopicamente o CSF sob o microscópio, temos aperfeiçoado um método para o isolamento de amostras de CSF que produz relativamente puras de CSF.
A técnica de fou ventricular embrionário CSF recolha e cerebrais corticais explantes tem sido descrito e mostrado no filme para um rato embrionário. No entanto, esta técnica pode ser utilizada para a recolha ventricular do LCR e cerebrais corticais a partir de explantes de todos os roedores embrionárias e foi aplicado a ambos os ratos e ratinhos. O método descrito no presente protocolo foi concebido especificamente para o isolamento de CSF ventricular, e não se destina para a recolha de CSF no espaço subaracnóideo.
A técnica de explantes corticais cerebrais foi criado para ser capaz de crescer explantes com um volume reduzido de meios de comunicação, tendo em conta as quantidades limitadas de CSF embrionário disponível para experiências individuais. O menor volume de meio utilizado para cultivar explantes com fiabilidade durante 24 horas foi de 50 ul. Ocasionalmente, foram cultivados por mais de 24 horas, com o mais longo período sendo 72 hr. Com as experiências mais longas, é melhor para complementar os meios de crescimento a cada 24 hora. Uma vez que os explantes de are cultivadas durante o período de tempo desejado, os explantes podem ser usados para uma série de ensaios diferentes, incluindo imunofluorescência, gerando neuroesferas, a morte celular, ou a extracção de ARN.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Estamos gratos pelo apoio do NIH (números Prêmio R00 NS072192 para MKL, HD029178 para AS.L., e 2 RO1 NS032457 para CAW). MKL é o destinatário de Boston das Crianças Carreira de Desenvolvimento da Irmandade Hospital / Harvard Medical Fellowship Shore School e membro da Fundação Alfred P. Sloan. CAW é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
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