Summary
光声膀胱造影（PAC），膀胱，辐射敏感的内部器官在儿科患者中，映射，而无需使用任何电离辐射或有毒造影剂具有很大的潜力。在这里，我们演示了如何使用一个注射的光学不透明示踪剂在大鼠尿膀胱映射PAC
Abstract
常规小儿膀胱造影诊断X射线，这是基于使用不透射线的染料，遭受电离辐射的有害使用。由于暴露于辐射的儿童的膀胱癌的风险比许多其他癌症更重要。在这里，我们展示了非电离和非侵入性光声成像（PA）的膀胱，称为光声膀胱造影（PAC）的可行性，利用近红外（NIR）光吸收剂（ 即亚甲基蓝，电浆黄金纳米结构，单壁碳纳米管）的光学混浊示踪剂。我们已经成功地成像大鼠膀胱充满了用暗视场共焦PAC系统的光吸收剂。大鼠膀胱经尿道注射造影剂后，取得显著PA信号增强photoacoustically可视化。积累验证由光谱PA成像。此外，通过只用一个激光脉冲能量小于1兆焦耳/厘米2（1/20的安全限度的），我们目前的成像系统可以映射在体内在生物组织中的深度超过1 cm的亚甲基蓝填充大鼠膀胱。无论是在体内和体外 PA成像效果验证，造影剂通过小便自然排出。因此，不存在关切长期毒性剂的积累，这将有利于临床翻译。
Introduction
X射线膀胱造影1的成像过程中，以确定有关的膀胱疾病，如膀胱癌，膀胱输尿管回流，输尿管阻塞，神经原性膀胱， 等 。2-5通常情况下，尿空隙和一个无线电不透明剂，通过注入导尿管。然后，透视X射线图像采集划定尿膀胱。然而，关键的安全问题是，此过程中使用有害的电离辐射。累积的患癌症的风险的百分比75岁时由于诊断X射线范围从0.6至1.8％。6此外，致癌性的威胁是在儿童患者中具有重要意义。英国的一项研究表明，在9个主要内脏器官，平均每年诊断X射线辐射剂量最高的女性儿童的膀胱小于4和第二最高的男性儿童小于4 7这表明膀胱癌的风险。在儿科患者中最重要的。 Alt键霍夫儿科放射科医师努力以减轻辐射的暴露率，合理实现，电离辐射可低至不能完全排除。因此，限制创建完全辐射，敏感，具有成本效益，和高分辨率成像方式与非放射性造影剂在膀胱造影需要。
近日，光声断层成像（PAT）已成为首屈一指的生物医学成像方式，因为PAT可以提供强大的光学吸收的对比和高超声波在生物组织中的空间分辨率。8 PAT的原理是，超声波引起的热弹性膨胀的目标然后由光吸收。通过检测时间分辨的声波通过的介质，二维或三维的光声（PA）的图像形成。由于超声（US）要少得多组织中散射光（通常为两个或三个数量级），相比的PAT成像深度可达〜8厘米组织的空间分辨率，同时保持以1/200的成像深度。9的主要优点PAT为cystographic应用包括：（1）PAT是完全不受电离辐射。 （2）ClinicalUSimaging系统可以很容易地适合于提供双模式的PA和美国的成像能力。因此，双模式的PA /美国成像系统可以比较便携，成本效益，快速，这是临床快速翻译的关键标准。使用内源性和外源性对比，PAT提供高分辨率的形态，功能，组织和分子成像研究肿瘤病理生理学，脑血流动力学变化，内脏器官，眼科，血管造影等 。10-16
在这篇文章中，我们展示了非电离光声膀胱造影实验协议（PAC）的近红外（NIR）光吸收剂（ 即亚甲基蓝，去LD纳米笼，或单壁碳纳米管）为无毒光学浑浊示踪剂。大鼠膀胱充满了造影剂photoacoustically光谱体内划定的。没有代理人坚持积累的大鼠在膀胱和肾脏。因此，这可能是由于剂积累的长期毒性可以被排除在外。这一结果意味着PAC相结合的光吸收剂可以是一个潜在真正无害的cystographic的方式为儿童患者。系统配置，系统调整，并在体内 / 体外成像程序在这篇文章中讨论。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。深层思考模式光声膀胱造影系统（PAC）
- 系统配置17，18
- A Q-开关Nd：YAG激光（SLII-10;连续532纳米）泵的波长可调谐激光器（Surelite OPO PLUS连续波长调谐范围：680至2500纳米）。
- 拍摄各激光的脉冲持续时间为〜5毫微秒，激光重复率是10赫兹。
- 依赖于所使用的造影剂的光吸收峰的波长。如果亚甲基蓝作为造影剂，使用的光波长为667 nm，其中的峰值吸收。电浆黄金纳米结构可以有可调本地化的表面等离子体共振光谱区域，根据他们的物理和化学性质。此外，单壁碳纳米管的广泛吸收光谱波长选择可以提供多种选项。
- 可调激光器的光被传递到一个球形的圆锥形晶状体吨即通过直角棱镜（PS908，Thorlabs公司）。
- 甲炸面圈状的光束图案生成球形的锥形透镜后的光穿过。自制的锥形透镜从BK7透镜和锥角为152°。透镜的直径为2.5厘米。
- 经由光学冷凝器，一个透明的丙烯酸系片材制成的炸面圈状的发散光束被重定向。的顶面和底面的直径分别为6.1和4.8厘米。冷凝器的厚度为2.5厘米。重定向的环形光束，形成一个环形的组织表面上一个黑暗的中心。
- 利用一个小的水容器，以提高声耦合。水容器底部开有明显的细光学和声学透明的聚乙烯薄膜包裹。小动物的位置下，水的容器。
- 生成的PA波检测由一个球形聚焦超声换能器（V308;奥林巴斯NDT; 5 MHz的中心频率），其被安装在中间的光学冷凝器。的换能器元件的直径和焦距分别为1.9和2.5厘米，分别。因此，换能器的F数为〜1.3。
- 横向和轴向分辨率是590和144微米，分别。
- 第一放大所检测到的PA波由一个宽带超声波脉冲发生器/接收器（5072PR奥林巴斯NDT; 35 MHz的带宽和射频增益59分贝），然后获取由示波器（TDS5054泰克）。
- 取得一维时间分辨的图像（称为A线）PA的波的到达时间测量。目前，PA的波的速度被假定为在1,480米/秒，在整个图像采集。双（被称为B-扫描）和三维PA图像可以被收购，通过机械地移动阶段（XY6060，丹纳赫多佛），线性光栅扫描。
- 的摄像的时间大约是25分钟为一个体积单波长PA图像与领域的视角（FOV）2.5倍2.4倍1.5厘米3的XYZ飞机。沿x方向，步长为0.2毫米，沿y方向与步长为0.4mm的60个样品获得125个样本。与50-MHz采样率的500个数据点，得到沿z方向。机械扫描控制的自制的NI LabVIEW软件系统。
- 的体积数据是由使用MathWorks的MATLAB软件系统的最大振幅投影（地图）。
- 系统校准
- 球形圆锥形晶状体后，确保光束模式是一个完美的环形状。如果没有正确生成的炸面圈状的波束图案，从皮肤表面PA的起源的信号占主导地位。因此，它是难以达到的深部组织的成像。
- 线状光聚焦在水中应同轴对准超声波聚焦区域。那些被同轴对准，该系统遭受低信号对信噪比。
- 在皮肤表面上照射的激光脉冲能量的变化范围为〜1 - 2毫焦耳/厘米2时，从680至1,000 nm的波长调谐时，分别。激光的脉冲能量比美国国家标准学会安全限值要低得多，为20〜80毫焦耳/厘米2以上的光谱区域，分别不同。
（2） 在体内和体外成像过程
- 动物准备
- 使用女只SD大鼠，重量为200 - 250克所有PA成像实验。
- 首先，麻醉大鼠腹腔注射氯胺酮（85毫克/公斤体重）和甲苯噻嗪（15毫克/千克）的混合物中。
- 脱毛在腹部的毛发。
- 大鼠定位一个定制的动物持有人之上。
- 外套22号导管润滑剂以改善导管插入。
- 保持导管Vertica的LLY超过尿道口。接下来，插入的导管的末端，水平，直到轮毂的导管插入尿道终于到达开口。
- 尿液在膀胱经导管无效。
- 在体内 PAC成像
- 大鼠，位于动物保持器的顶部，下面的水容器中的PAC系统的位置。
- 应用超声凝胶（SONOTECH）之间的动物的皮肤表面和塑料膜，以改善声学耦合。
- 完全汽化的异氟醚（1升/分钟的氧和0.75％的异氟烷）的体内 PA成像的实验期间使用麻醉大鼠。
- 获取控制PA图像注射造影剂前。
- 引入亚甲基蓝（0.8微升/克，浓度为30 mM的体重），合金纳米笼（1.2微升/克的浓度为2纳米的体重），或单壁碳纳米管（0.8微升/克体的水溶液重量与的浓度为0.3μM） 经导管向膀胱。用1毫升注射器用22号导管。
- 采集了一系列的PA图像。
- 体外 PAC成像
- 牺牲后大鼠体内 PAC成像，注入了过量的巴比妥。
- 取出的两个主要器官，膀胱，肾脏，调查生物分布，在玻璃板上。
- 玻璃板下面的水容器在PAC系统的位置。
- 应用超声凝胶（SONOTECH）切除器官和塑料膜之间，以改善声学耦合。
- 收购PA图像。
- Photoacoustically图像切除的器官从一个健康的老鼠作为对照。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1显示了在体内非电离的，非侵入性的PAC：使用光学混浊的亚甲基蓝（MB）。的控制PA的图像，得到在667 nm处，在峰值光吸收MB（ 图1A）。虽然视场中的血管清晰可见，膀胱是不可见的，因为在此波长是光学透明的。 图1B中所示，膀胱清楚地表明在PA获取的图像在0.2小时后喷射甲基溴。要确认的积累MB在膀胱中，我们使用两个光波长（667和850纳米）来区分膀胱充满MB从周围结构。 如图1C所示，PA膀胱内的振幅是不可见的，因为在850 nm的光吸收系数MB几乎是0。因此，此结果表明，与MB的膀胱充满。作为一个结果，它说明了光谱PA图像可以清楚地区分不同的内源性和外源性choromophores 图1D和1E显示的深度分辨PA的B扫描图像，扫描沿图1A和1B中的虚线，分别。 在体内和体外成像的超声换能器的焦点位于膀胱的顶表面。沿深度方向的膀胱的位置清楚地识别，〜3.5毫米以下的皮肤表面。此外，在24和48小时后喷射测定膀胱内的PA信号几乎相同，得到的信号在预喷射。这个结果表明，所注入的造影剂从体内被完全除去，没有代理人的累计。因此，没有长期代理毒性预计在我们的方法。此外，后喷射PA图像（ 图1B）的深度进行编码，使用图2中的伪色。 Ť他膀胱的位置是皮肤表面，以及相关的深度解析的PA B-扫描图像（ 图1E）〜3.5毫米以下。儿科膀胱的顶部和底部边界的典型的深度是1.4〜4.3厘米，分别从腹部表面。通过只用一个激光脉冲能量小于1兆焦耳/厘米2（1/20的安全限度），我们目前的成像系统可以映射在生物的深度超过1 cm的亚甲基蓝填充大鼠膀胱如我们上面提到的组织在体内 17的PAT的成像深度可达到〜8厘米的组织与亚甲基蓝的援助。
毕竟体内成像实验中，我们两大器官切除，膀胱癌和肾癌的生物分布调查。作为对照，从一个健康的大鼠膀胱和肾脏切除。于除去从两组大鼠的膀胱和肾脏的PA测量的信号几乎是一样的，Demonstrating在机关积累，没有代理。
图1。 在体内非电离和非侵入性的PAC中使用不透光的亚甲基蓝（MB）。（A）的控制PA的图像大鼠的腹部区域与一个光波长为667 nm-MB预注入收购，示出唯一的血管（BV ）。此波长的光吸收峰的MB匹配。（B）得到的PA图像为667纳米的光波长在0.2小时后经尿道前列腺注射MB，揭示BV和膀胱（BD）与MB的累计（C ）PA在850 nm MB注射后获得的图像。洋溢着MB的BD在PA图像消失，因为在这个波长的光吸收MB是最小的。（D）和（E）深度解析PA B-扫描图像切（A）及（B），分别沿虚线。转载许可文献17。版权所有2011年美国光学学会。
图2。水深编码PA彩色图像，图1B表示的深度信息。 BV，血管; BD，膀胱和MB，亚甲蓝。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
总之，我们已经证明电离PAC使用无毒的光吸收剂在大鼠模型体内的可能性。我们已经成功地拍摄到大鼠膀胱充满了非电离和非侵入性的PAC系统使用光吸收剂。在我们的方法中两个关键的安全问题已经得到解决：（1）使用非电离辐射的cystographic应用和（2）造影剂，在体内无蓄积。
我们的临床权益包括监测膀胱输尿管返流（VUR）在儿科患者。在美国约3％的儿童都受到尿路感染19，约1.5％，这些患者患有膀胱输尿管逆流。在目前的临床实践中，所有这些患者直接进行电离X射线透视成像。美国泌尿协会小儿膀胱输尿管反流的临床指引面板强烈建议尽量减少使用电离辐射儿科拍拍ients 20我们的长期目标是要监视无毒光造影剂，使用PAC结合膀胱输尿管逆流。因此，如果患者有膀胱输尿管逆流，我们预计，该注射剂将回流从膀胱到肾脏。与X-射线膀胱造影相比，PAC有一个有限的穿透深度。因此，我们的主要目标，为临床PAC是儿童患者。虽然我们目前的PAC系统的成像速度比较慢，由于机械扫描，实时临床超声系统可以很容易地适应PAC 21-27因此，这种方法提供了一个潜在的轻便和廉价的方式来访问膀胱输尿管反流监测，这是一个额外的好处。因此，我们坚信，我们的应用的可行性，临床翻译是非常高的。对于今后的研究中，它是经过测试的临床设置之前，使用光吸收剂PA膀胱输尿管反流监测将在猪模型研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
在所有的动物实验符合纽约州立大学布法罗机构动物护理和使用委员会。
什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是支持的，部分由大学布法罗分校临床和转化研究中心翻译协会和水牛城罗斯威尔公园联盟基金会，启动资金的资助在布法罗大学，IT契合创意方案的试点研究计划的资助MKE，NIPA（C1515-1121-0003）及NRF授出的教育，科学和技术部（2012-0009249）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Continuum | SLII-10 | pump laser |
| OPO laser | Continuum | Surelite OPO PLUS | tunable laser |
| Prisms | Thorlabs | PS908 | light deliver |
| Ultrasound transducer | Olympus NDT | V308 | 5 MHz |
| Ultraoundpulser/receiver | Olympus NDT | 5072PR | amplifier |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS5054 | data acquisition |
| Scanning stage | Danaher Dover | XY6060 | raster scanning |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | contrast agent |
| Rats | Harlan | Spague-Dawley | animal subject |
| Isoflourane vaporizer | Euthanex | EZ-155 | anesthesia |
| Ultrasound gel | Sonotech | Clear Image singles | acoustic coupling |
References
- Riccabona, M. Cystography in infants and children: a critical appraisal of the many forms with special regard to voiding cystourethrography. Eur. Radiol. 12 (12), 2910-2918 (2002).
- Khattar, N., Dorairajan, L. N., Kumar, S., Pal, B. C., Elangovan, S., Nayak, P. Giant obstructive megaureter causing contralateral ureteral obstruction and hydronephrosis: a first-time report. Urology. 74 (6), 1306-1308 (2009).
- Lim, R. Vesicoureteral reflux and urinary tract infection: evolving practices and current controversies in pediatric imaging. AJR Am. J. Roentgenol. 192 (5), 1197-1208 (2009).
- Scardapane, A., Pagliarulo, V., Ianora, A. A., Pagliarulo, A., Angelelli, G. Contrast-enhanced multislice pneumo-CT-cystography in the evaluation of urinary bladder neoplasms. Eur. J. Radiol. 66 (2), 246-252 (2008).
- Verpoorten, C., Buyse, G. M. The neurogenic bladder: medical treatment. Pediatr. Nephrol. 23 (5), 717-725 (2008).
- Ron, E. Let's not relive the past: a review of cancer risk after diagnostic or therapeutic irradiation. Pediatr. Radiol. 32 (10), 739-744 (2002).
- Berrington De Gonzalez, A., Darby, S. Risk of cancer from diagnostic X-rays: estimates for the UK and 14 other countries. Lancet. 363 (9406), 345-351 (2004).
- Kim, C., Favazza, C., Wang, L. V. In vivo photoacoustic tomography of chemicals: high-resolution functional and molecular optical imaging at new depths. Chem. Rev. 110 (5), 2756-2782 (2010).
- Ke, H., Erpelding, T. N., Jankovic, L., Liu, C., Wang, L. V. Performance characterization of an integrated ultrasound, photoacoustic, and thermoacoustic imaging system. J. Biomed. Opt. 17 (5), 056010 (2012).
- Akers, W. J., Kim, C., Berezin,, et al. Noninvasive Photoacoustic and Fluorescence Sentinel Lymph Node Identification using Dye-Loaded Perfluorocarbon Nanoparticles. Acs Nano. 5 (1), 173-182 (2011).
- Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J., et al. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express. 18 (4), 3967-3972 (2010).
- Kim, C., Cho, E. C., Chen, J., et al. In vivo molecular photoacoustic tomography of melanomas targeted by bioconjugated gold nanocages. Acs Nano. 4 (8), 4559-4564 (2010).
- Kim, C., Song, H. M., Cai, X., Yao, J., Wei, A., Wang, L. V. In vivo photoacoustic mapping of lymphatic systems with plasmon-resonant nanostars. J. Mater. Chem. 21 (9), 2841-2844 (2011).
- Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., Wang, L. V. Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain. Nat. Biotechnol. 21 (7), 803-806 (2003).
- Xie, Z., Roberts, W., Carson, P., Liu, X., Tao, C., Wang, X. Evaluation of bladder microvasculature with high-resolution photoacoustic imaging. Opt. Lett. 36 (24), 4815-4817 (2011).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
- Kim, C., Jeon, M., Wang, L. V.
- Homan, K., Kim, S., Chen, Y. S., Wang, B., Mallidi, S., Emelianov, S. Prospects of molecular photoacoustic imaging at 1064 nm wavelength. Opt. Lett. 35 (15), 2663-2665 (2010).
- Chang, S. L., Shortliffe, L. D.
- Stratton, K. L., Pope, J. C., Adams, M. C., Brock, J. W., Thomas, J. C. Implications of Ionizing Radiation in the Pediatric Urology. 183 (6), 2137-2142 (2010).
- Ermilov, S. A., Khamapirad, T., Conjusteau, A., et al. Laser optoacoustic imaging system for detection of breast cancer. J. Biomed. Opt. 14 (2), 024007 (2009).
- Erpelding, T. N., Kim, C., Pramanik, M., et al. Sentinel lymph nodes in the rat: noninvasive photoacoustic and US imaging with a clinical US system. Radiology. 256 (1), 102-110 (2010).
- Kim, C., Erpelding, T. N., Jankovic, L., Wang, L. V. Performance benchmarks of an array-based hand-held photoacoustic probe adapted from a clinical ultrasound system for non-invasive sentinel lymph node imaging. Philos. Transact. A. Math Phys. Eng. Sci. 369 (1955), 4644-4650 (1955).
- Kim, C., Song, K. H., Gao, F., Wang, L. V. Sentinel lymph nodes and lymphatic vessels: noninvasive dual-modality in vivo mapping by using indocyanine green in rats--volumetric spectroscopic photoacoustic imaging and planar fluorescence imaging. Radiology. 255 (2), 442-450 (2010).
- Kruger, R. A., Kiser, W. L., Reinecke, D. R., Kruger, G. A. Thermoacoustic computed tomography using a conventional linear transducer array. Medical Physics. 30 (5), 856-860 (2003).
- Kruger, R. A., Lam, R. B., Reinecke, D. R., Del Rio, S. P., Doyle, R. P.
- Manohar, S., Kharine, A., Van Hespen, J. C., Steenbergen, W., Van Leeuwen, T. G. The Twente Photoacoustic Mammoscope: system overview and performance. Phys. Med. Biol. 50 (11), 2543-2557 (2005).
