Photoacoustic cystografi

Summary

Photoacoustic cystografi (PAC) har et stort potentiale til at kortlægge Urinblærer, en stråling følsomt indre organ hos pædiatriske patienter, uden at bruge nogen ioniserende stråling eller giftige kontrastmiddel. Her har vi demonstrere brugen af ​​PAC til kortlægning Urinblærer en injektion af optisk uigennemsigtige sporstoffer hos rotter

Abstract

Konventionel pædiatrisk cystografi, som er baseret på diagnostisk røntgen med en radio-uigennemsigtig farvestof, lider anvendelsen af ​​skadelige ioniserende stråling. Risikoen for blære kræft hos børn på grund af stråling er større end mange andre kræftformer. Her har vi demonstrere muligheden for IONISERENDE og noninvasiv Photoacoustic (PA) billeddannelse af Urinblærer, kaldet Photoacoustic cystografi (PAC), ved hjælp af nær-infrarøde (NIR) optiske absorbenter (dvs. methylenblåt plasmoniske guld nanostrukturer, eller enlige walled carbon nanotubes ) som en optisk-uklar sporstof. Vi har med succes afbildet en rotte blære fyldt med de optiske absorberende midler ved hjælp af en mørk-felt konfokal PAC-system. Efter transurethral injektion af kontraststoffer, var rottens blærer photoacoustically visualiseres ved at opnå betydelige PA signal ekstraudstyr. Akkumuleringen blev valideret ved spektroskopisk PA billeddannelse. Yderligere, ved hjælp af kun en laser puls energipå mindre end 1 mJ / cm ² (1/20 af sikkerheden grænse), kunne vores aktuelle imaging system kortlægge methylenblåt-fyldt-rotte-blære ved dybden af over 1 cm i biologisk væv in vivo. Både in vivo og ex vivo PA imaging resultater validere at kontrastmidler naturligt udskilt via vandladning. Således er der ingen bekymring langsigtet toksisk middel akkumulering, hvilket vil lette kliniske oversættelse.

Introduction

X-ray cystografi ¹ er en billeddannelse proces for at identificere blære-relaterede sygdomme såsom blærekræft, blære-ureterrefluks, blokering af ureter, neurogen blære, osv. ^2-5 Typisk er urinen annulleret, og en radio-uigennemsigtig middel injiceres gennem en kateter. Derefter er fluoroskopiske røntgenbilleder erhvervet at afgrænse Urinblærer. Men det centrale sikkerhed problem er, at skadelig ioniserende stråling anvendes i denne procedure. Procentdelen af kumulative kræftrisiko i alderen 75 år på grund af diagnostiske røntgenstråler varierer fra 0,6 til 1,8%. ^6. Desuden kræftfremkaldende trussel er signifikant hos pædiatriske patienter. En britisk undersøgelse viste, at blandt 9 store indre organer, den gennemsnitlige årlige stråledosis fra diagnostiske røntgenstråler var højest i de blærer i kvindelige børn mindre end 4 og næsthøjeste i drengebørn mindre end 4. ^7. Dette indikerer, at risikoen for blærekræft er størst hos børn. AltHough pædiatriske radiologer bestræbe sig på at reducere stråling så lav som rimeligt muligt, ioniserende stråling ikke helt kan udelukkes. Derfor, begrænsning skaber et behov for en helt stråling-fri, følsom, omkostningseffektiv og høj opløsning billeddannelse modalitet med ikke-radioaktive kontrastmidler i cystografi.

For nylig har Photoacoustic tomografi (PAT) bliver en premier biomedicinsk billeddannelse modalitet, fordi PAT kan levere stærke optiske absorption kontraster og en høj ultralyd rumlig opløsning i biologiske væv. ^8. Princippet om PAT er, at ultralydsbølger induceres grund termoelastisk udvidelse af et mål efterfulgt af lysabsorption. Ved at detektere tidsopløst akustiske bølger rejser via et medie, to-eller tre-dimensionelle Photoacoustic (PA), billeder dannes. Fordi ultralyd (US) er meget mindre spredt i væv i forhold til lys (typisk to eller tre størrelsesordener), erbilleddannelse dybde PAT kan nå op til ~ 8 cm i væv, mens den rumlige opløsning er vedligeholdt til 1/200 af imaging dybde ⁹ De vigtigste fordele ved PAT til cystographic ansøgningen omfatte: (1). PAT er helt fri ioniserende stråling. (2) ClinicalUSimaging systemer kan let tilpasses til at levere dual-modal PA og amerikanske billeddannelse kapaciteter. Således kan dual-modal PA / USA imaging system være relativt bærbare, omkostningseffektive, og hurtig, som er centrale kriterier for hurtig klinisk oversættelse. Ved hjælp af både endogene og eksogene kontraster, har PAT forudsat høj opløsning morfologiske, funktionelle og molekylær billeddannelse af væv til at studere tumor fysiopatologi, hjerne hemodynamics, indre organer, oftalmologi, angiografi, og etc. ^10-16

I denne artikel viser vi de eksperimentelle protokoller IONISERENDE Photoacoustic cystografi (PAC) ved hjælp af nær-infrarøde (NIR) optiske absorbenter (dvs. methylenblåt, gåld nanocages, eller enlige walled carbon nanotubes) som ugiftige optisk uklare sporstoffer. Rotte blærer fyldt med kontrastmidler blev photoacoustically og spektroskopisk afgrænset in vivo. Ingen agenter vedholdende akkumuleret i blærer og nyrer hos rotterne. Således kan langsigtede toksicitet, som kan være forårsaget af agent akkumulation udelukket. Dette resultat betyder, at AKP med en kombination af de optiske absorbenter potentielt kan være en virkelig harmløs cystographic modalitet for pædiatriske patienter. Systemet konfiguration, systemets tilpasning, og in vivo / ex vivo billeddiagnostiske procedurer diskuteres i denne artikel.

Protocol

1.. Dyb refleksion tilstand Photoacoustic cystografi (PAC) System

1. System konfiguration ^{17, 18}
   1. En Q-switched Nd: YAG laser (SLII-10; Continuum, 532 nm) pumper en bølgelængde-afstemmelige laser (Surelite OPO PLUS, Continuum, bølgelængde tuning range: 680 til 2.500 nm).
   2. Pulsen Varigheden af ​​hver laser skud er ~ 5 nsec, og laseren gentagelse sats er 10 Hz.
   3. Bølgelængden afhænger optiske absorptionstop af det anvendte kontrastmiddel. Hvis methylenblåt tjener som kontrastmidlet er en optisk bølgelængde på 667 nm anvendes hvor peak absorption. Plasmoniske guld nanostrukturer kan have tunable lokaliseret overfladeplasmonresonans på NIR spektrale område, baseret på deres fysiske og kemiske egenskaber. Endvidere kan brede absorptionsspektrum af enkelt væg kulstofnanorør giver en bred mulighed for bølgelængde udvælgelse.
   4. Lys, der kommer ud af den afstemmelige laser leveres til en sfærisk konisk linse through retvinklede prismer (PS908, Thorlabs).
   5. En doughnut-formet lysstråle mønster genereret efter lyset passerer gennem det sfæriske koniske linse. Den hjemmelavede konisk linse er lavet af en BK7 linsen og kegle vinkel er 152 °. Diameteren af ​​linsen er 2,5 cm.
   6. Den divergerende doughnut-formet lysstråle omdirigeret via en optisk kondensator, fremstillet af en gennemsigtig akryl plade. Diametre på de øverste og nederste overflader er 6,1 og 4,8 cm, hhv. Tykkelsen af ​​kondensatoren er 2,5 cm. Den omdirigerede ringformede lysstråle danner en doughnut-formet med en mørk center på vævsoverfladen.
   7. Udnyt en lille vandbeholder til at øge akustisk kobling. Vandbeholderen har en bundåbning omviklet med en klar tynd polyethylenfilm, som er optisk og akustisk transparent. Små dyr er placeret under vandbeholderen.
   8. De genererede PA bølger opdaget af en sfærisk fokuseret ultralyd transducer (V308;Olympus NDT; 5 MHz centrale frekvens), som er monteret i midten af ​​den optiske kondensatoren. Elementet diameter og brændvidden af ​​transduceren er 1,9 og 2,5 cm, hhv. Således f-tal af transduceren er ~ 1.3.
   9. De tværgående og aksiale opløsninger er 590 og 144 um, hhv.
   10. De fundne PA bølger først forstærket af en bredbåndsforbindelse ultralyd pulser / receiver (5072PR, Olympus NDT, 35 MHz båndbredde og 59 dB rf forstærkning) og derefter overtaget af et oscilloskop (TDS5054, Tektronix).
   11. Opnå en-dimensionale tidsopløst billeder (kaldet som A-line) ved at måle tider af ankomsten af ​​PA bølger. I øjeblikket er hastigheden af ​​PA bølger antages at være på 1.480 m / sek hele billedet erhvervelse. To-(kaldet som B-scanninger) og tre-dimensionelle PA billeder kan erhverves ved mekanisk at bevæge den lineære raster scanning etape (XY6060, Danaher Dover).
   12. De billeddannende tid er ~ 25 min for en volumetrisk enkelt bølgelængde PA billede med ensynsfelt (FOV) på 2,5 x 2,4 x 1,5 cm ³ i xyz fly. Vi købte 125 prøver langs x-retningen med en trinstørrelse på 0,2 mm, 60 prøver langs y-retningen med en trinstørrelse på 0,4 mm. 500 datapunkter med en 50 MHz samplingfrekvens opnåedes langs z-retningen. Den mekaniske skanning styres af et hjemmelavet LabVIEW software system.
   13. Den volumetriske data repræsenteres ved maksimal amplitude fremspring (MAP) med en MathWorks MATLAB software system.
2. System tilpasning
   1. Efter den sfæriske koniske linse, sørg for, at lyskeglen er en perfekt ring form. Hvis ringformet lyskegle ikke er korrekt frembragt, PA-signaler stammer fra hudoverfladen er dominerende. Således er det vanskeligt at opnå dyb væv billeddannelse.
   2. Line-formede lys fokuseres i vand bør koaksialt med ultralyd fokalzone. Hvis de ikke er koaksialt, systemet lider under lav signal-støjforhold.
   3. Det bestrålede laser puls energi på hudoverfladen er varierede fra ~ 1 - 2 mJ / cm ^2, når bølgelængden er tunet fra 680 til 1.000 nm, hhv. Disse laser pulse energier er meget lavere end American National Standards Institute sikekrhedstærskel, varierende fra 20 til 80 mJ / cm ² over det spektrale område, hhv.

2.. In vivo og ex vivo Imaging Procedures

1. Animal forberedelse
   1. Brug kvindelige Spraque-Dawley rotter med en vægt på 200-250 g i alle PA billeddannelse eksperimenter.
   2. Til at begynde med, bedøver rotten ved intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (85 mg / kg legemsvægt) og xylazin (15 mg / kg).
   3. Fjerne hår hår i maveregionen.
   4. Placer rotte på toppen af ​​et skræddersyet dyr holder.
   5. Coat en 22-gauge kateter med smøremiddel for at forbedre kateteret.
   6. Hold kateteret Vertically over urinrørets åbning. Dernæst indsættes den distale ende af kateteret, vandret ind i urinrøret indtil navet af kateteret endelig når åbningen.
   7. Urin i blæren bortfalder via kateteret.
2. In vivo PAC imaging
   1. Placer rotte, placeret på toppen af ​​dyret indehaveren under vandbeholderen i PAC-systemet.
   2. Påfør ultralyd gel (Sonotech) mellem dyrets hudoverfladen og plastmembran at forbedre akustisk kobling.
   3. Fuldt anesthetize rotte hjælp fordampet isofluran (1 L / min oxygen og 0,75% isofluran) under in vivo PA billeddannelse eksperimenter.
   4. Anskaf en kontrol PA billede før injektion af kontraststoffer.
   5. Indføre en vandig opløsning af methylenblåt (0,8 gl / g kropsvægt med en koncentration på 30 mM), guld nanocages (1,2 gl / g kropsvægt med en koncentration på 2 nM) eller single walled carbon nanorør (0,8 gl / g krop vægt meden koncentration på 0,3 uM) til blæren via kateteret. Brug en 1 ml-sprøjte med en 22-gauge kateter.
   6. Anskaf en serie af PA-billeder.
3. Ex vivo PAC billeddannelse
   1. Sacrifice rotten efter in vivo PAC billeddannelse, ved at injicere en overdosis af pentobarbital.
   2. Fjern de to store organer, blærer og nyrer, at undersøge biodistribution og på en glasplade.
   3. Placer glaspladen under vandbeholderen i PAC-systemet.
   4. Påfør ultralyd gel (Sonotech) mellem udskårne organer og plastmembran at forbedre akustisk kobling.
   5. Anskaf PA billeder.
   6. Photoacoustically billede organerne fjernet fra en sund rotte som en kontrol.

Representative Results

Figur 1 viser in vivo-IONISERENDE og noninvasiv PAC anvendelse af optisk uklar methylenblåt (MB). Kontrollen PA Billedet blev opnået ved 667 nm, på toppen optiske absorption for MB (figur 1A). Selvom blodkarrene i FOV er klart visualiseret, blæren er usynlig, fordi det er optisk transparent ved denne bølgelængde. Som vist i figur 1B, er blæren tydeligt åbenbaret i PA billedet erhvervet ved 0,2 timer efter injektion af MB. At bekræfte akkumulering af MB i blæren, vi brugte to optiske bølgelængder (667 og 850 nm) for at skelne mellem blæren fyldt med MB fra de omgivende strukturer. Som vist i figur 1C, PA amplituder i blæren er ikke synlige, fordi den optiske absorptionskoefficient MB ved 850 nm er næsten 0. Således dette resultat indikerer, at blæren er fyldt med MB. Som et resultat, viser det, at den spektroskopiskePA billedet kan tydeligt skelne mellem forskellige endogene og eksogene choromophores. Figur 1D og 1E viser dybde løst PA B-scan billeder, scannede langs den stiplede linie i figur 1A og 1B, hhv. Den øverste overflade af blæren var placeret på ultralydstransducer omdrejningspunkt både in vivo og ex vivo-billeddannelse. Positionen af ​​blæren langs dybden retning er klart identificeret, ~ 3,5 mm under hudoverfladen. Desuden er de PA signaler inden blæren målt ved 24 og 48 timer efter injektion næsten identisk med signalet opnået ved præ-injektion. Dette resultat betyder, at den injicerede kontrastmiddel var fuldstændigt fjernet fra kroppen, og ingen agent akkumuleret. Derfor er ingen langsigtet middel giftighed forventet i vores tilgang. Desuden er dybden af efter injektion PA billede (figur 1B), der kodes ved hjælp af en pseudo farve i fig. 2. Than stilling blæren er ~ 3,5 mm under hudoverfladen, som korrelerer godt med den dybde-løst PA B-scan billede (fig. 1E). De typiske dybder de øverste og nederste grænser for en pædiatrisk blære er ~ 1,4 og 4,3 cm, henholdsvis fra den abdominale overflade. Ved kun at bruge en laser puls energi på mindre end 1 mJ / cm ² (1/20 af sikkerheden grænse), kunne vores nuværende imaging system kortlægge methylenblåt-fyldt-rotte-blære ved dybde over 1 cm i biologisk væv in vivo. ^17. Som vi ovenfor nævnt, kan de billeddannende dybde PAT nå op til ~ 8 cm i væv med hjælp af methylenblåt. ^9.

Efter alt in vivo billeddannelse eksperimenter, udskåret vi to vigtige organer, blære og nyre at undersøge biodistribution. Som en kontrol blev en blære og nyre udskåret fra en sund rotte. De PA-signaler måles inden de fjernede blærer og nyrer fra to grupper af rotter er næsten identiske, demonstrating at ingen agent akkumuleret i organerne.

Figur 1.. In vivo IONISERENDE og noninvasiv PAC hjælp optisk uigennemsigtige methylenblåt (MB). (A) Kontrol PA billede af en rotte maveregion erhvervet til pre-injektion af MB med en optisk bølgelængde på 667 nm, der kun viser blodkar (BV ). Denne bølgelængde kampe med den optiske absorption toppen af MB. (B) PA billede fås ved 0,2 timer efter transuretral-injektion af MB med en optisk bølgelængde på 667 nm, afslører både BV og blæren (BD) akkumuleret med MB. (C ) PA billede fås ved 850 nm efter injektion af MB. BD fyldt med MB forsvinder i PA billede, fordi den optiske absorption af MB er minimal ved denne bølgelængde.(D) og (E) Dybde-løst PA B-scanningsbilleder skåret langs de stiplede linjer i (A) og (B), hhv. Genoptrykt med tilladelse fra ref ^17.. Copyright 2011 Optical Society of America.

Figur 2. Dybde-kodet PA billede af figur 1B. Farven repræsenterer den dybdegående information. BV, blodkar, BD, blære, og MB, methylenblåt.

Discussion

Sammenfattende har vi vist muligheden for IONISERENDE PAC hjælp toksiske optiske absorbenter i en rottemodel in vivo. Vi har med succes afbildet en rotte blære fyldt med optiske absorbenter ved hjælp af vores IONISERENDE og noninvasiv PAC-system. To vigtige sikkerhedsmæssige spørgsmål er blevet løst i vores tilgang: (1) brug af IONISERENDE stråling til cystographic applikationer og (2) ingen akkumulering af kontrastmidler i kroppen.

Vores klinisk interesse omfatter overvågning blære-ureterrefluks (VUR) hos pædiatriske patienter. Ca. 3% af børnene i USA er ramt af urinvejsinfektioner ^19, og ca 1,5% af disse patienter lider VUR. I nuværende klinisk praksis, direkte alle disse patienter gennemgå ioniserende røntgen fluoroskopisk billedbehandling. Den amerikanske Urologiske Association pædiatriske VUR kliniske retningslinjer panelet anbefaler stærkt minimere brugen af ​​ioniserende stråling til den pædiatriske patients. ^20. Vores langsigtede mål er at overvåge VUR med en kombination af ugiftige optiske kontrastmidler ved hjælp af PAC. Hvis der således er VUR hos patienter, forventer vi, at den injicerede agent vil strømme tilbage fra blæren til nyren. Sammenlignet med x-ray cystografi har PAC en begrænset indtrængningsdybde. Således er vores vigtigste mål for klinisk PAC er for pædiatriske patienter. Selvom billeddannelseshastighed i vores nuværende AKP-system er relativt langsomt på grund af mekanisk scanning, kan et realtids klinisk ultralydssystemet let tilpasses til AKP. ^21-27 derfor denne tilgang potentielt tilbyder en bærbare og billigt middel til at få adgang VUR overvågning, hvilket er en yderligere fordel. Således har vi overbevist om, at mulighederne for kliniske oversættelse af vores ansøgning er meget høj. For fremtidige undersøgelser, før det er testet i kliniske omgivelser vil PA VUR overvågning ved hjælp af optiske absorbenter skal undersøges i et svin model.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q-switched Nd:YAG laser	Continuum	SLII-10	pump laser
OPO laser	Continuum	Surelite OPO PLUS	tunable laser
Prisms	Thorlabs	PS908	light deliver
Ultrasound transducer	Olympus NDT	V308	5 MHz
Ultraoundpulser/receiver	Olympus NDT	5072PR	amplifier
Oscilloscope	Tektronix	TDS5054	data acquisition
Scanning stage	Danaher Dover	XY6060	raster scanning
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140-25G	contrast agent
Rats	Harlan	Spague-Dawley	animal subject
Isoflourane vaporizer	Euthanex	EZ-155	anesthesia
Ultrasound gel	Sonotech	Clear Image singles	acoustic coupling