Photoacoustic cystografi

Summary

Photoacoustic cystografi (PAC) har et stort potensial for å kartlegge urin blærer, en stråling sensitiv intern organ hos barn, uten å bruke ioniserende stråling eller giftige kontrastmiddel. Her kan vi demonstrere bruk av PAC for kartlegging urin blærer med en injeksjon av optisk-ugjennomsiktig sporstoffer i rotter

Abstract

Konvensjonell pediatrisk cystografi, som er basert på diagnostisk røntgen ved hjelp av en radio-opak fargestoff, lider av etter bruk av skadelige ioniserende stråling. Risikoen for blære kreft hos barn på grunn av stråling er mer betydningsfulle enn mange andre kreftformer. Her kan vi demonstrere gjennomførbarheten av ikke-ioniserende og ikke-invasiv photoacoustic (PA) avbildning av urin blærer, referert til som photoacoustic cystografi (PAC), ved hjelp av nær-infrarød (NIR) optiske absorbenter (dvs. metylenblått plasmonic gull nanostrukturer, eller enkle vegger karbon nanorør ) som en optisk-turbid tracer. Vi har nå fotografert en rotte blære fylt med de optiske absorberende midler ved hjelp av en mørk-feltet konfokal PAC system. Etter transurethral injeksjon av kontrastmidler, var rottes blærer photoacoustically visualisert ved å oppnå betydelig PA signal ekstrautstyr. Oppbyggingen ble validert av spektroskopiske PA bildebehandling. Videre, ved å bruke bare en laserpuls energipå mindre enn 1 mJ / cm ² (1/20 av sikkerhetsgrensen), kunne vår nåværende avbildningssystem kartlegge metylen-blå-fylt-rotte-blære i en dybde av mer enn 1 cm i biologisk vev in vivo. Både in vivo og ex vivo PA avbildingsresultater validere at kontrastmidler var naturlig utskilles via urinering. Således er det ingen bekymring for langsiktig toksisk middel akkumulering, noe som vil lette klinisk oversettelse.

Introduction

X-ray cystografi ^en er en avbildning prosess for å identifisere blære-relaterte sykdommer som blærekreft, vesikoureteral refluks, blokkering av urinlederne, nevrogen blære, etc. ^2-5 Vanligvis er urines annullert og en radio-ugjennomsiktig agenten injiseres gjennom en kateter. Deretter blir fluoroskopiske røntgenbilder anskaffet for å avgrense urin blærer. Imidlertid er det viktig sikkerhets-problem som skadelig ioniserende stråling brukes i denne framgangsmåten. Prosentandelen av kumulative kreft til alder 75 år på grunn av diagnostiske røntgen varierer 0,6 til 1,8%. ^6. I tillegg er det karsinogene trussel signifikant hos pediatriske pasienter. En britisk studie viste at blant ni store indre organer, gjennomsnittlig årlig stråledose fra diagnostisk røntgen var høyest i blærer i kvinnelige barn mindre enn fire og nest høyeste i guttebarn mindre enn fire. ⁷ Dette indikerer at blæren kreftrisiko er størst hos barn. AltHough pediatriske radiologer forsøke å redusere stråling pris så lav som praktisk mulig, ioniserende stråling ikke kan utelukkes helt. Derfor skaper begrensning et behov for en helt stråling-fri, følsom, kostnadseffektive og høy oppløsning avbildningsfunksjonalitet med nonradioactive kontrastmidler i cystografi.

Nylig har photoacoustic tomografi (PAT) blitt et ledende biomedisinsk avbildningsfunksjonalitet fordi PAT kan gi sterke optiske absorpsjon kontraster og en høy ultralyd romlig oppløsning i biologisk vev. ⁸ Prinsippet om PAT er at ultrasoniske bølger blir indusert på grunn thermoelastic utvidelse av et mål etterfulgt av lys absorpsjon. Ved å detektere tids-løst lydbølger som forplantes via et medium, to-eller tre-dimensjonale photoacoustic (PA)-bilder dannes. Fordi ultralyd (US) er mye mindre spredt i vev sammenlignet med lys (vanligvis to eller tre størrelsesordener), denbildebehandling dybde av PAT kan nå opp til ~ 8 cm i vev, mens den romlige oppløsningen er opprettholdt til 1/200 av bildebehandling dybde ⁹ De viktigste fordelene med PAT for cystographic søknaden omfatter: (1). PAT er helt fri for ioniserende stråling. (2) ClinicalUSimaging systemer kan enkelt tilpasses til å levere dual-modal PA og amerikanske imaging evner. Dermed kan dual-modal PA / US imaging system være relativt portabel, kostnadseffektiv og rask, noe som er viktige kriterier for rask klinisk oversettelse. Ved hjelp av både endogene og eksogene kontraster, har PAT gitt høy oppløsning morfologiske, funksjonelle og molekylær avbildning av vev for å studere svulst physiopathology, hjernen hemodynamics, indre organer, oftalmologi, angiografi, og etc. ^10-16

I denne artikkelen viser vi de eksperimentelle protokoller av ikke-ioniserende photoacoustic cystografi (PAC) ved hjelp av nær-infrarød (NIR) optiske absorbenter (dvs. metylenblått, gåld nanocages, eller enkle vegger karbon nanorør) som giftfri optisk-grumsete sporstoffer. Rotte blærer fylt med kontrastmidler ble photoacoustically og spectroscopically avgrenset in vivo. Ingen midler vedvarende akkumulert i blærene og nyrer til rottene. Dermed kan langsiktig giftighet som kan være forårsaket av agenten akkumulering utelukkes. Dette resultatet innebærer at PAC med kombinasjon av de optiske dempere kan potensielt være en virkelig ufarlig cystographic modalitet for pediatriske pasienter. Systemkonfigurasjonen, system justering og in vivo / ex vivo bildebehandling prosedyrer er omtalt i denne artikkelen.

Protocol

En. Deep Reflection Mode Photoacoustic cystografi (PAC) System

1. System ^{17 konfigurasjon, 18}
   1. En Q-switched Nd: YAG laser (SLII-10; Continuum, 532 nm) pumper en bølgelengde-tunbare laser (Surelite OPO PLUS; Continuum; bølgelengde tuning rekkevidde: 680 til 2500 nm).
   2. Pulsen Varigheten av hver laser shot er ~ 5 EFF, og laser repetisjon rate er 10 Hz.
   3. Bølgelengden er avhengig av den optiske absorpsjonstopp av den brukte kontrastmiddel. Hvis metylenblått tjener som kontrastmiddel, er en optisk bølgelengde på 667 nm som brukes, hvor toppen er absorpsjon. Plasmonic gull nanostrukturer kan ha fleksibel lokaliserte overflaten plasmonresonans på NIR spektral-regionen, basert på deres fysiske og kjemiske egenskaper. Videre kan den brede absorpsjon spekteret av enkle vegger karbon nanorør gi et bredt alternativ for bølgelengde utvalg.
   4. Lys som kommer ut av den avstembare laseren blir levert til en sfærisk konisk linse through rettvinklede prismer (PS908, Thorlabs).
   5. En smultringformet lysstråle mønster genereres etter at lyset passerer gjennom den sfæriske konisk linse. Den hjemmelagde konisk objektivet er laget av en BK7 linsen og kjeglevinkelen er 152 °. Diameteren til linsen er 2,5 cm.
   6. Den divergerende smultringformet lysstråle blir omdirigert via en optisk kondensator, laget av et gjennomsiktig akrylplate. Diameterne på topp-og bunnflatene er 6,1 og 4,8 cm, henholdsvis. Tykkelsen av kondensatoren er 2,5 cm. Den omdirigert ringformet lysstråle danner en smultring-formet med et mørkt senter på vevsoverflaten.
   7. Bruk en liten vannbeholder å øke akustisk kobling. Vannet beholderen har en bunnåpning innpakket med en klar tynn polyetylenfilm som er optisk og akustisk transparent. Små dyr er plassert under vannbeholderen.
   8. De genererte PA bølgene blir oppdaget av en sfærisk fokusert ultralyd transducer (V308;Olympus NDT, 5 MHz sentral frekvens), som er montert i midten av den optiske kondensor. Elementet diameter og brennvidden til transduseren er 1,9 og 2,5 cm, henholdsvis. Således er det f-tall av svingeren ~ 1.3.
   9. Den tverrgående og aksiale oppløsning er 590 og 144 um, respektivt.
   10. De oppdaget PA bølger er første forsterket av en bredbåndstilkobling ultralyd pulser / mottaker (5072PR, Olympus NDT, 35 MHz båndbredde og 59 dB rf gevinst), og deretter kjøpt opp av et oscilloskop (TDS5054; Tektronix).
   11. Skaff endimensjonale tid-løst bilder (kalt A-linje) ved å måle tider for ankomst av PA bølger. Foreløpig er hastigheten på PA bølger antas å være på 1480 m / sek over hele bildet oppkjøpet. To-(kalt B-skanner) og tredimensjonale PA bilder kan bli kjøpt opp av mekanisk bevege lineær raster skanning scenen (XY6060; Danaher Dover).
   12. Det tenkelig tid er ~ 25 min for en volumetrisk single-bølgelengde PA bilde med ensynsfelt (FOV) på 2,5 x 2,4 x 1,5 cm ³ i xyz flyene. Vi ervervet 125 prøver langs X-retningen med en trinnstørrelse på 0,2 mm, 60 prøver langs y-retningen med en trinnstørrelse på 0,4 mm. 500 datapunkter med en 50-MHz samplingsfrekvens ble innhentet langs z retning. Den mekaniske skanning styres av en hjemmelaget NI LabVIEW software system.
   13. Den volumetriske data er representert ved maksimal amplitude fremspring (MAP) ved hjelp av en MathWorks MATLAB programvaresystem.
2. System justering
   1. Etter den sfæriske koniske objektivet, sørg for at strålen mønsteret er en perfekt ring form. Hvis smultring-formet bjelke mønster ikke er riktig generert, PA signaler stammer fra hudens overflate er dominerende. Således er det vanskelig å oppnå dype vev avbildning.
   2. Den line-formet lys fokus i vann bør koaksialt linje med ultralyd focal sone. Dersom de ikke er koaksialt innrettet, lider systemet fra lav signal-til-støyforhold.
   3. Den bestrålte laserpuls energi på hudoverflaten er variert fra ~ 1-2 mJ / cm ² når bølgelengden er innstilt fra 680 til 1000 nm, respektivt. Disse laserpuls energier er mye lavere enn den American National Standards Institute sikkerhetsgrense, varierende 20 til 80 mJ / cm ² over den spektrale område, henholdsvis.

2.. In vivo-og ex vivo avbildning Prosedyrer

1. Animal forberedelse
   1. Bruk kvinnelige Spraque-Dawley rotter med en vekt på 200 - 250 g i alle PA bildebehandling eksperimenter.
   2. Til å begynne med, anesthetize rotte etter intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin (85 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (15 mg / kg).
   3. Fjerne håret hårene i mageområdet.
   4. Plasser rotte på toppen av en skreddersydd dyr holderen.
   5. Coat en 22-gauge kateter med smøremiddel for å forbedre kateterinnleggelse.
   6. Hold kateteret Vertically over urinrørsåpningen. Deretter setter den distale enden av kateteret, horisontalt, inn i urinrøret inntil navet av kateteret til slutt når frem til åpningen.
   7. Urin i blæren vil annullere via kateteret.
2. In vivo PAC bildebehandling
   1. Plasser rotte, ligger på toppen av dyret holder, under vannbeholderen i PAC-systemet.
   2. Påfør en gel (Sonotech) mellom dyret hudoverflaten og plastmembran å bedre akustisk kobling.
   3. Fullt anesthetize rotte ved hjelp av fordampede isofluran (1 l / min oksygen og 0,75% isofluran) under in vivo-PA bildebehandling eksperimenter.
   4. Skaff en kontroll PA bilde før injeksjon av kontrastmidler.
   5. Innføre en vandig oppløsning av metylenblått (0,8 mL / g kroppsvekt med en konsentrasjon på 30 mM), gull nanocages (1.2 mL / g kroppsvekt med en konsentrasjon på 2 nM), eller enkelt-vegger karbon nanorør (0.8 mL / g organ vekt meden konsentrasjon på 0,3 uM) til blæren via kateteret. Bruk en 1-ml-sprøyte med en 22-gauge kateter.
   6. Tilegne seg en rekke PA bilder.
3. Ex vivo PAC bildebehandling
   1. Ofre rotte etter in vivo PAC bildebehandling, ved å injisere en overdose av pentobarbital.
   2. Fjern de to store organer, blærer og nyrer, for å undersøke biodistribusjon, og på en glassplate.
   3. Plasser glass plate under vann container i PAC-systemet.
   4. Påfør ultralyd gel (Sonotech) mellom de skåret organer og plast membran for å bedre akustisk kobling.
   5. Erverve PA bilder.
   6. Photoacoustically bilde organene fjernet fra en frisk rotte som en kontroll.

Representative Results

Figur 1 viser In vivo-ioniserende og ikke-invasiv PAC bruker optisk grumset metylenblått (MB). Kontrollen PA bildet ble oppnådd ved 667 nm, på topp optisk absorpsjon for MB (figur 1A). Selv om blodårene i FOV er tydelig visualisert, er blæren usynlig fordi det er optisk transparent på denne bølgelengden. Som vist i figur 1B, vil blæren klart frem i PA bilde tilegnet ved 0,2 timers post-injeksjon av MB. For å bekrefte opphopning av MB i blæren, brukte vi to optiske bølgelengder (667 og 850 nm) for å skille mellom blære fylt med MB fra de omkringliggende strukturer. Som vist på figur 1C, PA amplituder innenfor blæren er ikke synlige, fordi den optiske absorpsjonskoeffisient MB ved 850 nm var nær 0. Således, viser dette resultat at blæren er fylt med MB. Som et resultat av dette viser det seg at spektroskopiskePA image kan tydelig skille mellom forskjellige endogene og eksogene choromophores. Tallene 1D og 1E viser dybde-løst PA B-skanne bilder, skannede langs den stiplede linjen i figur 1A og 1B, henholdsvis. Den øvre overflate av blæren var plassert på ultralydtransducer navet både in vivo og ex vivo avbildning. Posisjonen av blæren langs dybden retning er klart identifisert, ~ 3,5 mm under hudoverflaten. I tillegg PA-signaler i blæren målt ved 24 og 48 timers post-injeksjon er nesten identisk med det signal som oppnås ved pre-injeksjon. Dette resultatet innebærer at den injiserte kontrastmiddel ble fullstendig fjernet fra kroppen, og ikke noe middel akkumulert. Derfor er ingen langsiktig middel toksisitet forventes i vår tilnærming. Videre er dybden av den post-injeksjon PA bilde (figur 1B) som er kodet ved hjelp av en pseudo farge i figur 2.. Than stilling av blæren er ~ 3.5 mm under hudoverflaten, som korrelerer godt med den dybde-løst PA B-skannebildet (figur 1E). De typiske dybder av de øvre og nedre grenser for en pediatrisk blære er ~ 1,4 og 4,3 cm, henholdsvis fra bukhinnen. Ved å bruke bare en laserpuls energi på mindre enn 1 mJ / cm ² (1/20 av sikkerhetsgrensen), kunne vår nåværende avbildningssystem kartlegge metylen-blå-fylt-rotte-blære i en dybde av 1 cm utover i biologisk vev in vivo. ^17. Som vi nevnte, kan imaging dybden av PAT nå opp til ~ 8 cm i vev med hjelp av metylenblått. ⁹

Tross alt in vivo bildebehandling eksperimenter, fjernet vi to store organer, blære og nyre for å undersøke biodistribusjon. Som en kontroll, ble en blære og nyre skåret ut fra en frisk rotte. Pa signaler målt innenfor de fjernede blærer og nyrer fra to grupper av rotter er nesten identiske, demonstrating at ingen agenten akkumulert i organer.

Figur 1. In vivo-ioniserende og ikke-invasiv PAC bruker optisk ugjennomsiktig metylenblått (MB). (A) Kontroll PA bilde av en rotte mageområdet kjøpt til pre-injeksjon av MB med en optisk bølgelengde på 667 nm, viser bare blodkar (BV ). Denne bølgelengden kamper med den optiske absorpsjonstopp av MB. (B) PA image oppnådd ved 0,2 timers post-transuretrale-injeksjon av MB med en optisk bølgelengde på 667 nm, avslører både BV og blæren (BD) akkumulert med MB. (C ) PA image oppnådd ved 850 nm etter injeksjon av MB. BD fylt med MB forsvinner i PA bilde fordi den optiske absorpsjon av MB er minimal i denne bølgelengden.(D) og (E) Dybde-løst PA B-skanne bilder kutt langs de stiplede linjer i (A) og (B), respektivt. Gjengitt med tillatelse fra ref. ^17. Copyright 2011 Optical Society of America.

Figur 2. Dybde-kodet PA bilde av figur 1B. Fargen representerer dybden informasjon. BV, blodårer, BD, blære, og MB, metylenblått.

Discussion

Som konklusjon, har vi vist at muligheten for å bruke ikke-toksiske, ikke-ioniserende PAC optiske dempere i en rottemodell in vivo. Vi har nå fotografert en rotte blære fylt med optiske absorbenter ved hjelp av vår ikke-ioniserende og ikke-invasiv PAC system. To kritiske sikkerhetsproblemer har blitt løst i vår tilnærming: (1) bruk av ikke-ioniserende stråling for cystographic applikasjoner og (2) ingen akkumulering av kontrastmidler i kroppen.

Vår klinisk interesse inkluderer overvåking vesikoureteral refluks (VUR) hos pediatriske pasienter. Ca 3% av barn i USA er rammet av urinveisinfeksjoner ^19, og ca 1,5% av de pasientene lider av VUR. I dagens kliniske praksis, alle disse pasientene direkte gjennomgå ioniserende X-ray gjennomlysning bildebehandling. American Urologiske Association pediatrisk VUR kliniske retningslinjer panel anbefaler på det sterkeste å minimere bruk av ioniserende stråling til pediatrisk patients. ^20. Vårt langsiktige mål er å overvåke VUR med kombinasjon av giftfri optiske kontrastmidler ved hjelp PAC. Dermed, hvis det er VUR hos pasienter, forventer vi at den injiserte agent vil strømme tilbake fra blæren til nyrene. Sammenlignet med røntgen cystografi, har PAC en begrenset inntrengningsdybde. Dermed er vår hovedmålgruppe for klinisk PAC for pediatriske pasienter. Selv om bildebehandling hastigheten på vår nåværende PAC-systemet er treg relativt grunn av mekanisk skanning, kan en real-time klinisk ultralyd systemet enkelt tilpasses for PAC. ^21-27 Derfor tilbyr denne tilnærmingen potensielt en bærbar og billig måte å få tilgang til VUR overvåking, noe som er en ytterligere fordel. Derfor har vi stor tro på at muligheten for klinisk oversettelse av søknaden vår er svært høy. For fremtidige studier, før det er testet i klinisk setting, vil PA VUR overvåking ved hjelp av optiske dempere bli undersøkt i et svin modell.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q-switched Nd:YAG laser	Continuum	SLII-10	pump laser
OPO laser	Continuum	Surelite OPO PLUS	tunable laser
Prisms	Thorlabs	PS908	light deliver
Ultrasound transducer	Olympus NDT	V308	5 MHz
Ultraoundpulser/receiver	Olympus NDT	5072PR	amplifier
Oscilloscope	Tektronix	TDS5054	data acquisition
Scanning stage	Danaher Dover	XY6060	raster scanning
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140-25G	contrast agent
Rats	Harlan	Spague-Dawley	animal subject
Isoflourane vaporizer	Euthanex	EZ-155	anesthesia
Ultrasound gel	Sonotech	Clear Image singles	acoustic coupling