Summary
Cystographie Photoacoustique (PAC) a un grand potentiel pour cartographier vessies, un organe interne sensible au rayonnement chez les patients pédiatriques, sans utiliser de radiations ionisantes ou agent de contraste toxique. Ici, nous démontrons l'utilisation des PAC pour la cartographie des vessies avec une injection de traceurs optiques opaques chez les rats
Abstract
Cystographie pédiatrique conventionnelle, qui repose sur de diagnostic X-ray en utilisant un colorant opaque aux rayons X, souffre de l'utilisation des rayonnements ionisants nocifs. Le risque de cancers de la vessie chez les enfants en raison de l'exposition aux radiations est plus importante que de nombreux autres cancers. Ici, nous démontrons la faisabilité de photoacoustique imagerie non ionisants et non invasive (PA) des vessies, appelés cystographie photoacoustique (PAC), en utilisant le proche infrarouge absorbants optiques (NIR) (c.-bleu de méthylène, nanostructures d'or plasmoniques ou nanotubes de carbone à paroi ) en tant que marqueur optique-trouble. Nous avons réussi à imager une vessie de rat rempli avec les agents absorbants optiques en utilisant un système PAC confocale en champ sombre. Après injection transurétrale des agents de contraste, les vessies du rat étaient photoacoustically visualisés en réalisant une amélioration significative du signal PA. L'accumulation a été validé par l'imagerie spectroscopique PA. En outre, en utilisant seulement une énergie d'impulsion laserde moins de 1 mJ / cm 2 (1/20 de la limite de sécurité), notre système d'imagerie actuelle pourrait cartographier le bleu de méthylène rempli rat-vessie à une profondeur de 1 cm au-delà dans les tissus biologiques in vivo. La fois in vivo et ex vivo résultats imagerie PA valider que les agents de contraste ont été naturellement excrété via la miction. Ainsi, il n'y a aucune inquiétude en ce qui concerne l'accumulation de l'agent toxique à long terme, ce qui facilitera la traduction clinique.
Introduction
X-ray cystographie 1 est un procédé d'imagerie pour identifier les maladies liées à la vessie tels que le cancer de la vessie, reflux vésico-urétéral, le blocage des uretères, la vessie neurogène, etc. 2-5 Typiquement, les urines sont annulées et un agent de radio-opaque est injecté par un cathéter. Ensuite, images fluoroscopie aux rayons X sont acquis pour délimiter vessies. Toutefois, la question de la sécurité est essentiel que le rayonnement ionisant nuisible est utilisé dans cette procédure. Le pourcentage de risque de cancer cumulative à l'âge de 75 années en raison de diagnostic rayons X s'étend de 0,6 à 1,8%. 6 En outre, la menace cancérogène est significative chez les patients pédiatriques. Une étude britannique a montré que parmi les 9 principaux organes internes, la dose d'irradiation annuelle moyenne de diagnostic rayons X était plus élevé dans les vessies pour enfants de sexe féminin de moins de 4 et au deuxième rang chez les enfants mâles de moins de 4. 7 Ceci indique que le risque de cancer de la vessie est plus importante chez les patients pédiatriques. Altien que radiopédiatres s'efforcent de réduire le taux d'exposition aux radiations aussi bas que raisonnablement possible, les rayonnements ionisants ne peut être totalement exclue. Par conséquent, la limitation crée un besoin pour une complètement sans radiation, sensible, rentable et de haute résolution modalité d'imagerie avec des agents de contraste non radioactifs dans cystographie.
Récemment, la tomographie photoacoustique (PAT) est devenu un premier modalité d'imagerie biomédicale parce PAT peut fournir de forts contrastes d'absorption optique et une résolution spatiale ultrasons haute dans les tissus biologiques. 8 Le principe de la PAT est que les ondes ultrasonores sont induites en raison de l'expansion thermoélastique d'une cible suivi par absorption de lumière. En détectant en temps résolu ondes acoustiques de voyage par l'intermédiaire d'un support, de deux ou de photo-acoustiques des images tridimensionnelles (AP) sont formées. Parce que l'échographie (US) est beaucoup moins dispersées dans les tissus par rapport à la lumière (généralement deux ou trois ordres de grandeur), l'profondeur d'imagerie de PAT peut atteindre jusqu'à ~ 8 cm dans les tissus, tandis que la résolution spatiale est maintenue à 1/200 de la profondeur d'imagerie 9 Les avantages clés de la PAT pour l'application cystographic comprennent: (1). PAT est complètement libre de ionisantes rayonnement. (2) Systèmes de ClinicalUSimaging peuvent être facilement adaptées pour fournir des capacités d'imagerie américains dual-modal et PA. Ainsi, le système bi-modal PA / US imagerie peut être relativement portable, rentable et rapide, qui sont des critères essentiels pour la traduction clinique rapide. Utilisant à la fois endogènes et exogènes contrastes, PAT a fourni l'imagerie à haute résolution morphologique, fonctionnelle et moléculaire des tissus pour étudier tumeur physiopathologie, l'hémodynamique du cerveau, les organes internes, l'ophtalmologie, l'angiographie, et etc 10-16.
Dans cet article, nous démontrons les protocoles expérimentaux de cystographie photoacoustique non ionisants (PAC) à l'aide du proche infrarouge absorbants optiques (NIR) (c.-bleu de méthylène, allernanocages LD, ou nanotubes de carbone à paroi) comme non toxiques traceurs optique trouble. vessies de rats remplis d'agents de contraste ont été photoacoustically et spectroscopie délimitées in vivo. Pas agents constamment accumulées dans les vessies et les reins des rats. Ainsi, la toxicité à long terme qui peut être causé par l'accumulation de l'agent peut être exclu. Ce résultat implique que PAC avec la combinaison des absorbeurs optiques peut potentiellement être une modalité cystographic vraiment sans danger pour les patients pédiatriques. La configuration du système, l'alignement du système, et dans les procédures d'imagerie in vivo in vivo / ex sont discutés dans cet article.
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Protocol
1. Mode Cystographie système de réflexion profonde Photoacoustique (PAC)
- Configuration du système 17, 18
- Un Q-switched Nd: YAG (SLII-10; Continuum; 532 nm) pompe un laser accordable en longueur d'onde (Surelite OPO PLUS; Continuum; longueur d'onde plage de réglage: 680 à 2500 nm).
- La durée d'impulsion de chaque tir laser est de ~ 5 ns, et la fréquence de répétition du laser est de 10 Hz..
- La longueur d'onde dépend du pic d'absorption optique de l'agent de contraste utilisé. Si le bleu de méthylène sert d'agent de contraste, d'une longueur d'onde optique de 667 nm est utilisé, où le pic d'absorption est. Nanostructures d'or plasmoniques peuvent avoir accordable localisée résonance de plasmon de surface au niveau de la région du spectre NIR, en fonction de leurs propriétés physiques et chimiques. En outre, le large spectre d'absorption de nanotubes de carbone à paroi peut offrir un large choix pour la sélection de longueur d'onde.
- La lumière provenant du laser accordable est livré à une lentille sphérique, conique trâce prismes à angle droit (PS908, Thorlabs).
- Un motif de faisceau de lumière en forme d'anneau est généré après que la lumière passe à travers la lentille conique sphérique. Le fait maison lentille conique est fait d'un verre BK7 et l'angle de cône est de 152 °. Le diamètre de la lentille est de 2,5 cm.
- Le faisceau de lumière en forme d'anneau divergente est redirigée par l'intermédiaire d'un condensateur optique, constituée d'une feuille d'acrylique transparent. Les diamètres des surfaces supérieure et inférieure sont des 6,1 et 4,8 cm, respectivement. L'épaisseur du condenseur est de 2,5 cm. Le faisceau de lumière en forme d'anneau forme un redirigée en forme de beignet avec un centre sombre sur la surface du tissu.
- Utiliser un petit récipient d'eau pour augmenter le couplage acoustique. Le réservoir d'eau présente une ouverture de fond enveloppé avec un film mince de polyéthylène, qui est optiquement clair et transparent acoustiquement. Les petits animaux sont placés sous le réservoir d'eau.
- Les vagues générées par PA sont détectées par un transducteur à ultrasons focalisés sphérique (V308;Olympus HAT; 5 MHz fréquence centrale), qui est monté au milieu du condenseur optique. Le diamètre de l'élément et de la distance focale du transducteur sont de 1,9 et 2,5 cm, respectivement. Ainsi, le nombre f de la sonde est d'environ 1,3.
- Les résolutions transversales et axiales sont 590 et 144 um, respectivement.
- Les ondes de PA détectés sont d'abord amplifiés par un émetteur / récepteur (5072PR, Olympus NDT, 35 MHz de bande passante et 59 dB de gain RF) haut débit à ultrasons, puis acquis par un oscilloscope (TDS5054; Tektronix).
- Obtenir des images résolues en temps à une dimension (appelé A-line) en mesurant les temps d'arrivée des ondes PA. Actuellement, la vitesse des ondes PA est supposé être à 1480 m / sec sur toute acquisition d'image. Deux (appelé B-scan) et les images PA en trois dimensions peut être acquise par déplacement mécanique de la phase de balayage de trame linéaire (XY6060; Danaher Dover).
- Le temps d'imagerie est de ~ 25 min pour une image volumétrique seule longueur d'onde PA avec unchamp de vision (FOV) de 2,5 x 2,4 x 1,5 cm 3 dans les plans XYZ. On fait l'acquisition de 125 échantillons le long de la direction x avec une taille de pas de 0,2 mm, de 60 échantillons le long de la direction y avec une taille de pas de 0,4 mm. 500 points de données avec une fréquence d'échantillonnage de 50 MHz, on a obtenu le long de la direction z. Le balayage mécanique est contrôlé par un système logiciel NI LabVIEW fait maison.
- Les données volumétrique est représentée par la projection de l'amplitude maximale (MAP) à l'aide d'un système logiciel MathWorks MATLAB.
- alignement du système
- Après la lentille sphérique conique, assurez-vous que le diagramme de rayonnement est une forme d'anneau parfait. Si le diagramme de rayonnement en forme d'anneau n'est pas correctement générés, les signaux PA provenaient de la surface de la peau sont dominants. Ainsi, il est difficile de réaliser l'imagerie des tissus profonds.
- La mise au point de la lumière en forme de ligne dans l'eau doit être aligné de manière coaxiale avec la zone focale des ultrasons. Si ce ne sont pas alignés coaxialement, le système souffre d'une faible rapport signal-bruit.
- L'énergie de l'impulsion laser irradiée sur la surface de la peau est variée à partir de ~ 1 - 2 mJ / cm 2 lorsque la longueur d'onde est réglée de 680 à 1000 nm, respectivement. Ces énergies d'impulsions laser sont beaucoup plus faible que la limite de sécurité American National Standards Institute, variant de 20 à 80 mJ / cm 2 par rapport à la région spectrale, respectivement.
2. In vivo et ex vivo procédures d'imagerie
- Préparation des animaux
- Utilisez des rats femelles Sprague-Dawley d'un poids de 200 à 250 g dans toutes les expériences d'imagerie PA.
- Pour commencer, anesthésier le rat par injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine (85 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (15 mg / kg).
- Épiler les poils dans la région abdominale.
- Placez le rat au sommet d'un détenteur d'animaux sur mesure.
- Manteau un cathéter de calibre 22 avec un lubrifiant pour améliorer l'insertion du cathéter.
- Tenez le cathéter VerticaLLY sur l'ouverture de l'urètre. Ensuite, insérer l'extrémité distale du cathéter, à l'horizontale, dans l'urètre jusqu'à ce que le moyeu du cathéter atteint finalement l'ouverture.
- Urine dans la vessie sera annulée par le cathéter.
- En PAC imagerie in vivo
- Positionner le rat, situé sur le dessus de la porte pour animaux, en dessous du récipient d'eau dans le système SAA.
- Appliquer le gel à ultrasons (Sonotech) entre la surface de la peau de l'animal et de la membrane en matière plastique pour améliorer le couplage acoustique.
- Anesthésier totalement le rat en utilisant vaporisé isoflurane (1 L / min d'oxygène et 0,75% d'isoflurane) durant les expériences in vivo PA imagerie.
- Obtenir une image contrôle de l'AP avant l'injection d'agents de contraste.
- Introduire une solution aqueuse de bleu de méthylène (0,8 ul / g de poids corporel avec une concentration de 30 mM), nanocages or (1.2 poids corporel ul / g avec une concentration de 2 nM) ou de nanotubes de carbone à paroi (0,8 ul / g au corps poids avecune concentration de 0,3 pM) à la vessie par l'intermédiaire du cathéter. Utilisez une seringue de 1 ml, avec un cathéter de calibre 22.
- Acquérir une série d'images de l'AP.
- Ex PAC imagerie in vivo
- Sacrifier le rat après en PAC imagerie in vivo, par injection d'une surdose de pentobarbital.
- Retirez les deux principaux organes, vessies et les reins, pour enquêter sur la biodistribution, et sur une plaque de verre.
- Positionner la plaque de verre au-dessous du récipient d'eau dans le système SAA.
- Appliquer le gel d'ultrasons (Sonotech) entre les organes excisés et membrane en plastique afin d'améliorer le couplage acoustique.
- Acquérir les images de l'AP.
- Photoacoustically image, les organes prélevés sur un rat sain comme témoin.
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Representative Results
La figure 1 montre l'In vivo non ionisants et non invasive PAC utilisant optiquement trouble bleu de méthylène (MB). L'image contrôle de l'AP a été obtenue à 667 nm, à l'absorption optique de pointe pour les MB (figure 1A). Bien que les vaisseaux sanguins dans le champ de vision sont clairement visualisées, la vessie est invisible car elle est optiquement transparent à cette longueur d'onde. Comme le montre la figure 1B, la vessie est clairement révélé dans l'image PA acquis à raison de 0,2 heures après l'injection de MB. Pour confirmer l'accumulation de Mo dans la vessie, nous avons utilisé deux longueurs d'onde optiques (667 et 850 nm) de faire la distinction entre la vessie remplie de Mo des structures environnantes. Comme le montre la figure 1C, les amplitudes PA intérieur de la vessie ne sont pas visibles parce que le coefficient d'absorption optique de Mo à 850 nm est pratiquement 0. Ainsi, ce résultat indique que la vessie est remplie avec MB. En conséquence, il démontre que la spectroscopieImage de PA peut clairement distinguer les différentes choromophores endogènes et exogènes. Figures 1D et 1E montrent les images PA B-scan en profondeur résolus, balayés le long de la ligne en pointillés dans les figures 1A et 1B, respectivement. La surface supérieure de la vessie était situé au point focal du transducteur à ultrasons à la fois in vivo et ex vivo d'imagerie. La position de la vessie le long de la direction de la profondeur est clairement identifiée, ~ 3,5 mm sous la surface de la peau. En outre, les signaux PA dans la vessie mesurée à 24 et 48 heures après l'injection sont presque identiques au signal obtenu au pré-injection. Ce résultat implique que l'agent de contraste injecté a été complètement éliminé de l'organisme, et aucun agent accumulé. Par conséquent, aucune toxicité de l'agent à long terme est prévu dans notre approche. Par ailleurs, la profondeur de l'image post-injection PA (figure 1B) est codé en utilisant un pseudo couleur sur la figure 2. Til position de la vessie est de ~ 3,5 mm sous la surface de la peau, ce qui correspond bien à l'image à résolution de profondeur PA B-scan (figure 1E). Les profondeurs typiques des limites supérieure et inférieure de la vessie pédiatrique sont ~ 1,4 et 4,3 cm, respectivement, à partir de la surface abdominale. En utilisant seulement une énergie d'impulsion laser de moins de 1 mJ / cm 2 (1/20 de la limite de sécurité), notre système d'imagerie actuelle pourrait cartographier le bleu de méthylène rempli rat-vessie à la profondeur d'au-delà de 1 cm biologique tissus in vivo 17. Comme nous l'avons indiqué ci-dessus, la profondeur d'imagerie de PAT peut atteindre jusqu'à ~ 8 cm dans les tissus à l'aide de bleu de méthylène. 9
Après tout dans des expériences d'imagerie in vivo, on excise les deux principaux organes, de la vessie et du rein pour enquêter sur la biodistribution. Comme contrôle, une vessie et les reins ont été prélevés à partir d'un rat sain. Les signaux PA mesurées dans les vessies enlevées et les reins de deux groupes de rats sont presque identiques, demonstrating qu'aucun agent accumulé dans les organes.
Figure 1. In vivo non ionisants et non invasive PAC utilisant optiquement opaque bleu de méthylène (MB). (A) l'image contrôle de l'AP de la région abdominale d'un rat acquis au pré-injection de Mo avec une longueur d'onde optique de 667 nm, montrant que les vaisseaux sanguins (BV ). Cette longueur d'onde correspond au pic d'absorption optique du bromure de méthyle. (B) l'image PA obtenus à 0,2 heures après l'transurétrale-injection de Mo à une longueur d'onde optique de 667 nm, révélant deux BV et la vessie (BD) accumulée avec MB. (C ) Image PA obtenue à 850 nm après injection de MB. La BD remplie de Mo disparaît dans l'image PA parce que l'absorption optique de MB est minime à cette longueur d'onde.(D) et (E) Profondeur résolue PA images B-scan couper le long des lignes pointillées dans (A) et (B), respectivement. Reproduit avec la permission de ref 17. Copyright 2011 Optical Society of America.
Figure 2. Profondeur d'image codée PA de la figure 1B. La couleur représente l'information de profondeur. BV, les vaisseaux sanguins; BD, de la vessie, et Mo, bleu de méthylène.
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Discussion
En conclusion, nous avons montré la possibilité de non-ionisants PAC en utilisant des absorbeurs optiques non toxiques dans un modèle de rat in vivo. Nous avons réussi à imager une vessie de rat rempli avec des absorbants optiques utilisant notre système PAC non ionisants et non invasive. Deux problèmes de sécurité critiques ont été résolus dans notre approche: (1) l'utilisation des rayonnements non ionisants pour des applications cystographic et (2) aucune accumulation d'agents de contraste dans le corps.
Notre intérêt clinique comprend la surveillance de reflux vésico-urétéral (RVU) chez les patients pédiatriques. Environ 3% des enfants aux Etats-Unis sont touchés par des infections des voies urinaires 19, et environ 1,5% de ces patients souffrent de reflux vésico-urétéral. Dans la pratique clinique actuelle, tous ces patients subissent directement ionisants imagerie fluoroscopique X-ray. L'Association américaine d'urologie pédiatrique VUR panneau directives cliniques recommande fortement minimiser l'utilisation des rayonnements ionisants à la pat pédiatriqueients. 20 Notre objectif à long terme consiste à surveiller VUR avec une combinaison d'agents de contraste optique non toxiques à l'aide de PAC. Ainsi, s'il ya reflux vésico-urétéral chez les patients, nous nous attendons à ce que l'agent injecté refluer de la vessie vers les reins. Par rapport à x-ray cystographie, PAC a une profondeur de pénétration limitée. Ainsi, notre principal objectif pour clinique PAC est pour les patients pédiatriques. Bien que la vitesse d'imagerie de notre système PAC actuelle est relativement lente en raison de balayage mécanique, un système d'échographie clinique en temps réel peut être facilement adapté pour PAC. 21-27 conséquent, cette approche offre potentiellement un moyen portables et peu coûteux pour accéder à la surveillance de reflux vésico-urétéral, ce qui est un avantage supplémentaire. Ainsi, nous croyons fermement que la faisabilité de la traduction clinique de notre application est très élevé. Pour les études futures, avant qu'il ne soit testé dans la pratique clinique, le suivi VUR PA avec absorbeurs optiques sera étudiée dans un modèle porcin.
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Disclosures
Toutes les expériences sur les animaux étaient en conformité avec la State University of New York à Buffalo institutionnel de protection des animaux et du Comité de l'utilisation.
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par une subvention du programme d'études de pilote de l'Université de Buffalo Centre de recherche clinique et translationnelle et le Consortium Translational Buffalo, une subvention de Roswell Park Foundation Alliance, les fonds de démarrage à partir de l'Université de Buffalo, IT Program Creative Consilience de MKE et PNIA (C1515-1121-0003) et subvention NRF de MEST (2012-0009249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Continuum | SLII-10 | pump laser |
| OPO laser | Continuum | Surelite OPO PLUS | tunable laser |
| Prisms | Thorlabs | PS908 | light deliver |
| Ultrasound transducer | Olympus NDT | V308 | 5 MHz |
| Ultraoundpulser/receiver | Olympus NDT | 5072PR | amplifier |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS5054 | data acquisition |
| Scanning stage | Danaher Dover | XY6060 | raster scanning |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | contrast agent |
| Rats | Harlan | Spague-Dawley | animal subject |
| Isoflourane vaporizer | Euthanex | EZ-155 | anesthesia |
| Ultrasound gel | Sonotech | Clear Image singles | acoustic coupling |
References
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