Summary
기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한 쉽고 안정적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.
Abstract
점막 섬모 정리 기능에 대한 통찰력을위한 중요한 운동성 섬모 기능의 정량적 분석을위한 영상 마우스의기도 상피 세포에 대한 생체 기술이 설립되었습니다. 갓 수확 마우스 기관은 trachealis 근육을 세로로 잘라 유리 바닥 접시에 얕은 벽 챔버에 장착된다. 기관의 샘플은 길이 방향으로 컬하는 trachealis 근육을 활용하기 위해 긴 축을 따라 배치됩니다. 이 전체 기관 길이에 따라 프로필보기 섬모 운동의 이미지를 수 있습니다. 200 프레임 / 초의 영상은 섬모 비트 주파수와 섬모 파형의 정량 분석을 할 수 있도록 차등 간섭 대비 현미경과 고속 디지털 카메라를 사용하여 얻을 수 있습니다. 영상 중에 형광 구슬의 추가와 함께, 섬모 발생 유량도 측정 할 수 있습니다. 프로토콜 시간은 챔버 준비를위한 5 분에서 약 30 분, 샘플에 대한 5-10 분에 걸쳐설치 및 videomicroscopy 10 ~ 15 분.
Introduction
기도 상피 세포의 운동성 섬모 기능의 분석은 점막 섬모 통관 및 폐 건강 한 영향을 미칠 수있는 유전과 환경 요인을 해명 실험적으로 중요합니다. 영상에 마우스기도 상피를 위해 개발 된 간단한 프로토콜은 돌연변이와 녹아웃 마우스 모델에서기도 섬모 운동을 심문하는 효율적인 방법을 제공하고 마우스 기관 조직의 절개와 높은 해상도 videomicroscopy와기도 섬모 운동의 생체 이미징는 기본 기술을 필요로합니다. 이 프로토콜은 이소성 2-5과 관련된 선천성 심장 질환을 가진 돌연변이의 운동성 섬모 기능의 신속한 평가 (속눈썹 비트 주파수, 섬모 구타 모양, 속눈썹 생성 흐름)을 허용하는 대규모 마우스 돌연변이 화면 중에 설립 세련된.
기도 섬모 운동을 연구하는 데 사용되는 현재의 기술은 급성 전 생체 유형 또는 경도 하나에 그룹화 할 수 있습니다체외 실험 방법의 GER 용어입니다. 급성 실험은 생체 인간 코 /기도 브러시 생검의 시각화 6,7 간단한 가로기도 섹션 8의 분석을 포함. 체외 방식은 공기 액체 인터페이스를 문화 나기도 현탁 배양 9-11에서와 같이 차별화 된 섬모 상피의 시트를 생성하는 다양한 세포 배양 기술을 활용합니다. 모든 사용 가능한 섬모 상피 세포가 실험 (4-6주 9,10)에 대해 생성되기 전에 그러나, 이러한기도 상피 reciliation 기술은 시간과 교육에서 매우 중요한 투자를 필요로합니다. 기도 상피 브러시 생검의 급성 전 생체 분석은 일반적으로 인간의 임상 연구에 사용하고 있지만,이 방법은 더욱 악화 기계적 조직 손상 12에 의한 마우스 연구에서 사용할 수 없습니다.
양해 각서 (MOU)의 분석을 위해이 프로토콜에 설명 된 기술E 기관기도 상피 실행할 단순 아니지만, 그것은 특별한 해부 기술도 videomicroscopy하여 이미징을위한 그 표준 이외의 특수 장비 전혀 필요하지 않습니다. 이 간단한 프로토콜에 많은 장점이 있습니다. 마우스 기관 조직 수확을 실시 할 빠르고 쉽기 때문에 첫째, 그것은 쥐의 큰 숫자기도 섬모 기능의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이 체외 치료 다른의 단기 효과 급성 분석을 포함 할 수 있습니다. 둘째, 생체 기술되고, 섬모기도 상피 세포는 지원 조직을 기본에 붙어 남아 있으므로 관련된 세포 신호 경로를 유지합니다. 따라서 체외 reciliated기도 상피 세포에 비해,이 혼합물은 생체 조직 환경에서 자연의 더 나은 표현입니다. 셋째,이 프로토콜을 허용 운동성 섬모 F의 객관적인 평가를 제공 할 수있는 다른 양적 변수의 숫자의 취득기름 부음. 마지막으로,기도 섬모 시각화를위한 다른 현재의 방법과는 달리,이 프로토콜은 섬모 비트의 고해상도 이미징 및 metachronal 파 생성을위한 최적 속눈썹의 프로필보기를 허용, 속눈썹 비트 방향에 직각 속눈썹의 시각화 수 있습니다 .
이 프로토콜은 이러한 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는기도 섬모 기능 및 생성 / 유지 보수 등의 점액 부하 등의 기계적 요인의 역할과 실험의 다양한 요구를 해결하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다 기도 섬모 비트와 metachronal 파동 전파.
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Protocol
1. 시약 설정
1.1 해부 및 영상 매체
Leibovitz의 L-15 배지 (L15)는 기관 샘플 수확 및 이미징을 수행하는 동안 사용되는 FBS (10 %)과 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100 단위 / 페니실린 G 나트륨과 스트렙토 마이신 황산염 100 ㎍ / ㎖의 ML)로 보충된다.
2. 얕은 벽으로 둘러싸인 문화 챔버 어셈블리
기관 조직을 보유하는 데 사용되는 챔버는 그림 1에 표시됩니다. 챔버의 바닥은 유리 35mm 배양 접시 바닥이다. 챔버의 상단과 측면이 유리 접시 위에 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 작은 조각을 배치하여 생성됩니다. 시트의 가장자리가 둥근 바닥 요리에 맞게 절단 및 센터는 추가 (단계 2.1-2.3 참조) 얕은 중앙 챔버를 형성하기 위해 트림합니다. 이 어셈블리의 상단에, 18mm의 둥근 유리 커버 슬립이 영상에 적합한 밀폐 챔버를 생성하기 위해 배치됩니다.
- 완전히 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 사각형 18mm 원형 유리 커버 슬립을 포함한다.
- 표준 날카로운 해부 가위 커버 슬립 (실리콘 시트의 원형 레이어의 결과)의 가장자리 주위에서 초과 실리콘 시트를 트림.
- 날카로운 메스를 잘라와 커버 커버 슬립 (따라서 이미징 챔버의 상단과 측면을 형성)의 중간에서 실리콘 시트 (약 10mm 광장)의 중앙 광장을 제거와 함께.
3. 기관 수확 및 준비
- 지역 기관 동물 관리에 따라 쥐를 안락사와위원회 및 / 또는 정부의 지침을 사용하여 잠수함의 조직에 충분한 L15 미디어 (저자를 통해, 단지 임신 일 16.5에서 출생하기 전에 마우스를 사용하고있는 표준 플라스틱 35mm 배양 접시에 기관을 제거 신생아, 신생아, 성인 동물 2).
- 의 외부에 부착 된 비 기관 관련 조직을 제거무딘 절개를하여 기관.
- 다만 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 1)를 사용하여 윤상 연골 아래에 가로 컷 후두를 제거합니다.
- 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 2)를 사용하여 바로 카리나 위의 가로 컷으로 왼쪽과 오른쪽 주 기관지 분지를 제거합니다.
- 부드럽게 미세 집게로 기관을 보유하고 점액과 혈액을 맑게하는 P1000 Pipetman과 P1000 팁 입욕 L15 매체의 ~ 1 ml의 루멘 2 ~ 3 회 세척하십시오.
- 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 1) 가로 컷을 사용하여 기관지의 3-4 링 세그먼트를 잘라.
- 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 2)를 사용하여이 짧은기도 세그먼트의 trachealis 근육의 중앙을 세로 방향으로 잘라.
- 마이크로 해부 가위 (그림 2C를 사용하여 기관 연골 고리의 중앙을 세로 방향으로 잘라 그림 2D에서와 같이)를 떠나> 라인).
4. 속눈썹 영상
- 이전 기관 조직 부문, L-15 매체의 100-200 μL와 35mm 유리 바닥 문화 요리의 중간에 내려 루멘 쪽.
- 속눈썹 생성 흐름이 기관의 조직 샘플을 (~ 1 × 10 11 입자 / ㎖ 또는 Fluoresbrite 2.5 % 수성 microsphere의 현탁액 20 μL / ㎖) 목욕 L-15 배지에 형광 0.20 ㎛의 작은 양의 마이크로를 추가 계량합니다.
- 실리콘 시트로 잘라 창에 의해 형성된 얕은 벽 챔버의 중앙에있는 기관의 샘플, 이미징 챔버 아래 기관 샘플 실리콘 시트면의 상단에 (위의 1-3 절차를 참조하십시오) 이전에 준비를 놓습니다 (그림 1 ).
- 조심스럽게 제자리에 고정 coverslip을 아래로 밀어 가장자리저기서을 넘는 L-15 용지를 제거조지아 P1000 팁 P1000 Pipetman.
- 100X 목적 및 DIC 광학 거꾸로 현미경에 35mm 유리 바닥 문화 요리와 기관 샘플을 장착합니다.
- 고속 카메라와 영화 수집 소프트웨어를 사용하여 200 섬모 운동의 영화를 수집 +의 섬모 기관 상피에 따라 초당 프레임 (그림 2D 박스, E 윤곽 : 녹화 된 동영상에서 예를 스틸 이미지) trachealis 근육의 가장자리를 웅크 리고 (보충 영화 1).
- FITC epifluorescent 이미징 및 저조도 CCD 카메라 (위의 장비 목록을 참조)를 사용하여, 속눈썹 생성 흐름 (보충 영화 2) 이후 정량화 할 수 있도록 섬모 기관 상피의 표면에 형광 microsphere의 운동의 영화를 수집합니다.
5. 섬모 운동성의 정량
- ImageJ에 소프트웨어 패키지에 DIC 이미지 한 영화를로드하고 I에서 설명하는 방법에 따라아인 Drummond는 13 박동 섬모를 건너 래스터 선을 그리는 선 도구를 사용합니다. 이 라인의 "다시 분할은"라인에 걸쳐 섬모 운동이 파형을 생성 kymograph 형식 이미지를 생성합니다. 각 파의 피크 사이의 픽셀 수는 그들을 측정 (하나의 픽셀 = 1 동영상 프레임) 분당 비트 (즉 Hz에서)의 수는 다음 계산 될 수있는 것입니다.
- ImageJ에 소프트웨어 패키지로 속눈썹을 흐름이 생성 부하 형광 구슬 영화를 측정하고 수동으로기도 상피의 표면에 형광 구슬을 추적하고 소프트웨어를 추적 각 비드 비드 속도와 방향성을 생성하도록 MTrackJ 플러그인 14을 사용합니다.
치는 속눈썹의 거리로 흐름을 정량화하는 강력한 측정 유량 크기에 영향을 미칠 수있는 형광 구슬을 사용하는 경우주의해야합니다. 보충 영화 2 구슬 운동은 이것의 좋은 예입니다. 이 예제 비드의운동 박동 섬모의 표면에 빠르고 훨씬 더 멀리 목욕 미디어 비즈 끊깁니다. 이를 위해 제어하려면, 구슬 트레이싱은 정확한 비교를 할 수 있도록 모든 샘플에있는 섬모 상피 위의 고정 된 거리에서 수집해야한다. 마지막으로, 유체의 흐름에 대한 대표적인 데이터를 얻기 위해, 구슬은 가급적 대해 추적해야한다, 우리는 유체 흐름을 계산하기위한 10 + 섬모 세포를 커버 비드 트랙을 사용하는 것을 선호합니다.
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Representative Results
동영상 재생 100 %, 속눈썹 비트 (보충 영화 2의 방향으로 눈에 띄는 흐름; 통제기도 섬모가 명확하게 볼과 조정 방법 (동영상 재생이 15 % 실시간으로 느려집니다 보충 영화 1)에서 이길 볼 수 있어야합니다 ) 시간 진짜. 섬모 영화의 정량은 그림 3에서 본 것과 유사한 결과를 얻을 수 있어야합니다. 형광 구슬의 추적 섬모 생성 유속의 측정 (그림 3D)을 허용하면서 고속 DIC 영화 컬렉션은 가능한 속눈썹 비트 주파수 (그림 3C)의 정량을하고 섬모 구타 모양의 질적 평가에 대한 좋은 이미지를 제공합니다 및 방향성 (그림 3E).
우리는 선형 흐름의 인덱스를 제공하기 위해 방향성을 사용합니다. 방향성은 형광 구슬 (즉, 최단으로 여행의 총 변위로 나누어 계산거리 추적의 시작과 끝 포인트) 전체 추적을 통해 형광 구슬을 이동하는 사이의 거리. 직선 경로에서 광범위하게 구불 구불 한 형광 구슬 1보다 훨씬 적은 방향성을해야합니다 동안 따라서, 직선으로 이동 형광 구슬은 하나의 방향성을 것입니다.
우리는 섬모 비트 기능에 띄는 변화 밖으로 시간에 대한 샘플을 몇 군데있다.
그림 1. 문화 요리 설치 및 기관 샘플 위치의 확대 아이소 메트릭 뷰. NB : coverslip에와 실리콘 시트가 배양 접시에 기관의 샘플을 넣어 이전에 조립해야합니다.
그림 2. (절차를 참조 레이블에 대한 설명은 3.2-3.8 단계) 최종 영상화 결과 (E)에 손상 기관 (A)에서 시작,이 프로토콜을 사용하여 마우스 기관지 절개의 예. AD의 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다. E의 스케일 바는 25 μm의를 나타냅니다.
그림 3. 예상 결과는 프로토콜에 의해 준비로 야생형 마우스의 기관 샘플을 사용하여 얻은 여기에 설명. 고속 DIC 동영상 (대표 DIC 영화에 대한 보충 영화 1 참조)에서 (A) 단일 프레임. (B) 이동 트랙 surfa에 걸쳐 네 개의 형광 구슬기관 상피 세포 샘플의 CE (대표 형광 영화 보완 동영상 2 참조). (C) 속눈썹 비트 주파수가 고속 DIC 섬모 운동성 영화 (6 마우스 tracheas에서 n은 = 41 임의의 점 측정)에서 정량화. (D) 흐름 속도 및 (E) 흐름의 방향성은 기관 상피 샘플 (6 마우스 tracheas에서 n은 = 31 형광 구슬 트레이싱)의 표면에 형광 구슬의 움직임을 추적에서 정량화. 데이터는 평균 ± SEM을로 치환된다. 스케일 바 10 μm의.
보충 영화 1. 속눈썹 비트 모양과 섬모 생성 된 흐름을 보여 DIC 영화는 야생형 마우스 기관 샘플을 사용하여 관찰 하였다. 재생 30 프레임 동안 영화는 200 FPS에서 수집되었다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 영화 2. 속눈썹 GE의 영화형광 마이크로 및 epifluorescent 현미경 0.20 μm의를 사용하여 야생형 마우스 기관 예제를 통해 nerated 흐름. 영화 수집 및 플레이 백 15 프레임입니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
속눈썹 비트 주파수 측정 (CBF)는 고성능 현미경 목표와 빠른 이미지 수집 하드웨어 13,15을 사용하여 비교적 쉽고, CBF 측정은 건강과 질병 중에 점막 섬모 허가를 조사하고 대부분의 연구의 기초를 형성 이유를 설명합니다. CBF 측정 혼자 CBF의 점막 섬모 정리, 측정을 이해하기위한 필수적인 반면, 섬모 생성 흐름을 측정하기가 더 어렵 자주 무시되는 둘 중 속눈썹 비트 파형 모두의 근본적인 중요성을 무시하고 CBF와 연관되지 않을 수 있습니다. CBF 증가 섬모 생성 흐름과 일치하지 않을 수도 증가하는 방법의 예는 DNAH11 돌연변이를 가진 일부 환자에서 볼 수 있습니다. DNAH11는 axonemal dynein 중쇄 단백질, 모두 hyperkinetic (빠른) 섬모 비트와 점막 섬모 정리 16 문제를 일으킬 것으로 예상되는 비정상적인 섬모 비트 파형을 일으키는 것으로보고 된 어떤 돌연변이입니다. significa우리의 프로토콜 NT의 장점은 섬모 구타 모양과 속눈썹의 고해상도 이미징을위한 최적 섬모의 프로필보기를 허용, 속눈썹 비트 방향에 직각으로 속눈썹을 쉽게 시각화 할 수의 표면에 유체 흐름을 생성하는 것입니다 따라서 속눈썹 비트 파형 및 / 또는 섬모와 CBF의 직접 비교를 허용 치고 섬모는 단일 샘플 내에서 흐름을 생성.
이 기술의 또 다른 장점은있는 그 속눈썹입니다 갓 기관지 따라서 CBF와 섬모 생성 흐름과 쉽게 관계를 허용, 호흡기 상피의 표면 전체에 걸쳐 조정 방식으로 이길 수있는 능력을 유지 수확. 이러한 조정 섬모 운동은 종종 제대로 섬모충과 임의의 방향으로 9,10의 속눈썹 비트를 보여 reciliating 마우스 기관 상피 문화에서 관찰되지 않습니다. 기관 상피의 기술을 사용하여 관찰 조정 섬모 비트는 여기에 설명 된 내가 할 수있는 수단을 제공 할 수 있습니다섬모 비트 조정 및 점막 섬모 청소율의 잠재적 인 역할을 규제하는 메커니즘을 nterrogate.
연구는이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 기관 표면 (그림 2A)에서 지방과 결합 조직의 삭제 등 기관의 준비, 그리고 길이 방향 trachealis 근육 (그림 2B, 2 호선)의 중간을 절단합니다. 우리는 조직 청산 이후 trachealisotomy 모두에 필수적인 좋은 마이크로 해부 가위를 사용하여 찾을 수 있습니다. 또한, 우리는 여기에 trachealis 근육이 넓은이기 때문에 쉽게 기관의 왼쪽과 오른쪽 차 기관지로 분기합니다 카리나에 바로 앞쪽에 기관의 아래 부분을 사용하여 찾을 수 있습니다. 그러나 충분한 경험을 가진 기관의 길이, 또는 실제로 차 기관지는 섬모 운동과 섬모 흐름을 생성하는 고품질의 동영상을 생성하는 데 성공적으로 사용 할 수 있습니다.
기술 가능이 프로토콜과 관련된 문제는 이미징 및 / 또는 샘플에 초점 반입 할 수없는 동안 이동 기관 샘플을 이용하실 수 있습니다. L-15 너무 많은이 샘플 추가 및 / 또는 이미징 챔버 커버 슬립이 제대로 누르지되지 않은 경우 이러한 문제가 모두 발생할 수 있으며이 샘플이 샘플 운동의 결과로 커버 슬립 챔버 또는 부동 샘플에서 뜨는 원인 위의 초점면에 초점 불가능하고. 이 문제를 방지하려면 그것은 각 기관의 샘플을 마운트하는 데 사용되는 액체의 양을 시도하고 최소화하는 것이 중요합니다.
이 기술의 가능한 제한은 섬모 생성 된 유체 흐름의 측정 완전히 생체 점막 섬모 수송 일치하지 않을 수 있습니다. ~ 10 ㎛ / 초 섬모 흐름이 생성됩니다 우리의 발견은 마우스 생체 기관 17 사용하여보고 100 μm의 / 초 점막 섬모 수송보다 훨씬 적습니다. 이러한 차이는 아마도 OPP와 같은 미디어에 빠져들되는 섬모에 의한단순히 공기 - 액체 인터페이스를 통해 점액의 얇은 층을 이동하는 osed. 그럼에도 불구하고,이 방법은 서로 다른 샘플 사이의 섬모 운동의 상대적 비교를위한 좋은 유틸리티가있다.
그것은 여기에 제시된 실험 기술과 데이터가 상온에서 실시하는 동안, 온도 자체가 섬모의 활동을 조절에 중요한 역할을한다는 것을 주목해야한다. 인간의 코와 기관지 샘플 CBF는 선형 20-45 ° C ~ 18 본 CBF의 작은 증가, 5-20 ° C 사이의 온도에 상관 할 볼 수 있습니다. 우리는 마우스기도 샘플 (게시되지 않은 관찰)의 온도와 CBF 사이의 유사한 관계를 참조하십시오. 소설 돌연변이 생쥐의 섬모 운동에서 가능한 결함의 신속한 평가를위한 상온에서 우리는 기록 섬모 활동하면서 따라서, 우리는 또한 생리적 조건 하에서 섬모의 활동을 결정하기 위해 37 ° C에서 몇 가지 샘플을 품어. 이 표준 현미경 배양 채널을 달성하기호박은 37 샘플을 유지하는 데 사용할 수 있습니다 ° C.
이 프로토콜에 대한 간단한 수정은 같은 약리 대리인의 역할, 온도, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하 등의 기계적 요인 등의 요인의 넓은 범위에 의해기도 섬모 활동의 규제를 평가하기위한 강력한 도구를 할 것 기도 섬모 기능 및 생성 /기도 섬모 비트의 유지 보수.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 프로젝트는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소에서 NIH 교부금 U01HL098180에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐의 공식 견해를 대변하지 않습니다, 및 혈액 연구소 또는 국립 보건원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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