שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

Summary

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

Abstract

טכניקת הדמיה vivo לשעבר עכבר הנשימה epithelia לניתוח כמותי של תפקוד ריסי ניעתי חשוב לתובנה פונקצית אישור mucociliary כבר נקבע. שנקטפו זה עתה בעכבר קנה הנשימה היא לחתוך longitudinally דרך שריר trachealis ורכובה בתא מוקף חומה רדוד על צלחת זכוכית בעל תחתית. המדגם קנה הנשימה ממוקם לאורך הציר הארוך שלה כדי לנצל את היתרון של שריר trachealis להתכרבל longitudinally. זה מאפשר הדמיה של תנועת הריסים בתצוגת הפרופיל לאורך קנה הנשימה כולה. קטעי וידאו ב200 מסגרות / שני מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ לעומת פער התערבות ומצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה, כדי לאפשר ניתוח כמותי של תדירות פעימת ריסים וצורת גל הריסים. עם התוספת של חרוזי ניאון במהלך הדמיה, גם ניתן לקבוע את זרימת נוזל ריסים שנוצרו. זמן הפרוטוקול משתרע על פני כ -30 דקות, עם 5 דקות לחדר הכנה, 5-10 דקות למדגםהרכבה, ובמשך 10-15 דקות videomicroscopy.

Introduction

ניתוח של תפקוד ריסי ניעתי בepithelia הנשימה חשוב בניסוי להבהרת גורמים הגנטיים וסביבתיים שיכול להשפיע על אישור mucociliary ובריאות ריאתי ^1. הפרוטוקול פשוט פיתחה להדמית עכבר הנשימה epithelia מספק שיטה יעילה לחקור את תנועתיות ריסי נשימה במודלים של עכברים שעברו מוטציה ונוקאאוט ודורש מיומנויות בסיסיות בלבד בנתיחת רקמות קנה הנשימה עכבר והדמיה vivo לשעבר של תנועתיות ריסי נשימה עם videomicroscopy ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה הוקם ומעודן במהלך מסך mutagenesis עכבר בקנה מידה גדול, כדי לאפשר הערכה מהירה של תפקוד ריסי ניעתי (תדירות פעימות ריסים, צורת פעימת ריסים, זרימה שנוצרה cilia) במוטנטים עם מחלת לב מולדת הקשורים heterotaxy ^2-5.

טכניקות קיימות בשימוש כדי ללמוד תנועתיות ריסי דרכי הנשימה יכולה להיות מקובצים או סוג vivo לשעבר החריף או לוןטווח גר במבחנת גישות ניסיוניות. ניסויים אקוטיים כוללים הדמיה vivo לשעבר של ביופסיות אדם מכחול האף / נשימה ^6,7 וניתוח של סעיפי נשימה רוחביים פשוטים ^8. במבחנת הגישות להשתמש בטכניקות של תרביות תאים שונות כדי ליצור גיליונות של epithelia מובחן ריסים כמו בתרבויות ממשק נוזלי אוויר או תרבויות השעיה נשימה ^9-11. עם זאת, טכניקות הנשימה reciliation epithelia אלה דורשות השקעה משמעותית מאוד בזמן ובאימונים לפני כל תאי אפיתל ריסים שמישים מיוצרים לניסויים (4-6 שבועות ^9,10). בעוד ניתוח vivo לשעבר חריף של ביופסיות מברשת אפיתל נשימה משמש בדרך כלל למחקרים קליניים בבני אדם, שיטה זו אינה שמישה במחקרי עכבר בשל החמירה פגיעה ברקמות מכאנית ^12.

הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה לניתוח של mousדואר קנה הנשימה דרכי הנשימה epithelia הוא לא רק פשוט לביצוע, אבל זה לא דורש כישורים מיוחדים ולא לנתיחה כל ציוד מיוחד מלבד אלו סטנדרטי להדמיה על ידי videomicroscopy. ישנם יתרונות רבים לפרוטוקול זה פשוט. ראשית, כפי שקציר הרקמה מקנה נשימת העכבר הוא מהיר וקל לביצוע, שהוא מאפשר להערכה מהירה של תפקוד ריסי נשימה במספר רב של עכברים. זה יכול לכלול ניתוח חריף של ההשפעות לטווח הקצרים של טיפולים שונים במבחנה. שנית, להיות טכניקת vivo לשעבר, אפיתל דרכי הנשימה הריסים נשאר קשור אליו שבבסיס רקמות תומכות ובכך לשמור על מסלולים הקשורים תא איתות. לכן בהשוואה במבחנת reciliated הנשימה epithelia, הכנה זו היא ייצוג טוב יותר של הסביבה הטבעית ברקמות גוף חייה. שלישית, פרוטוקול זה מאפשר רכישה של מספר הפרמטרים כמותיים שונים שיכול לספק הערכה האובייקטיבית של f ריסי ניעתימשיחה. לבסוף, בניגוד לשיטות קיימות אחרות לשם ויזואליזציה ריסי דרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הריסים בזווית ישרה לכיוון הכה הריסים, המאפשר צפייה בפרופיל של הריסים שהם אופטימלי להדמיה ברזולוציה גבוהה של פעימת ריסים ודור גל metachronal .

פרוטוקול זה יכול להיות שונה במספר הדרכים לטפל במגוון רחב של צרכי ניסיוניים, כגון התפקיד של סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר על תפקוד דרכי הנשימה ריסים ודור / תחזוקה של קצב נשימה ריסים והתפשטות גלי metachronal.

Protocol

1. התקנת ריאגנטים

1.1 Dissection והדמיה בינוני

L-15 בינוניות של ליבוביץ (L15) הוא השלים עם FBS (10%) ופניצילין, סטרפטומיצין (מ"ל של פניצילין G נתרן ו100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סטרפטומיצין סולפט 100 יחידות /) משמש גם במהלך המסיק וההדמיה של דגימות קנה נשימה.

2. עצרת לשכת תרבות רדודה מוקפת חומה

התא נהג לקיים רקמה מקנה נשימה מוצג באיור 1. רצפת החדר היא זכוכית תחתית צלחת תרבות 35 מ"מ. למעלה ובצד של החדר נוצרת על ידי הנחת פיסה קטנה של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ"מ על צלחת הזכוכית. שולי הגיליון הוא לחתוך כדי להתאים את צלחת תחתית העגולה והמרכז גזוז נוסף ליצירת חדר מרכזי רדוד (ראה שלבים 2.1-2.3). בחלק העליון של המכלול הזה, תלוש זכוכית עגול 18 מ"מ כיסוי ממוקם כדי ליצור תא סגור מתאים להדמיה.

1. לחלוטין לכסות תלוש 18 מ"מ עגול עם מכסה זכוכית מרובע של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ"מ.
2. עם מספריים לנתיחה חדים רגילים לקצץ את יריעות סיליקון העודפים ממסביב לקצה של להחליק את המכסה (וכתוצאה מכך שכבה מעגלית של יריעות סיליקון).
3. עם אזמל חד לחתוך ולהסיר מרובע של יריעות סיליקון (כ 10 מ"מ מרובע) מאמצע להחליק את המכסה המכוסה (ובכך ליצור את החלק העליון והצדדים של חדר ההדמיה) מרכזית.

3. קציר והכנת קנה הנשימה

1. להרדים עכברים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים מקומי ולהשתמש בועדה ו / או הנחיות ממשלתיות ולהסיר קנה נשימה לתוך צלחת תרבות סטנדרטי פלסטיק 35 מ"מ עם מספיק L15 תקשורת לרקמה לצלול (מחברים השתמשו בעכברים ממש לפני הלידה בהריון היום 16.5, ועד בעלי חיים יילוד, יילודים, ומבוגר ^2).
2. סרה של רקמה שאינה משויכת קנה הנשימה מחוברת לחלק החיצוני שלאת קנה הנשימה באמצעות נתיחה בוטה.
3. הסר את הגרון עם חתך רוחבי מתחת לסחוס cricoid באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 1).
4. הסר את סניפי הסימפונות העיקריים ימין ועל שמאל עם חתך רוחבי מעל קארינה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 2).
5. בעדינות להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים עדינים ולשטוף את 2-3 פעמים עם הלום ~ 1 מ"ל של מדיום הרחצה L15 עם Pipetman P1000 P1000 ועצה כדי לנקות את כל ריר ודם.
6. גזור את קטע 3-4 טבעת של קנה הנשימה באמצעות חתך רוחבי עם מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, שורת 1).
7. לחתוך longitudinally דרך אמצע שריר trachealis של קטע קצר זה קנה הנשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, קו 2).
8. לחתוך longitudinally במרכז של טבעות הסחוס קנו נשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 ג באיור 2 ד).

4. ההדמיה cilia

1. מגזרי העברה קנה נשימת רקמות, לוואי לומן למטה, אל אמצע צלחת 35 מ"מ זכוכית תחתונה תרבות עם 100-200 μl של מדיום L-15.
2. כדי לכמת את הזרימה שנוצרה ריסים להוסיף כמות קטנה של 0.20 מיקרומטר ניאון microspheres למדיום L-15 רחצה דגימת הרקמה מקנה נשימה (~ 1 x 10 ¹¹ חלקיקים / מ"ל או 20 μl / מ"ל של ההשעיה microsphere המימית Fluoresbrite 2.5%).
3. מקם את חדר ההדמיה שהוכן קודם לכן (ראה נוהל 1-3 לעיל) על גבי מדגם צד גיליון סיליקון קנה הנשימה למטה, עם מדגם קנה הנשימה הממוקם באמצע החדר המוקף חומה הרדוד שהוקם על ידי החלון חתוך ליריעות סיליקון (איור 1 ).
4. דחף בעדינות מטה על coverslip כדי להבטיח מקום ובלהסיר כל L-15 תקשורת עודפת ממנצלים הקצוותGA P1000 קצה וP1000 Pipetman.
5. הר צלחת 35 מ"מ הזכוכית התחתונה התרבות ומדגם קנה הנשימה במיקרוסקופ הפוכה עם אופטיקה 100X אובייקטיבית ודסק"ש.
6. באמצעות תוכנת רכישת סרט מצלמה ומהירות גבוהה לאסוף סרטים של תנועתיות ריסים ב 200 + פריימים לשנייה לאורך קנה הנשימה epithelia הריסים של מכורבל קצה של שריר trachealis (איור 2 ד מפורטים התיבה, E: ירושלים עדיין תמונה מסרט מוקלט) (סרט משלים 1).
7. באמצעות הדמיה epifluorescent FITC ואור נמוך מצלמת CCD (ראה רשימת ציוד למעלה), לאסוף סרטים של תנועת microsphere ניאון על פני ריסי epithelia קנה הנשימה על מנת לאפשר כימות מאוחר יותר של זרימה שנוצרה ריסים (משלים סרט 2).

5. Quantitation של תנועתיות צילה

1. טען סרטים צלמו דסק"ש לחבילת תוכנת ImageJ ולאחר הטכניקה שתוארה על ידיעין דראמונד ¹³ להשתמש בכלי הקו למתוח קו סריקה חוצה את הריסים פועמים. "Reslice" של קו זה יוצר תמונה מסוג שבו רשם גלי תנועת ריסים מעבר לקו מייצרת דפוס גל. מספר הפיקסלים בין כל שיא גל נמדד (פיקסל אחד = מסגרת סרט אחד) שממנו ניתן לחשב את מספר הפעימות לדקה (כלומר הרץ).
2. כדי למדוד סרטי cilia תזרים עומס ניאון חרוז לתוך חבילת תוכנת ImageJ, ולהשתמש בתוסף MTrackJ ¹⁴ כדי לעקוב אחר אופן ידני חרוזי ניאון על פני השטח של epithelia קנה הנשימה ולתת לתוכנה ליצור מהירות ויווני חרוז לכל חרוז במעקב.

יש להקפיד בעת שימוש בחרוזי ניאון לכמת זרימה כמו המרחק מהריסים פועמים חזק יכול להשפיע על עוצמת זרם נמדדת. תנועת חרוז בתוספת 2 סרט היא דוגמה טובה לכך. בדוגמה זו חרוזהתנועה היא מהירה על פני השטח של ריסי מכות ונושרים באופן משמעותי לחרוזים רחוקים יותר בתקשורת הרחצה. כדי לשלוט על זה, צריכים להיות שנאסף העתקי חרוז רק במרחק קבוע מעל epithelia הריסים בכל הדגימות על מנת לאפשר השוואה נכונה צריכה להתבצע. לבסוף, כדי לקבל נתונים יציגים בזרימת נוזל, חרוזים צריכים להיות במעקב במשך זמן רב ככל האפשר, אנחנו מעדיפים להשתמש בשירים חרוזים שמכסים תאי 10 + ריסים לחישוב זרימת נוזל.

Representative Results

ריסי נשימה שליטה צריכים להיות לעין וראה להכות באופן מתואם (סרט משלים 1; צפייה בסרט מואטת עד 15% בזמן אמת), עם זרימה מורגשת בכיוון של קצב ריסים (סרט משלים 2; צפייה בסרט היא 100% בזמן אמת). Quantitation של סרטי cilia אמור להניב תוצאות דומות לזה שניתן לראות באיור 3. אוסף של סרטי דסק"ש במהירות גבוהה מאפשר כימות של תדירות פעימת ריסים (איור 3 ג) ונותן תמונות טובות להערכה איכותית של צורת פעימת ריסים, תוך המעקב של חרוזי ניאון מאפשר למדידת מהירות זרימת ריסים שנוצרו (איור 3D) ויווניות (איור 3E).

אנו משתמשים כביווניות לתת מדד של זרימה ליניארי. יווניות מחושבת על ידי חלוקת העקירה המוחלטת נסעה בחרוז (כלומר ניאון הקצר ביותרמרחק בין הנקודות ההתחלה וסיום של החברה לאיתור) על ידי מרחק מהלכי חרוז ניאון מעל כל העקבות. לפיכך, ניאון חרוז נע בקו ישר היה הכיווניות של אחד ואילו חרוז ניאון מתפתל בהרחבה מדרך ישרה יהיה לי יווניות הרבה פחות מ 1.

יש לנו דוגמאות לצלמנו עד שעה ללא כל שינוי מורגש בתפקוד פעימת ריסים.

איור 1. מבט איזומטרי מוגדל של התקנת צלחת התרבות ומיצוב מדגם קנה הנשימה. נ.ב.: גיליון coverslip וסיליקון צריך להיות התאסף לפני לשים מדגם קנה נשימה לתוך צלחת התרבות.

איור 2. דוגמה לנתיחת עכבר קנה הנשימה באמצעות פרוטוקול זה, החל מקנה נשימה שלמה () לתוצאה הסופית הדמיה (ה) (ראה הליך על שלבים 3.2-3.8 להסבר של תוויות). סולם ברים בספירה מייצגים 500 מיקרומטר. בר הסולם ב E מייצג 25 מיקרומטר.

איור 3. תוצאות חזויות הושגו באמצעות דגימת עכבר סוג בר קנה הנשימה כפי שהוכן על ידי הפרוטוקול מתואר כאן. () פריים בודד מסרט דסק"ש במהירות גבוהה (ראה סרט משלים 1 לסרט דסק"ש נציג). (ב ') מסלולי תנועה של ארבעה חרוזי ניאון ברחבי surfaספירה של מדגם epithelia קנה הנשימה (ראה משלים סרט 2 לסרט ניאון נציג). (ג) תדירות פעימת צילה לכמת מסרטי תנועתיות במהירות גבוהה דסק"ש cilia (n = 41 מדידות נקודה אקראית מ6 קנה נשימת עכבר). (ד) מהירות זרימה וכן (ה) כיווניות זרימה לכמת ממעקב אחר תנועת חרוז ניאון על פני השטח של דגימות epithelia קונים נשימה (n = 31 העתקים מחרוז ניאון 6 קנה נשימת עכבר). הנתונים נעקרו כממוצע ± SEM. ברים סולם 10 מיקרומטר.

משלימה סרט 1. סרט דסק"ש מראה צורת פעימת ריסים וריסי זרימה נוצרה נצפה באמצעות מדגם קנה הנשימה עכבר wildtype. הסרט נאסף ב200 תמונות בשניות, בזמן ההשמעה היא 30 תמונות בשניות. לחץ כאן לצפייה בסרט.

משלימה סרט 2. סרט של הריסים geזרימת nerated פני מדגם קנה הנשימה באמצעות עכבר wildtype 0.20 מיקרומטר microspheres ניאון ומיקרוסקופ epifluorescent. אוסף סרטים ולנגן הוא 15 תמונות בשניות. לחץ כאן לצפייה בסרט.

Discussion

מדידה של תדירות פעימת ריסים (CBF) היא קלה יחסית באמצעות מיקרוסקופ כוח מטרות גבוהות וחומרת רכישת תמונה מהירה ^13,15, ומסבירה מדוע מדידות CBF מהוות את הבסיס של רוב המחקרים החוקרים אישור mucociliary בבריאות ובחוליים. עם זאת, בעוד CBF המדידה היא חיונית להבנת אישור mucociliary, מדידה של CBF לבד מתעלם החשיבות הבסיסית של שניהם זרימה נוצרה ריסי וצורת גל פעימת ריסים, אשר שניהם הם יותר קשים למדידה, לעתים קרובות התעלמו, ולא יכול לתאם עם CBF. דוגמה לאופן שהגדיל את CBF לא יכול להתכתב עם זרימה מוגברת הריסים שנוצרו נראית בחלק מהחולים עם מוטציות DNAH11. DNAH11 הוא חלבון axonemal dynein כבד שרשרת, מוטציות בו דווחו לגרום לשניהם הכו hyperkinetic (מהר יותר) הריסים וצורת גל פעימת ריסים חריגים שצפויה לגרום לבעיות עם אישור mucociliary ^16. Significaיתרון NT של הפרוטוקול שלנו הוא שהיא מאפשרת להדמיה קלה של הריסים בזווית ישרה לכיוון הכה הריסים, המאפשרת צפייה בפרופיל של ריסים שהוא אופטימלי להדמיה ברזולוציה גבוהה של צורת פעימת ריסים וריסים נוצרה זרימת נוזל על פני השטח של ריסי מכות, ובכך מאפשרים השוואה ישירה של CBF עם גל ריסי פעימה ו / או ריסים נוצרו זרימה בתוך מדגם יחיד.

יתרון נוסף של שיטה זו הוא שהריסים בקנה נשימה שנקטפו זה עתה לשמור על היכולת שלהם להכות באופן מתואם על פני השטח כולו של האפיתל בדרכי הנשימה, ובכך מאפשרת התאמה קלה בין CBF וזרימה נוצרה ריסים. תנועת הריסים מתואמת כזה לא נצפה בתרבויות reciliating עכבר קונים נשימת אפיתל, אשר לעתים קרובות ciliate גרוע ולהראות פעימת ריסים בכיוונים אקראיים ^9,10. פעימת הריסים מתואמת נצפתה באמצעות טכניקת epithelia קנה הנשימה מתוארת כאן יכולה לספק את האמצעים ליnterrogate מנגנוני ויסות תיאום פעימת הריסים והתפקיד הפוטנציאלי שלו באישור mucociliary.

חלק המאתגר ביותר של פרוטוקול זה למחקרים יהיה הכנת קנה הנשימה, כולל סליקה של רקמות שומן וחיבור ממשטח קנה הנשימה (איור 2 א), וlongitudinally חיתוך דרך אמצע שריר trachealis (איור 2b, קו 2). אנו מוצאים את השימוש במספריים לנתיחה מיקרו טוב חיוניים לרקמות והן סליקת trachealisotomy שלאחר מכן. יתר על כן, אנו מוצאים אותו קל יותר לשימוש בחלקו התחתון של קנה הנשימה רק הקדמי לקרינה שבו קנה הנשימה מתפצלת לסמפונות העיקרית ימין ועל שמאל כמו השריר trachealis כאן הוא רחב ביותר. עם זאת, עם ניסיון מספיק, בכל אורכו של קנה הנשימה, או אכן הסמפונות הראשונית יכול לשמש בהצלחה להפקת סרטים באיכות גבוהה של תנועתיות ריסים וריסים לייצר תזרים.

אפשרי טכניבעיות הקשורות לפרוטוקול זה כולל מדגם קנה הנשימה נע במהלך הדמיה ו / או המדגם לא להיות מסוגל להביא אל מוקד. שתי הבעיות הללו יכולות להיווצר אם יותר מדי L-15 שהוסיף במדגם ו / או להחליק את מכסה תא ההדמיה לא לחץ היטב, זה גורם המדגם לצוף בתוך תא הכיסוי להחליק וכתוצאה מכך תנועת מדגם או המדגם צף מעל למישור מוקד עשיית פוקוס בלתי אפשרי. כדי להימנע מכך חשוב כדי לנסות ולמזער את כמות הנוזל משמשת הר כל דגימת קנה הנשימה.

מגבלה אפשרית של שיטה זו היא שהמדידה של זרימת נוזל ריסים שנוצרו עשוי שלא להתאים לחלוטין בתחבורה mucociliary vivo. הממצא של זרימה שנוצרה ריסים של ~ 10 מיקרומטר / שני שלנו הוא באופן משמעותי פחות מאשר התחבורה mucociliary שניות 100 מיקרומטר / דיווח על השימוש בעכבר vivo קנה הנשימה ^17. הבדל זה הוא ככל הנראה בשל הריסים להיות שקועים בתקשורת כמולosed פשוט נע בשכבה דקה של ריר על פני ממשק אוויר הנוזלי. עם זאת, לשיטה זו יש כלי נהדר להשוואה היחסית של תנועתיות הריסים בין מדגמים שונים.

יצוין, כי בעוד שהטכניקה הניסויית והנתונים המוצגים כאן נערכה בטמפרטורת חדר, טמפרטורה עצמו משחקת תפקיד משמעותי בויסות פעילות ריסים. CBF באדם האף ודגימות קונים נשימה נתפסת להיות מתואם באופן ליניארי עם טמפרטורה בין 5-20 מעלות צלזיוס, עם עלייה קטנה בCBF ראתה בין 20-45 מעלות צלזיוס ^18. אנחנו רואים את מערכת יחסים דומות בין הטמפרטורה וCBF בדגימות נשימה (עכבר תצפיות שלא פורסמו). וכך, בעוד אנו ריסי פעילות שיא בטמפרטורת חדר להערכה מהירה של פגמים אפשריים בתנועתיות ריסים בעכברים שעברו מוטציה חדשים, אנחנו גם דגירה כמה דוגמאות על 37 מעלות צלזיוס לקביעת פעילות ריסים בתנאים פיסיולוגיים. כדי להשיג את פרק דגירה מיקרוסקופ תקן זהענבר ניתן להשתמש בו כדי לשמור על דגימות ב 37 ° C.

שינויים פשוטים בפרוטוקול זה יהיה להפוך אותו לכלי רב עוצמה להערכת הסדרת פעילות ריסי דרכי הנשימה על ידי מגוון רחב של גורמים, כגון תפקיד של סוכנים תרופתיים, טמפרטורה, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר על תפקוד ריסי נשימה ודור / תחזוקה של פעימת ריסי דרכי הנשימה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	No phenol red
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30088.03
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2x fine forceps	Roboz	RS-4976
Dissection scissors	Roboz	RS-5676
Micro dissection scissors	Roboz	RS-5620
Scalpel	Roboz	RS-9801-15
P1000 pipetman	Gilson, Inc	F123602
P1000 tips	Molecular BioProducts	2079E
18 mm round glass cover slips	Fisher Scientific	430588
Plastic 35 mm culture dishes	Corning	430588
Glass bottom 35 mm culture dishes	Warner Instruments	W3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters	Lecia	DMIRE2	Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters	Lecia		Brand is not critical.
Microscope stage Incubator	Lecia	11521749	Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field	Vision Research	Phantom v4.2	Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera	Hamamatsu	C9100-12	Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis software	National Institutes of Health	ImageJ with MtrackJ plugin