Summary
Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.
Abstract
Een ex vivo techniek voor beeldvorming muis luchtwegepitheel voor de kwantitatieve analyse van beweeglijke cilia functie belangrijk inzicht in mucociliaire klaring functie werd vastgesteld. Vers geoogste muis luchtpijp wordt overlangs doorgesneden de trachealis spieren en gemonteerd in een ondiepe ommuurde kamer op een glazen bodem schotel. De trachea monster geplaatst langs zijn lengteas te profiteren van de trachealis spier langsrichting krullen. Dit maakt beeldvorming van ciliaire beweging in het profiel te bekijken langs de gehele tracheale lengte. Video met 200 frames / sec worden verkregen met behulp van differentieel interferentie contrast microscopie en een hoge-snelheid digitale camera aan de kwantitatieve analyse van cilia slagfrequentie en ciliaire golfvorm laten. Met de toevoeging van fluorescerende kralen tijdens beeldvorming, cilia gegenereerd fluïdumstroming ook kan worden bepaald. Het protocol tijd omspant ongeveer 30 minuten, met 5 min voor Kamer voorbereiding, 5-10 minuten voor het monstermontage en 10-15 min bij videomicroscopie.
Introduction
Analyse van beweeglijke cilia functie in het luchtwegepitheel is experimenteel belangrijk voor het ophelderen van de genetische en omgevingsfactoren die mucociliaire klaring en pulmonaire gezondheid 1 beïnvloeden. De eenvoudig protocol ontwikkeld voor de beeldvorming van de muis luchtwegepithelen biedt een efficiënte methode om de luchtwegen trilharen beweeglijkheid ondervragen in mutant en knockout muismodellen en vereisen alleen basisvaardigheden in muis tracheaweefsel dissectie en ex vivo beeldvorming van de luchtwegen trilharen beweeglijkheid met een hoge resolutie videomicroscopie. Dit protocol werd opgesteld en verfijnd tijdens een grootschalige muis mutagenese screen om een snelle evaluatie van de beweeglijke trilharen functie (cilia slagfrequentie, cilia verslaan vorm, cilia gegenereerde stroom) toelaten in mutanten met een aangeboren hartaandoening in verband met heterotaxy 2-5.
Voor deze technieken om luchtwegen cilia beweeglijkheid studie kunnen worden gegroepeerd in hetzij de acute ex vivo aard of longer term in vitro experimentele benaderingen. Acute experimenten zijn ex vivo visualisatie van de menselijke neus / luchtwegen borstel biopten 6,7 en analyse van eenvoudige dwarse luchtwegen secties 8. De in vitro benaderingen gebruiken diverse celkweek technieken om vellen van gedifferentieerde trilharen epitheel, zoals in de lucht-water grensvlak culturen of luchtwegen suspensiekweken 9-11 genereren. Echter, deze luchtwegepitheel reciliation technieken vereisen zeer aanzienlijke investering in tijd en training voordat bruikbare gecilieerde epitheliale cellen worden geproduceerd in experimenten (4-6 weken 9,10). Terwijl acute ex vivo analyse van luchtwegepitheel borstel biopsies worden gewoonlijk gebruikt voor menselijke klinische studies, is deze methode niet bruikbaar muisstudies verergerd door mechanische weefselschade 12.
De techniek die in dit protocol voor de analyse van mouse tracheale luchtwegepitheel is niet alleen eenvoudig te voeren, maar vereist geen speciale vaardigheden of dissectie gespecialiseerde inrichtingen naast die standaard beeldvormend videomicroscopie. Er zijn veel voordelen aan deze eenvoudig protocol. Ten eerste, omdat de muis trachea weefsel oogsten is snel en eenvoudig uit te voeren, is het mogelijk een snelle vaststelling van de luchtwegen cilia functie in een groot aantal muizen. Dit zijn acute analyse van de korte termijn effecten van verschillende in vitro behandelingen. Ten tweede wordt een ex vivo techniek de trilharen luchtwegepitheel bevestigd blijft aan het onderliggende steunweefsel en daarmee geassocieerde signaaltransductie wegen behouden. Daarom in vergelijking met in vitro reciliated luchtwegepitheel, dit preparaat is een betere weergave van de natuurlijke in vivo weefselmilieu. Ten derde, dit protocol kan de verwerving van een aantal verschillende kwantitatieve parameters die de objectieve beoordeling van beweeglijke cilia f kan biedenzalving. Tenslotte, in tegenstelling tot andere methoden voor de luchtwegen trilharen visualisatie Dit protocol maakt visualisatie van de cilia loodrecht op de trilharen ritme richting, waardoor profiel te bekijken van de cilia die optimaal is voor een hoge resolutie afbeelding van cilia beat en metachronalgolven golfopwekking .
Dit protocol kan worden gemodificeerd op een aantal manieren om een groot aantal experimentele behoeften zoals de rol van farmacologische middelen, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals mucus belast luchtwegen trilharen functie en productie / onderhoud pakken luchtwegen trilharen beat en metachronalgolven golfvoortplanting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagentia Setup
1.1 Dissection en Imaging Medium
Leibovitz L-15 medium (L15) aangevuld met FBS (10%) en penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml penicilline G natrium en 100 ug / ml streptomycine sulfaat) wordt gebruikt zowel bij oogst en beeldvorming van trachea monsters.
2. Ondiepe Walled Cultuur Kamer Vergadering
De kamer gebruikt trachea weefsel wordt getoond in figuur 1. De vloer van de kamer is de glazen bodem 35 mm cultuur schotel. De boven-en zijkant van de kamer wordt gegenereerd door het plaatsen van een klein stukje van 0,3 mm dik siliconen lakens over de glazen schaal. De rand van het vel wordt gesneden om de ronde bodem gerecht past en het centrum is verder getrimd tot een ondiepe centrale kamer te vormen (zie stappen 2.1-2.3). Bovenop dit samenstel, wordt een 18 mm rond dekglaasje geplaatst op een kast voor beeldvorming genereren.
- Volledig bedekken van een 18 mm ronde glazen deksel slip met een vierkant van 0,3 mm dik siliconen lakens.
- Met standaard scherpe dissectie schaar knipt u de overtollige silicone beplating van rond de rand van het dekglas (resulterend in een cirkelvormige laag siliconen platen).
- Met een scherp scalpel uitgesneden en verwijderen van een centraal plein van siliconen platen (ongeveer 10 vierkante mm) uit het midden van de overdekte dekglas (en vormt aldus de bovenkant en zijkanten van de beeldvorming kamer).
3. Luchtpijp Oogst en bereiding
- Euthanaseren muizen in overeenstemming met de lokale institutionele verzorging van dieren en gebruik commissie en / of de overheid richtlijnen en verwijder luchtpijp in een standaard plastic 35 mm cultuur schotel met voldoende L15 media te dompelen weefsel (auteurs hebben muizen gebruikt net vóór de geboorte bij een zwangerschapsduur van 16.5 dag, tot pasgeboren, neonatale en volwassen dieren 2).
- Verwijder niet-trachea weefselschade te aan de buitenkant vande luchtpijp met stompe dissectie.
- Verwijder het strottenhoofd met een dwarse snede net onder de cricoid kraakbeen met behulp van micro-dissectie schaar (Figuur 2A, lijn 1).
- Verwijder de linker en rechter primaire bronchiale takken met een dwarse snede boven de carina met microdissectie schaar (Figuur 2A, lijn 2).
- Houd het luchtpijp met fijn pincet en spoel het lumen 2-3 keer met ~ 1 ml van het zwemwater L15 medium met een P1000 Pipetman en P1000 tip om alle slijm en bloed te wissen.
- Knip een 3-4 ringsegment van luchtpijp via een dwarse snede met micro dissectie schaar (Figuur 2B, lijn 1).
- Snijd lengterichting door het midden van de trachealis spier van deze korte luchtpijp segment met behulp van micro dissectie schaar (Figuur 2B, lijn 2).
- Snijd lengterichting door het midden van de tracheale kraakbeen ringen met behulp van micro-dissectie schaar (figuur 2C figuur 2D).
4. Cilia Imaging
- Transfer luchtpijp weefselsegmenten, lumen kant naar beneden, naar het midden van een 35 mm glazen bodem cultuur schotel met 100-200 ul van L-15 medium.
- Kwantificeren cilia gegenereerde stroom een kleine hoeveelheid van fluorescente 0.20 urn microsferen de L-15 medium zwemmen de trachea weefselmonster (~ 1 x 10 11 deeltjes / ml of 20 ul / ml van het Fluoresbrite 2,5% waterige suspensie van microsferen).
- Plaats de beeldvorming kamer voorheen opgesteld (zie Procedure 1-3 hierboven) op de bovenkant van de luchtpijp monster siliconen vel naar beneden, met de luchtpijp monster gelegen in het midden van de ondiepe ommuurde kamer gevormd door het raam gesneden in de siliconen platen (Figuur 1 ).
- Druk voorzichtig op de dekglaasje aan vast te zetten en eventuele overmaat L-15 media te verwijderen uit de randen usinga P1000 tip en P1000 Pipetman.
- Monteer de 35 mm glazen bodem cultuur schotel en luchtpijp monster op een omgekeerde microscoop met 100X objectieve en DIC optiek.
- Met behulp van een high-speed camera en film acquisitie software verzamelt films van cilia beweeglijkheid bij 200 + frames per seconde langs de trilharen tracheale epitheel van de opgerold rand van de trachealis spier (vak E Figuur 2D geschetst: bijvoorbeeld stilstaand beeld uit opgenomen film) (Aanvullende Movie 1).
- Met behulp van FITC epifluorescerende beeldvorming en een weinig licht CCD-camera (zie apparatuur lijst hierboven), het verzamelen van films van fluorescerende microbolletjes beweging over het oppervlak van de trilharen tracheale epitheel om later kwantificering van cilia opgewekte stroom (Aanvullend Movie 2) toestaan.
5. Kwantificering van Cilia Motiliteit
- Laad DIC belichte films in de ImageJ softwarepakket en volgens de procedure beschreven door I-techniekain Drummond 13 gebruiken de lijn tool om een raster lijn oversteken van het kloppend trilharen trekken. Een "reslice" van deze lijn genereert een kymograaf type afbeelding waar cilia beweging over de lijn genereert een golfpatroon. Het aantal pixels tussen elke golf piek is ze gemeten (een pixel = een filmbeeld) waaruit het aantal beats per minuut (dwz Hz) dan kan worden berekend.
- Om cilia gegenereerde stroom belasting fluorescerende kraal films te meten in de ImageJ software pakket, en gebruik de MTrackJ plugin 14 om handmatig fluorescerende kralen bijhouden over het oppervlak van de luchtpijp epitheel en laat de software genereren kraal snelheid en richting voor elke kraal bijgehouden.
Zorg moeten worden genomen bij het gebruik van fluorescerende kralen te stromen kwantificeren als de afstand van het kloppend trilharen kunnen sterk beïnvloeden gemeten stroom magnitude. De kraal beweging in Aanvullende Movie 2 is een goed voorbeeld van. In dit voorbeeld beadbeweging is snel aan het oppervlak van het verslaan van cilia en beduidend daalt af voor kralen verder weg in de baden media. Om controle hiervoor bead traceringen alleen worden op een vaste afstand boven de trilharen epitheel in alle monsters om correcte vergelijkingen worden gemaakt. Tenslotte, om representatieve gegevens over fluïdumstroming verkrijgen kralen worden bijgehouden voor zo lang mogelijk, we liever bead tracks die 10 + haarcellen bestemmen voor het berekenen van fluïdumstroming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Controle luchtwegen trilharen moet duidelijk zichtbaar zijn en gezien te verslaan in een gecoördineerde wijze (Aanvullende Film 1; filmweergave wordt vertraagd tot 15% real-time), met merkbare stroming in de richting van cilia beat (aanvullende Movie 2; filmweergave is 100% real time). Kwantificering van cilia films moeten de resultaten vergelijkbaar met dat in figuur 3 opleveren. Collectie van high-speed DIC films maakt de kwantificering van cilia slagfrequentie (figuur 3C) en geeft goede beelden voor kwalitatieve beoordeling van cilia verslaan vorm, terwijl het volgen van fluorescerende kralen maakt voor het meten van cilia gegenereerd stroomsnelheid (Figuur 3D) en richting (figuur 3E).
We maken gebruik van gerichtheid op een index van lineaire stroming geven. Directionaliteit wordt berekend door de totale verplaatsing afgelegd door een fluorescerende kraal (dwz de kortsteafstand tussen het begin-en eindpunt van de tracing) Door de afstand een fluorescerende kraal beweegt over het gehele spoor. Zo een fluorescerende kralen bewegen in een rechte lijn zal een richting in een terwijl een fluorescent bead meanderende sterk op een rechte baan een richtingsgevoeligheid minder dan 1 hebben.
We hebben monsters afgebeeld voor maximaal een uur met elke merkbare verandering in cilia verslaan functie.
Figuur 1. Vergrote isometrisch aanzicht van cultuur schotel setup en de luchtpijp steekproef positionering. NB: het dekglaasje en silicone sheet dient vooraf te worden gemonteerd op de invoering van de luchtpijp monster in de cultuur schotel.
Figuur 2. Voorbeeld van een muis luchtpijp dissectie met dit protocol, uitgaande van een intact trachea (A) tot de uiteindelijke afgebeelde resultaat (E) (zie werkwijze stappen 3,2-3,8 voor een uitleg van labels). Schaalbalken in AD vertegenwoordigen 500 micrometer. Schaal bar in E staat voor 25 micrometer.
Figuur 3. Verwachte resultaten verkregen met een wild-type muis luchtpijp monster zoals opgesteld door de hier beschreven protocol. (A) Single frame van een high-speed DIC film (zie aanvullende film 1 voor representatieve DIC film). (B) Movement tracks van vier fluorescerende kralen over de surface van een tracheale epitheel steekproef (zie aanvullende film 2 voor representatieve fluorescerende film). (C) Cilia slagfrequentie gekwantificeerd van high-speed DIC cilia beweeglijkheid films (n = 41 willekeurig punt metingen vanaf 6 muis luchtpijpen). (D) Flow snelheid en (E) Flow gerichtheid gekwantificeerd kunnen volgen fluorescerende kraal beweging over het oppervlak van tracheale epitheel monsters (n = 31 fluorescerende kraal traces van 6 muis luchtpijpen). Data wordt verplaatst als gemiddelde ± SEM. Schaalbalken 10 urn.
Aanvullende Film 1. DIC film toont cilia verslaan vorm en trilharen gegenereerde stroom waargenomen met behulp van een wild-type muis luchtpijp monster. De film werd verzameld op 200 fps, terwijl de weergave is 30 fps. Klik hier om film te bekijken .
Aanvullende Movie 2. Movie van cilia gevergoede stromen over een wild-type muis luchtpijp monster met behulp van 0,20 micrometer fluorescerende microbolletjes en epifluorescerende microscopie. Filmcollectie en afspelen is 15 fps. Klik hier om film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meting van cilia slagfrequentie (CBF) is relatief eenvoudig met behulp van hoge microscoop doelstellingen vermogen en snelle image acquisitie hardware 13,15, en legt uit waarom CBF metingen vormen de basis van de meeste onderzoeken naar mucociliaire klaring tijdens gezondheid en ziekte. Hoewel CBF ook essentieel voor het begrijpen van mucociliaire klaring, meting van CBF alleen voorbij de onderliggende belang van beide ciliaire gegenereerde stroom en cilia slaan golfvorm, die beide zijn moeilijker te meten, worden vaak genegeerd en niet correleren met CBF. Een voorbeeld van hoe de toegenomen CBF niet overeenkomen met verhoogde ciliaire gegenereerde stroom wordt gezien bij sommige patiënten met DNAH11 mutaties. DNAH11 een axonemal dynein zware keten eiwit, mutaties die zijn gerapporteerd aan hyperkinetische (sneller) ciliaire maatslag en abnormale cilia slaan golfvorm die wordt voorspeld problemen mucociliaire klaring 16 veroorzaken. De significant gebruik van ons protocol is dat het zorgt voor eenvoudige visualisatie van de cilia loodrecht op de trilharen ritme richting, waardoor een profiel te bekijken van cilia die optimaal is voor een hoge resolutie afbeelding van cilia verslaan shape and cilia gegenereerd fluïdumstroom over het oppervlak van het kloppend trilharen, waardoor directe vergelijking van de CBF met cilia verslaan golfvorm en / of trilharen gegenereerde stroom binnen een enkel monster.
Een ander voordeel van deze techniek is dat de trilharen in vers geoogste luchtpijp behouden hun vermogen om te verslaan in een gecoördineerde wijze over het gehele oppervlak van de respiratoire epitheel, en kan daardoor gemakkelijk correlatie tussen CBF en trilharen opgewekte stroom. Dergelijke gecoördineerde ciliaire beweging wordt niet waargenomen in reciliating muis tracheale epitheelcellen culturen, die vaak ciliaat slecht en laten cilia verslaan in willekeurige richtingen 9,10. De gecoördineerde ciliaire ritme waargenomen met behulp van de tracheale epitheel techniek die hier beschreven, kan worden voorzien in middelen interrogate de mechanismen tot regeling van ciliaire slag coördinatie en haar mogelijke rol in mucociliaire klaring.
De meest uitdagende gedeelte van dit protocol voor onderzoek zal trachea preparaat, inclusief het wissen van vet en bindweefsel van de luchtpijp oppervlak (figuur 2a), en in lengterichting snijden door het midden van de trachealis spier (figuur 2b, regel 2). We vinden het gebruik van goede micro dissectie schaar essentieel voor zowel weefsel clearing en daaropvolgende trachealisotomy. Daarnaast vinden we het gemakkelijker om het onderste gedeelte van de trachea anterieure om de carina waar de luchtpijp splitst in de linker en rechter primaire bronchi de trachealis spier hier breedst. Echter, met voldoende ervaring, elke lengte van de luchtpijp, of zelfs de primaire bronchiën succes kan worden gebruikt om hoge-kwaliteit films van cilia beweeglijkheid en trilharen genereren flow te genereren.
Mogelijke technischeproblemen in verband met dit protocol zijn de luchtpijp monster beweegt tijdens de beeldvorming en / of het monster niet kunnen in beeld worden gebracht. Beide problemen kunnen ontstaan als teveel L-15 werd toegevoegd aan het monster en / of de beeldvorming kamer dekglas was niet goed aangedrukt, dit wordt het monster te zweven binnen het dekglas kamer waardoor monster beweging of het monster drijvende boven de focus vliegtuig maken scherpstellen onmogelijk. Om dit te vermijden is het belangrijk om te proberen en het minimaliseren van de hoeveelheid vloeistof die aan elk monster trachea monteren.
Een mogelijke beperking van deze techniek is dat de meting van cilia opgewekte fluïdumstroom niet volledig overeen in vivo mucociliary transport. Onze bevinding van cilia gegenereerde stroom van ~ 10 um / sec is aanzienlijk minder dan de 100 um / sec mucociliary vervoerskosten gebruik in vivo muis luchtpijp 17. Dit verschil is waarschijnlijk te wijten aan de cilia ondergedompeld in media opposed gewoon verplaatsen van een dunne laag van slijm in de lucht-vloeistof-grensvlak. Toch heeft deze methode groot nut voor de relatieve vergelijking van ciliaire motiliteit tussen de verschillende monsters.
Opgemerkt moet worden dat terwijl de experimentele techniek en hier beschreven werd uitgevoerd bij kamertemperatuur temperatuur zelf een belangrijke rol in het reguleren cilia-activiteit speelt. CBF in menselijke neus en tracheale monsters gezien lineair gecorreleerd met de temperatuur tussen 5-20 ° C, met een kleine toename van CBF gezien tussen 20-45 ° C 18. We zien een soortgelijke relatie tussen de temperatuur en de CBF in muis luchtwegen monsters (ongepubliceerde waarnemingen). Dus, terwijl we verslag cilia activiteit bij kamertemperatuur snelle beoordeling van eventuele gebreken van cilia motiliteit in nieuwe mutante muizen, hebben we ook incubeer aantal monsters bij 37 ° C voor de bepaling van cilia-activiteit onder fysiologische omstandigheden. Om dit een standaard microscoop incubatie ch bereikenamber kan worden gebruikt om monsters te handhaven bij 37 ° C.
Eenvoudige aanpassingen aan dit protocol zal het een krachtig instrument voor de beoordeling van de regulering van de luchtwegen cilia-activiteit door een breed scala van factoren, zoals de rol van farmacologische middelen, temperatuur, genetische factoren, milieu-risico's, en / of mechanische factoren zoals slijm belasting te maken Op luchtwegen trilharen functie en opwekking / onderhoud van de luchtwegen cilia verslaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het project werd ondersteund door NIH-subsidie U01HL098180 van de National Heart, Lung, and Blood Institute. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Heart, Lung, and Blood Institute of de National Institutes of Health
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I.
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
