Ex vivo metode for High Resolution Imaging av Cilia Motility i Gnagere Airway epithelia

Summary

En enkel og pålitelig teknikk for å visualisere og kvantifisere luftveier flimmerhårene motilitet og flimmerhårene generert strøm ved hjelp av musen luftrøret er beskrevet. Denne teknikk kan endres for å bestemme hvordan en rekke faktorer påvirker cilia motilitet, inkludert farmakologiske midler, genetiske faktorer, miljømessige eksponeringer, og / eller mekaniske faktorer som slim belastning.

Abstract

En ex vivo teknikk for bildebehandling mus luftveier epitel for kvantitativ analyse av bevegelige flimmerhårene funksjon viktig for innsikt i mucociliary mucocilliære er etablert. Nyhøstet mus luftrøret kuttes i lengderetningen gjennom trachealis muskel og montert i et grunt vegger kammer på en glass-bunn parabolen. Luftrøret prøven er plassert langs den lange aksen å dra nytte av den trachealis muskler til å krølle lengderetningen. Dette tillater avbildning av ciliary bevegelse i profil langs hele tracheal lengde. Videoer på 200 bilder / sek er innhentet ved hjelp av differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi og en høyhastighets digitalt kamera til å tillate kvantitativ analyse av flimmerhårene slo frekvensen og ciliary bølgeform. Med tillegg av fluoriserende perler under avbildning, cilia generert fluidstrøm også kan bestemmes. Protokollen tid spenner over ca 30 min, med 5 min for kammeret forberedelse, 5-10 min for prøvenmontering, og 10-15 min for videomicroscopy.

Introduction

Analyse av bevegelige flimmerhårene funksjon i luftveiene epitel er eksperimentelt viktig for å belyse de genetiske og miljømessige faktorer som kan påvirke mucociliary klarering og oksygenopptak ^en. Den enkle protokoll utviklet for bildebehandling musen luftveier epitel gir en effektiv metode for å avhøre luftveier flimmerhårene motilitet i mutant og knockout musemodeller og krever bare grunnleggende ferdigheter i musen tracheal vev disseksjon og eks vivo avbildning av luftveiene flimmerhårene motilitet med høy oppløsning videomicroscopy. Denne protokollen ble etablert og videreutviklet under en storstilt mus mutagenese skjermen for å tillate rask evaluering av bevegelige flimmerhårene funksjon (flimmerhårene slo frekvensen, flimmerhårene slo form, flimmerhårene generert flow) på mutanter med medfødt hjertesykdom assosiert med heterotaxy ^2-5.

Dagens teknikker brukes til å studere luftveier flimmerhårene motilitet kan grupperes i enten akutt ex vivo type eller longer term in vitro eksperimentelle tilnærminger. Akutte eksperimenter inkluderer ex vivo visualisering av menneskelige nese / luftveier børste biopsier ^6,7 og analyse av enkle tverrgående luftveier § § ^8. De i vitro tilnærminger utnytte ulike cellekultur teknikker for å generere ark med differensierte ciliated epithelia eksempel i luft flytende grensesnitt kulturene eller luftveier suspensjon kulturer ^9-11. Men disse luftveier epitel reciliation teknikker krever meget betydelig investering i tid og opplæring før noen brukbare ciliated epitelceller er produsert for eksperimentering (4-6 uker ^9,10). Mens akutt ex vivo analyse av luftveiene epiteliale pensel biopsier blir ofte brukt for kliniske studier, er denne metoden ikke brukbare i mus studier på grunn av forsterket mekanisk vevskade ^12.

Teknikken er beskrevet i denne protokoll for analyse av mouse tracheal luftveier epitel er ikke bare enkelt å utføre, men det krever ingen spesielle disseksjon ferdigheter eller noen spesialisert utstyr foruten de standard for avbildning av videomicroscopy. Det er mange fordeler med denne enkle protokollen. Først, som mus luftrøret vev innhøsting er rask og enkel å utføre, gir det mulighet for rask vurdering av luftveiene cilia funksjon i et stort antall mus. Dette kan omfatte akutt analyse av de kortsiktige effektene av forskjellige in vitro-behandlinger. Sekund, som er en ex vivo teknikk, forblir ciliated luftveier epitel knyttet til den underliggende støtte vev og dermed beholde forbundet celle signalveier. Derfor i forhold til in vitro reciliated luftvei epitel er preparatet en bedre representasjon av det naturlige in vivo vev miljø. Tredje, gjør denne protokollen oppkjøp av en rekke ulike kvantitative parametre som kan gi objektiv vurdering av bevegelige flimmerhårene fsalvelse. Til slutt, i motsetning til andre aktuelle metoder for luftveiene cilia visualisering, tillater denne protokoll for visualisering av cilia i rett vinkel til den cilia takten retning, slik at profilen visning av cilia som er optimal for høy oppløsning av cilia beat og metachronal bølge generering .

Denne protokollen kan endres på en rekke måter å løse et bredt spekter av eksperimentelle behov som rollen som farmakologiske midler, genetiske faktorer, miljømessige eksponeringer, og / eller mekaniske faktorer som slim belastning på luftveiene flimmerhårene funksjon og produksjon / vedlikehold av luftveier flimmerhårene beat og metachronal bølgeutbredelse.

Protocol

En. Reagenser Setup

1.1 Dissection og Imaging Medium

Leibovitz L-15 medium (L15) er supplert med FBS (10%) og Penicillin-Streptomycin (100 enheter / ml penicillin G-natrium og 100 ug / ml streptomycin sulfat) brukes under begge innhøstingen og avbildning av trachea prøver.

2. Shallow Walled Culture Chamber Assembly

Kammeret som brukes til å holde luftrøret vevet er vist i figur 1. Gulvet av kammeret ligger glasset bunnet 35 mm kultur parabolen. Toppen og siden av kammeret er generert ved å plassere en liten del av 0,3 mm tykk silikon sheeting over glass antenne. Kanten av arket er skåret til å passe den rundbunnet fatet og sentrum er videre trimmes for å danne et grunt sentralt kammer (se trinn 2.1 til 2.3). På toppen av denne sammenstilling, blir en 18 mm rund glass dekkglass plassert for å generere et lukket kammer egnet for avbildning.

1. Fullstendig dekke et 18 mm runde glassdekselstrimmel med kvadratet av 0,3 mm tykk silikon plater.
2. Med standard skarpe disseksjon saks klippe av overflødig silikon plater fra rundt kanten av dekselet slip (som resulterer i en sirkulær lag av silikon plater).
3. Med en skarp skalpell skar ut og fjerne et sentralt torg silikon plater (ca. 10 mm firkant) fra midten av dekket dekkglass (og dermed danner toppen og sidene av bildebehandling kammeret).

3. Trachea Harvest-og klargjøring

1. Avlive mus i samsvar med lokale institusjonelle dyr omsorg og bruk komité og / eller statlige retningslinjer og fjerne luftrøret inn i en standard plast 35 mm kultur tallerken med nok L15 media til dukke vev (forfatterne har brukt mus like før fødselen ved svangerskap dag 16.5, gjennom å nyfødte, neonatal, og voksne dyr ^2).
2. Fjern ikke-trachea assosierte vev festet til utsiden avluftrøret hjelp stump disseksjon.
3. Fjern strupehodet med en tverrgående kutt like under cricoid brusk bruker mikro disseksjon saks (figur 2A, linje 1).
4. Ta til venstre og høyre primære bronkial grener med en tverrgående kutt like over carina bruker mikro disseksjon saks (figur 2A, linje 2).
5. Hold forsiktig luftrøret med fin pinsett og skyll lumen 2-3 ganger med ~ 1 ml av bading L15 medium med en P1000 Pipetman og P1000 tips for å fjerne slim og blod.
6. Skjær ut en 3-4 ring segment av luftrøret ved hjelp av en tverrgående kutt med mikro disseksjon saks (figur 2B, linje 1).
7. Skjære seg på langs gjennom midten av muskelen trachealis av denne korte luftrøret segmentet ved hjelp av mikro disseksjon sakser (figur 2B, linje 2).
8. Skjær langs gjennom midten av luftrør brusk ringer ved hjelp av mikro disseksjon saks (figur 2C figur 2D).

4. Cilia Imaging

1. Transfer luftrør vev segmenter, lumen side ned, på midten av en 35 mm glassbunn kultur tallerken med 100-200 mL av L-15 medium.
2. For å kvantifisere flyt cilia generert en ganske liten mengde av fluorescerende 0,20 mikrometer mikrosfærer til L-15 medium bading trachea vevsprøve (~ 1 x 10 ¹¹ partikler / ml eller 20 ul / ml i 2,5% vandig Fluoresbrite mikrosfære suspensjon).
3. Plasser avbildning kammeret fremstilt tidligere (Se prosedyre 1-3 ovenfor) på toppen av trachea prøven silikon Arksiden bakken, og luftrøret prøven plassert i midten av den grunne vegger kammer dannet av vinduet skåret inn i silikon-folie (Figur 1 ).
4. Trykk forsiktig ned på dekkglass å sikre på plass og fjerne eventuelle overflødige L-15 media fra kantene usinga P1000 tips og P1000 Pipetman.
5. Monter 35 mm glassbunn kultur tallerken og luftrør prøven på en invertert mikroskop med 100X objektive og DIC optikk.
6. Ved hjelp av en high-speed kamera og film oppkjøpet programvare samle filmer av flimmerhårene motilitet på 200 + bilder per sekund langs ciliated tracheal epitel av krøllet opp kanten av trachealis muskelen (figur 2D skissert boksen, E: eksempel stillbilde fra innspilte filmen) (Supplerende Movie 1).
7. Ved hjelp FITC epifluorescent bildebehandling og en lav lys CCD-kamera (Se utstyrsliste over), samle filmer av fluorescerende microsphere bevegelse over overflaten av ciliated tracheal epitel å tillate senere kvantifisering av flimmerhårene generert flow (Supplementary Movie 2).

5. Kvantifisering av Cilia Motility

1. Laste DIC fotografert filmer i ImageJ programvarepakken og følge teknikken beskrevet av jegain Drummond ¹³ bruker linjen til å tegne en raster linje krysser juling flimmerhårene. A "reslice" av denne linjen genererer en kymograph typen bilde der flimmerhårene bevegelse over linjen genererer et bølgemønster. Antall piksler mellom hver bølgetopp er dem målt (ett bildepunkt = én film ramme) fra hvor antall slag per minutt (dvs. Hz) kan da beregnes.
2. For å måle flimmerhårene generert flyt belastning fluorescerende perle filmer i ImageJ programvarepakke, og bruke MTrackJ plugin ¹⁴ til manuelt spore fluoriserende perler på overflaten av luftrøret epitel og la programvaren generere perle hastighet og retningen for hver perle spores.

Forsiktighet bør utvises ved bruk av fluoriserende perler å kvantifisere strømmen som avstanden fra det bankende flimmerhårene kan sterkt påvirke målte flyt størrelsesorden. Perlen bevegelse i Supplemental Movie 2 er et godt eksempel på dette. I dette eksempelet beadbevegelsen er hurtig på overflaten av det bankende cilia og vesentlig avtar for perlene ytterligere bort i bading media. For å kontrollere for dette, bør perle tracings kun hentes på en fast avstand over ciliated epithelia i alle prøver å gi riktige sammenligninger skal gjøres. Til slutt, for å oppnå representative data for strømning, bør perlene spores så lenge som mulig, og det foretrekkes å anvende bead spor som dekker 10 + ciliated celler for å beregne fluidstrømning.

Representative Results

Kontroll luftveier flimmerhårene skal være godt synlig og sett til å slå på en koordinert måte (Supplemental Movie 1, filmavspilling er redusert til 15% sanntid), med merkbar flyt i retning av flimmerhårene beat (Supplemental Movie 2, filmavspilling er 100% sanntid). Kvantifisering av flimmerhårene filmer bør gi resultater som ligner på det man ser i figur 3. Samling av høyhastighets DIC filmer muliggjør kvantifisering av cilia takt-frekvens (figur 3C) og gir gode bilder for kvalitativ vurdering av cilia takten form, mens den sporing av fluorescerende kuler muliggjør måling av cilia generert strømningshastighet (figur 3D) og retningen (Figur 3E).

Vi bruker direktivitet for å gi en indeks for lineære strøm. Directionality beregnes ved å dele total forskyvning reiste med et fluorescerende perle (dvs. den kortesteAvstanden mellom start-og sluttpunkt for sporing) av avstanden en fluorescerende perle beveger seg over hele traséen. Dermed vil en fluorescerende vulsten beveger seg i en rett linje har en direktivitet av en mens et fluorescerende vulsten buktende i stor utstrekning fra en rett bane vil ha en direktivitet mye mindre enn 1.

Vi har fotografert prøver for opptil en time uten noen merkbar endring i flimmerhårene slo funksjon.

Figur 1. Forstørret isometrisk visning av kultur tallerken oppsett og luftrøret sample posisjonering. NB: dekkglass og silikon arket skal settes sammen før du setter i luftrøret prøven i kulturen fatet.

Figur 2. Eksempel på en mus trachea Disseksjon hjelp av denne protokollen, som starter fra et intakt luftrøret (B) til det endelige resultat avbildes (E) (se fremgangsmåte trinn 3.2 til 3.8 for forklaring av etiketter). Scale barer i AD representerer 500 mikrometer. Skalalinje i E representerer 25 mikrometer.

Figur 3. Forventede resultater oppnådd ved bruk av en villtype mus luftrøret prøven som er utarbeidet av protokollen beskrevet her. (A) Single frame fra et høyhastighets DIC film (Se supplerende filmen en for representative DIC film). (B) bevegelse spor av fire fluoriserende perler over hele surface av en tracheal epitel sample (Se supplerende film 2 for representative fluorescerende film). (C) Cilia slo frekvensen kvantifiseres fra high-speed DIC cilia motilitet filmer (n = 41 tilfeldige punktmålinger fra seks mus tracheas). (D) Flow hastighet og (E) Flow retningen kvantifisert fra sporing fluorescerende perle bevegelse over overflaten av luftrør epitel prøver (n = 31 fluorescerende perle tracings fra seks mus tracheas). Data blir fortrengt som gjennomsnitt ± SEM. Scale barer 10 mikrometer.

Supplemental Movie en. DIC film som viser flimmerhårene slo form og flimmerhårene generert flyt observert ved hjelp av en villtype mus luftrøret prøven. Filmen ble samlet på 200 fps, mens avspillingen er 30 fps. Klikk her for å se film .

Supplemental Movie 2. Movie av flimmerhårene generated flyt over en villtype mus luftrøret prøve å bruke 0,20 mikrometer fluorescerende mikrosfærer og epifluorescent mikroskopi. Filmsamlingen og lek er tilbake 15 fps. Klikk her for å se film .

Discussion

Måling av flimmerhårene slo frekvensen (CBF) er relativt enkelt å bruke kraftige mikroskop mål og rask bildeoverføring maskinvare ^13,15, og forklarer hvorfor CBF Målingene danner grunnlaget for de fleste studier som undersøker mucociliary klaring under helse og sykdom. Men mens CBF målingen er avgjørende for forståelsen av mukociliær renselse, måling av CBF alene ignorerer den underliggende betydning både ciliare generert strømning og cilia takten bølgeform, som begge er mer vanskelig å måle, er ofte oversett, og samsvarer ikke med CBF. Et eksempel på hvordan økt CBF ikke samsvarer med økt ciliary generert flyt er sett hos noen pasienter med DNAH11 mutasjoner. DNAH11 er en axonemal dynein tung kjetting protein, mutasjoner som har blitt rapportert å forårsake både hyperkinetisk (raskere) ciliary beat og unormal flimmerhårene slo bølgeform som er spådd å forårsake problemer med mucociliary clearance ^16. Den significant fordel med vår protokoll er at det gir mulighet for enkel visualisering av cilia i rett vinkel til den cilia takten retning, slik at en profil visning av cilier som er optimal for høy oppløsning av cilia takten form og cilia generert fluidstrømning over overflaten det bankende flimmerhårene, og dermed gir direkte sammenligning av CBF med flimmerhårene slo kurve og / eller flimmerhårene generert flyt innenfor en enkelt prøve.

En annen fordel med denne teknikken er at cilia i nyhøstet luftrøret beholder sin evne til å slå på en koordinert måte over hele overflaten av respiratorisk epitel, og dermed tillater enkel korrelasjon mellom CBF og cilia genererte strøm. En slik koordinert ciliary bevegelse er ikke observert i reciliating mus luftrør epiteliale kulturer, som ofte ciliate dårlig og vise flimmerhårene slo i tilfeldige retninger ^9,10. Den koordinerte ciliary slo observert ved hjelp av tracheal epitel teknikken beskrevet her kan gi midler til interrogate de mekanismene som regulerer ciliary slo koordinering og dens potensielle rolle i mucociliary klaring.

Den mest utfordrende del av denne protokoll for undersøkelser blir trachea fremstilling, inklusive rydding av fett og bindevev fra luftrøret overflate (figur 2a) og i lengderetningen å skjære gjennom midten av trachealis muskler (figur 2b, linje 2). Vi finner ved hjelp av god mikro disseksjon saks essensielle for både vev clearing og påfølgende trachealisotomy. Videre finner vi det lettere å bruke den nedre del av luftrøret bare anteriort for Carina hvor luftrøret bifurkasjon til venstre og høyre primære bronkier som trachealis muskel her er bredest. Men med tilstrekkelig erfaring, kan hvilken som helst lengde av luftrøret, eller faktisk den primære bronkier brukes med hell til å generere høy kvalitet filmer av flimmerhårene motilitet og flimmerhårene generere flow.

Mulig tekniskproblemer forbundet med denne protokollen omfatter luftrøret prøven beveger seg under bildebehandling og / eller prøven ikke er i stand til å bli brakt i fokus. Begge disse problemer kan oppstå hvis for mye L-15 ble tilsatt til prøven og / eller avbildning kammeret dekkglass ikke ble presset ned og låst; dette fører prøven til å flyte i løpet av dekkglass, hvilket resulterer i prøven beveges eller flytende prøven over fokus planet gjør fokusering. For å unngå dette er det viktig å forsøke å redusere mengden av væske som brukes til å montere hver luftrøret prøven.

En mulig begrensning av denne teknikken er at måling av flimmerhårene generert væskestrømmen kan ikke helt matche in vivo mucociliary transport. Vårt funn av flimmerhårene generert flyt av ~ 10 mikrometer / sek er betydelig mindre enn de 100 mikrometer / sek mucociliary transport rapporterte bruk in vivo mus luftrøret ^17. Denne forskjellen skyldes sannsynligvis flimmerhårene blir nedsenket i media som Opposed å bare flytte et tynt lag av slim over luft-væske-grensesnittet. Likevel har denne metoden ypperlig verktøy for relativ sammenligning av ciliary motilitet mellom ulike prøver.

Det skal bemerkes at mens den eksperimentelle teknikk og data presentert her ble utført ved romtemperatur, spiller temperaturen i seg selv en betydelig rolle i å regulere cilia aktivitet. CBF i menneskets nese og luftrør prøvene er sett til å være lineært korrelert med temperatur mellom 5-20 ° C, med en liten økning i CBF sett mellom 20-45 ° C ^18. Vi ser en tilsvarende sammenheng mellom temperatur og CBF i mus luftveier prøver (upubliserte observasjoner). Således, mens vi posten cilia aktivitet ved romtemperatur i rask vurdering av mulige defekter i cilia motilitet hos nye mutant-mus, har vi også enkelte prøver inkuberes ved 37 ° C for bestemmelse av cilia aktivitet under fysiologiske betingelser. For å oppnå dette et standard mikroskop inkubering chrav kan brukes til å opprettholde prøvene ved 37 ° C.

Enkle endringer i denne protokollen vil gjøre det til et kraftig verktøy for å vurdere reguleringen av luftveiene flimmerhårene aktivitet av en lang rekke faktorer som for eksempel rollen som farmakologiske midler, temperatur, genetiske faktorer, miljømessige eksponeringer, og / eller mekaniske faktorer som slim belastning på luftveiene flimmerhårene funksjon og produksjon / vedlikehold av luftveiene flimmerhårene slå.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 Medium	Invitrogen	21083-027	No phenol red
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30088.03
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2x fine forceps	Roboz	RS-4976
Dissection scissors	Roboz	RS-5676
Micro dissection scissors	Roboz	RS-5620
Scalpel	Roboz	RS-9801-15
P1000 pipetman	Gilson, Inc	F123602
P1000 tips	Molecular BioProducts	2079E
18 mm round glass cover slips	Fisher Scientific	430588
Plastic 35 mm culture dishes	Corning	430588
Glass bottom 35 mm culture dishes	Warner Instruments	W3 64-0758
Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	Polysciences	09834-10
Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters	Lecia	DMIRE2	Brand is not critical.
100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters	Lecia		Brand is not critical.
Microscope stage Incubator	Lecia	11521749	Not required if imaging cilia at room temperature
High-speed camera bright field	Vision Research	Phantom v4.2	Brand is not critical. Must be faster than 125 fps
High-speed fluorescent camera	Hamamatsu	C9100-12	Brand is not critical. Must be faster than 10 fps
Movie analysis software	National Institutes of Health	ImageJ with MtrackJ plugin