Summary
Uma técnica simples e confiável para a visualização e quantificação das vias aéreas motilidade cílios e cílios fluxo gerado usando o mouse traquéia é descrito. Esta técnica pode ser modificado para determinar como uma ampla variedade de factores que influenciam a motilidade dos cílios, incluindo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco.
Abstract
Uma técnica ex vivo para a imagem do mouse epitélio das vias aéreas para a análise quantitativa da função dos cílios móveis importante para a introspecção em função de transporte mucociliar foi estabelecida. Recém-colhida rato traquéia é cortado longitudinalmente através do músculo traqueal e montado em uma câmara com paredes rasas em um prato de vidro de fundo. A amostra de traqueia é posicionado ao longo do seu eixo longitudinal para tirar vantagem do músculo traqueal de enrolar longitudinalmente. Isto permite que imagens de movimento ciliar na vista de perfil ao longo de todo o comprimento traqueal. Vídeos em 200 frames / seg são obtidos usando microscopia de contraste de interferência diferencial e uma câmera digital de alta velocidade para permitir a análise quantitativa da frequência do batimento ciliar e de forma de onda ciliar. Com a adição de partículas fluorescentes durante a imagem, o fluxo de fluido gerado pestanas também podem ser determinados. O tempo de protocolo abrange cerca de 30 min, com 5 min para a preparação de câmara, 5-10 min para a amostramontagem e 10-15 minutos para videomicroscopia.
Introduction
Análise da função cílios móveis no epitélio das vias aéreas é experimentalmente importante para a elucidação dos fatores genéticos e ambientais que podem afetar o transporte mucociliar e saúde pulmonar 1. O protocolo simples desenvolvido para a imagem com o mouse epitélio das vias aéreas fornece um método eficiente para interrogar a motilidade dos cílios das vias aéreas em modelos mutantes e nocaute do mouse e exigem apenas conhecimentos básicos de rato dissecação do tecido traqueal e de imagem ex vivo da motilidade dos cílios das vias aéreas, com alta videomicroscopia resolução. Este protocolo foi criado e aperfeiçoado durante uma tela de mutagênese em larga escala do mouse para permitir uma avaliação rápida da função cílios móveis (freqüência de batimento dos cílios, cílios batida forma, o fluxo gerado cílios) em mutantes com doença cardíaca congênita associada heterotaxy 2-5.
As técnicas atuais utilizadas para estudar a motilidade dos cílios das vias aéreas podem ser agrupados em um ou outro do tipo ex vivo aguda ou lontermo ger em abordagens experimentais in vitro. Experimentos agudos incluem a visualização ex vivo de nasais / vias aéreas biópsias escova humanos 6,7 e análise de seções transversais das vias respiratórias simples 8. As aproximações in vitro utilizam várias técnicas de cultura de células para gerar folhas de epitélios ciliados diferenciado tal como em culturas de interface líquido das vias aéreas ou culturas em suspensão de 9-11. No entanto, estas técnicas reciliation epitélios das vias aéreas requerem um investimento muito significativa no tempo de formação e antes de quaisquer células epiteliais ciliadas utilizáveis são produzidos por experimentação (4-6 semanas 9,10). Enquanto a análise ex vivo aguda das vias aéreas de biópsias da escova epiteliais são comumente utilizados em estudos clínicos humanos, este método não pode ser utilizado em estudos de rato, devido à lesão do tecido exacerbada mecânico 12.
A técnica descrita neste protocolo para análise do moustraqueal epitélio das vias aéreas e não é apenas simples de executar, mas não requer habilidades especiais de dissecação, nem qualquer equipamento especializado, além daqueles padrão para imagens por videomicroscopia. Há muitas vantagens para este protocolo simples. Em primeiro lugar, como o rato traqueia colheita tecidual é rápido e fácil de realizar, que permite a avaliação rápida da função dos cílios das vias respiratórias em um grande número de ratinhos. Isto pode incluir a análise aguda dos efeitos a curto prazo de diferentes tratamentos na in vitro. Por outro lado, sendo uma técnica ex vivo, o epitélio das vias respiratórias ciliado permanece ligada a ela subjacente e tecidos de suporte, assim, conservar as vias de sinalização celulares associadas. Portanto, em comparação com reciliated no epitélio das vias respiratórias in vitro, esta preparação é a melhor representação do ambiente natural no tecido in vivo. Em terceiro lugar, este protocolo permite a aquisição de um número de diferentes parâmetros quantitativos que podem fornecer a avaliação objetiva de móveis cílios função. Finalmente, em contraste com outros métodos actuais para a visualização dos cílios das vias aéreas, este protocolo permite a visualização dos cílios, perpendicularmente à direcção batimento ciliar, o que permite ver o perfil dos cílios, que é óptimo para imagens de alta resolução dos batimentos dos cílios e geração de onda de metachronal .
Este protocolo pode ser modificado num certo número de maneiras de lidar com uma vasta gama de necessidades experimentais, tais como o papel de agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco das vias respiratórias em função dos cílios e geração / manutenção batimento dos cílios das vias aéreas e propagação de ondas metachronal.
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Protocol
1. Setup reagentes
1.1 Dissection e imagem Médio
L-15, meio de Leibovitz (L15) é suplementado com FBS (10%) e Penicilina-Estreptomicina (100 unidades / ml de penicilina G sódica e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina) é utilizado tanto durante a colheita de amostras de imagens e traqueia.
2. Shallow Walled Assembléia Câmara Cultura
A câmara utilizada para manter o tecido da traqueia é mostrado na Figura 1. O piso da câmara é o vidro ao fundo do poço 35 milímetros prato de cultura. A parte superior e no lado da câmara é gerado pela colocação de um pequeno pedaço de folhas de silicone de 0,3 mm de espessura sobre o prato de vidro. O bordo da folha é cortada para se ajustar o prato de fundo redondo e o centro é ainda cortada para formar uma câmara central raso (ver passos 2.1-2.3). No topo desta montagem, a mm rodada tampa de vidro deslizante 18 é colocado para gerar um recinto adequado para a imagem.
- Cobrir completamente a mm rodada tampa de vidro deslizante 18 com um quadrado de 0,3 milímetros de espessura folhas de silicone.
- Com uma tesoura de dissecção afiadas padrão aparar o excesso de folhas de silicone em torno da borda da lamínula (resultando em uma camada circular de folhas de silicone).
- Com um bisturi afiada cortar e remover uma praça central de folhas de silicone (aproximadamente 10 milímetros quadrados) a partir do meio da lamela coberto (formando assim o topo e as laterais da câmara de imagem).
3. Traquéia Colheita e Preparação
- Eutanásia camundongos de acordo com cuidados com os animais institucional local e usar comitê e / ou diretrizes governamentais e remover traquéia em um plástico 35 milímetros prato de cultura padrão, com bastante L15 mídia para tecido submergir (autores usaram camundongos pouco antes do nascimento em uma gestação de 16,5 dias, através de -nascidos, neonatal e adulto animais 2).
- Remover o tecido associado não traqueia fixada no exterior detraquéia usando dissecção romba.
- Remover a laringe, com um corte transversal imediatamente abaixo da cartilagem cricóide com micro tesouras de dissecação (Figura 2A, linha 1).
- Retire os ramos dos brônquios principais direito e esquerdo com um corte transversal logo acima da carina usando micro tesoura de dissecção (Figura 2A, linha 2).
- Segure cuidadosamente a traquéia com uma pinça fina e lave o lúmen 2-3 vezes com ~ 1 ml da L15 médio banho com um Pipetman P1000 e P1000 dica para limpar o muco e sangue.
- Corte um segmento do anel 3-4 da traquéia através de um corte transversal com micro tesoura de dissecção (Figura 2B, linha 1).
- Corta-se longitudinalmente através do meio do músculo traqueal deste segmento curto traqueia com micro tesouras de dissecação (Figura 2B, linha 2).
- Corta-se longitudinalmente através do centro dos anéis da cartilagem da traqueia com micro tesouras de dissecação (Figura 2C Figura 2D).
4. Cilia imagem
- Transferência de segmentos de tecido da traqueia, do lado do lúmen para baixo, para o meio de um prato de vidro de fundo mm 35 cultura com 100-200 mL de meio L-15.
- Para quantificar o fluxo gerado cílios adicionar uma pequena quantidade de microesferas fluorescentes de 0,20 mM para o meio G-15 banhando a amostra de tecido da traqueia (~ 1 x 10 11 partículas / ml ou 20 ul / ml de suspensão de microesferas Fluoresbrite aquosa a 2,5%).
- Coloque a câmara de imagiologia preparado anteriormente (Ver Processo 1-3 acima) no lado superior da amostra de folha de silicone na traqueia para baixo, com a amostra de traqueia localizado no meio da câmara de paredes raso formado pela janela cortada em folhas do silicone (Figura 1 ).
- Com cuidado, empurre para baixo sobre a lamela para assegurar no lugar e remover qualquer excesso de L-15 mídia da bordas usinga ponta P1000 e P1000 Pipetman.
- Monte o fundo de vidro prato de cultura 35 milímetros e amostra traquéia em um microscópio invertido com óptica 100X objetivas e DIC.
- Usando uma câmera de alta velocidade e software de aquisição de filme coletar filmes da motilidade dos cílios em 200 + quadros por segundo ao longo do epitélio traqueal ciliadas do enrolado borda do músculo traqueal (box, E Figura 2D Descritas: Exemplo de imagem estática de filme gravado) (Filme suplementar 1).
- Usando imagens de epifluorescência FITC e uma luz CCD da câmera baixa (Veja lista de equipamentos acima), recolher os filmes do movimento de microesferas fluorescentes em toda a superfície do epitélio traqueal ciliated para permitir a quantificação posterior do fluxo gerado cílios (Filme complementar 2.)
5. Quantificação de Motilidade Cilia
- Carregar filmes imaginadas DIC no pacote de software ImageJ e seguindo a técnica descrita por Iain Drummond 13 usar a ferramenta de linha para desenhar uma linha raster cruzando os cílios batendo. A "corte virtual" desta linha gera um tipo de imagem quimógrafo onde o movimento ciliar em toda a linha gera um padrão de onda. O número de pixels entre cada pico de onda é-lhes medida (um pixel = uma moldura do filme) a partir do qual o número de batimentos por minuto (isto é, Hz), pode então ser calculado.
- Para medir cílios gerado fluxo de carga fluorescentes filmes talão no pacote de software ImageJ, e usar o plugin MTrackJ 14 a controlar manualmente partículas fluorescentes em toda a superfície da traquéia epitélios e deixar o software gerar velocidade talão e direcionalidade para cada grânulo rastreado.
Cuidados devem ser tomados quando se utiliza partículas fluorescentes para quantificar o fluxo como a distância entre os cílios batendo pode influenciar fortemente magnitude de vazão. O movimento conta no Suplementar Movie 2 é um bom exemplo disso. Neste exemplo grânulomovimento é rápido na superfície dos cílios batendo e cai significativamente off para contas mais longe nos meios de comunicação de banho. Para controlar isso, talão traçados só deve ser recolhida a uma distância fixa acima do epitélio ciliar em todas as amostras para permitir comparações corretas a serem feitas. Finalmente, para obter dados representativos do fluxo de fluido, os grânulos devem ser rastreados por tanto tempo quanto possível, é preferível utilizar grânulos faixas que cobrem as células 10 + ciliadas para o cálculo do fluxo de fluido.
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Representative Results
Controle cílios das vias aéreas devem ser claramente visíveis e visto a bater de forma coordenada (Filme Suplementar 1; reprodução do filme é retardado até 15% o tempo real), com fluxo perceptível na direção do batimento ciliar (Filme Suplementar 2; reprodução do filme é 100% em tempo real). Quantificação de filmes cílios devem produzir resultados semelhantes ao observado na Figura 3. Recolha de filmes DIC alta velocidade torna possível a quantificação da frequência de batimento ciliar (Figura 3C) e dá boas imagens para a avaliação qualitativa de batimento ciliar forma, enquanto que o controle de partículas fluorescentes permite a medição da velocidade do fluxo gerado cílios (Figura 3D) e direcionalidade (Figura 3E).
Usamos direccionalidade para dar um índice de fluxo linear. Direccionalidade é calculado dividindo-se o deslocamento total percorrida por um talão fluorescente (isto é, a menordistância entre os pontos de início e fim do traçado) pela distância de fluorescentes movimentos de contas ao longo de todo o traçado. Assim, um talão fluorescente movendo-se em linha reta teria uma direcionalidade de um, enquanto um cordão fluorescente sinuoso extensivamente a partir de um caminho reto terá um direcionamento muito menos do que 1.
Temos fotografada amostras por até uma hora sem qualquer alteração perceptível em função de batimento ciliar.
Figura 1. Vista isométrica ampliada da cultura configuração prato e posicionamento amostra traquéia. NB: a folha de lamela e silicone deve ser montado antes de colocar a amostra de traquéia para o prato de cultura.
Figura 2. Exemplo traqueia de um rato dissecção utilizando este protocolo, a partir de uma traqueia intacto (A) para o resultado final, com imagens (E) (ver o procedimento de passos de 3,2-3,8 para uma explicação de etiquetas). Barras de escala na AD representam 500 mm. Barra de escala em E representa 25 mM.
Figura 3. Resultados esperados obtidos utilizando um tipo de mouse amostra traquéia selvagem preparado pelo protocolo descrito aqui. (A) Um quadro de um filme DIC de alta velocidade (Ver filme suplementar 1 para o filme DIC representante). (B) rastreia o movimento de quatro contas fluorescentes através do surface de uma amostra de epitélio traqueal (Veja o filme suplementar 2 para filme fluorescente representante). (C) freqüência de batimento Cilia quantificados de alta velocidade, filmes motilidade cílios DIC (n = 41 medições pontuais aleatórias dos 6 traquéias do mouse). (D) A velocidade do fluxo e (E) direcionalidade do fluxo quantificado a partir de monitoramento movimento talão fluorescente em toda a superfície das amostras de epitélio traqueal (n = 31 fluorescentes traçados talão de 6 traquéias do mouse). Os dados são deslocados em média ± EPM. Barras de escala 10 uM.
Suplementar Filme 1. DIC filme mostrando forma batida cílios e cílios fluxo gerado observado usando um mouse amostra traquéia wildtype. O filme foi coletada a 200 fps, enquanto a reprodução é de 30 fps. Clique aqui para ver filme .
Suplementar Movie 2. Filme de cílios gefluxo nerated através de um rato amostra traquéia wildtype usando 0,20 mM microesferas fluorescentes e microscopia de epifluorescência. Coleção de filmes eo jogo de volta é de 15 fps. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
Medição da frequência do batimento ciliar (CBF) é relativamente fácil, utilizando objetivos microscópio de alta potência e de hardware de aquisição de imagem rápida 13,15, e explica por que as medições CBF formam a base da maioria dos estudos que investigam a depuração mucociliar durante a saúde ea doença. No entanto, enquanto a CBF medição é essencial para compreender a depuração mucociliar, medição da CBF sozinho ignora a importância fundamental de ambos ciliar fluxo gerado e batimento ciliar forma de onda, os quais são mais difíceis de medir, são muitas vezes ignorados, e pode não se correlacionar com o FSC. Um exemplo de como a maior FSC podem não corresponder com o aumento do fluxo gerado ciliar é visto em alguns pacientes com DNAH11 mutações. DNAH11 é uma proteína dineína cadeia pesada axonemal, mutações em que foram relatados para causar tanto hyperkinetic (mais rápido) do batimento ciliar e anormal cílios batida forma de onda que está previsto para causar problemas com o transporte mucociliar 16. O significant vantagem do nosso protocolo é que ele permite a fácil visualização dos cílios, perpendicularmente à direcção batimento ciliar, permitindo uma vista de perfil de cílios, que é óptimo para imagens de alta resolução, de forma batimento ciliar e cílios gerado o fluxo de fluido através da superfície os cílios batendo, permitindo assim uma comparação directa da CBF com cílios batida forma de onda e / ou pestanas fluxo gerado dentro de uma única amostra.
Uma outra vantagem desta técnica é que os cílios no colhido traqueia reter a sua capacidade para bater de um modo coordenado em toda a superfície do epitélio respiratório, permitindo assim fácil correlação entre CBF e fluxo gerado cílios. Tal movimento ciliar coordenada não é observado em rato reciliating traqueais culturas epiteliais, que muitas vezes ciliados mal e mostrar batimento ciliar em direções aleatórias 9,10. O batimento ciliar coordenada observadas utilizando a técnica epitélio traqueal descrito aqui pode proporcionar os meios para interrogate os mecanismos que regulam a coordenação do batimento ciliar e seu papel potencial no transporte mucociliar.
A parte mais difícil deste protocolo para pesquisas será preparação traqueia, incluindo a limpeza de gordura e tecido conjuntivo a partir da superfície da traqueia (figura 2a), e longitudinalmente cortando através do meio do músculo traqueal (Figura 2b, linha 2). Encontramos com bons micro tesoura de dissecção essenciais tanto para tecido de compensação e trachealisotomy subseqüente. Além disso, é mais fácil de usar a porção inferior da traqueia imediatamente anterior a carina da traqueia onde bifurca em brônquios primários esquerdo e direito como o músculo traqueal aqui é mais largo. No entanto, com experiência suficiente, todo o comprimento da traquéia, ou mesmo o primário brônquios pode ser usada com sucesso para gerar filmes de alta qualidade da motilidade cílios e cílios gerar fluxo.
Possível técnicoproblemas associados com este protocolo inclui a amostra se mova durante traqueia de imagem e / ou a amostra não ser capaz de ser trazida para o foco. Ambos os problemas podem surgir se muito G-15 foi adicionado com a amostra e / ou a câmara de imagiologia lamela não foi pressionado firmemente para baixo, o que faz com que a amostra flutuar no interior da câmara de lamela, resultando em movimento da amostra ou a amostra flutua acima do plano de focagem fazendo foco impossível. Para evitar isso, é importante para tentar minimizar a quantidade de líquido utilizada para montar cada amostra de traqueia.
Uma possível limitação desta técnica é que a medição dos cílios fluxo de fluido gerado pode não corresponder completamente no transporte mucociliar vivo. A nossa descoberta de cílios fluxo gerado de ~ 10 mM / seg é significativamente menos do que os 100 mm / seg de transporte mucociliar reportados usando ratinho in vivo da traqueia 17. Esta diferença é provavelmente devido aos cílios ser submerso em meios de comunicação como opposed simplesmente movendo-se de uma fina camada de muco ao nível da interface ar-líquido. No entanto, este método tem uma grande utilidade para a comparação relativa da motilidade ciliar entre as diferentes amostras.
Deve notar-se que, embora a técnica experimental e os dados aqui apresentados foi conduzida à temperatura ambiente, a própria temperatura desempenha um papel significativo na regulação da actividade dos cílios. CBF em nasal humano e amostras de traqueia é visto para ser correlacionada linearmente com a temperatura entre 5-20 ° C, com um pequeno aumento no CBF visto entre 20-45 ° C 18. Vemos uma relação semelhante entre a temperatura ea CBF em amostras do mouse vias aéreas (observações não publicadas). Assim, enquanto que a actividade ciliar ficha à temperatura ambiente para a avaliação rápida de possíveis defeitos na motilidade ciliar em novos ratinhos mutantes, também algumas incubar as amostras a 37 ° C para a determinação da actividade ciliar em condições fisiológicas. Para alcançar este objetivo a incubação ch microscópio padrãoâmbar pode ser usada para manter as amostras a 37 ° C.
Modificações simples para este protocolo irá torná-lo uma ferramenta poderosa para avaliar a regulação da atividade dos cílios das vias respiratórias por uma ampla gama de fatores, tais como o papel de agentes farmacológicos, temperatura, fatores genéticos, exposição ambiental e / ou fatores mecânicos, como a carga de muco em função dos cílios das vias aéreas e geração / manutenção de vias aéreas batimento ciliar.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O projeto foi financiado pelo NIH conceder U01HL098180 do National Heart, Lung, and Blood Institute. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do National Heart, Lung, and Blood Institute e do National Institutes of Health
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I.
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
