Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação de introduzir o entomopatógeno fungos<em> Beauveria bassiana</em> Como um endófito em feijoeiro (<em> Phaseolus vulgaris</em>), Em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica.
Beauveria bassiana é um entomopatógeno fúngico com a capacidade de colonizar plantas endofíticamente. Como um endófito, B. bassiana podem desempenhar um papel na protecção de plantas a partir de herbivoria e doença. Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação para estabelecer B. bassiana endofíticamente no feijão comum (Phaseolus vulgaris), em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica. As plantas são cultivadas a partir de sementes esterilizadas na superfície, durante duas semanas antes de receberem a B. bassiana tratamento de 10 8 conídios / ml (ou água) aplicado quer como uma pulverização foliar ou uma rega do solo. Duas semanas depois, as plantas são colhidas e suas folhas, caules e raízes são colhidas amostras para avaliar a colonização de fungos endofíticos. Para isso, as amostras foram individualmente superfície esterilizada, cortadas em secções múltiplas, e incubados em meio de batata dextrose ágar durante 20 dias. A mídia é inspecionado a cada 2-3 dias para observar o crescimento de fungos comoassociada com seções de plantas e registrar a ocorrência de B. bassiana para estimar a extensão da sua colonização endofítica. As análises de sucesso inoculação comparar a ocorrência de B. bassiana dentro de uma parte determinada planta (folhas, caules ou seja, ou raízes) entre os tratamentos e controles. Para além do método de inoculação, o resultado específico da experiência pode depender da espécie alvo ou variedade de culturas, as espécies de fungos entomopatógenos estirpe ou isolar utilizado, e as condições de crescimento da planta.
Entomopatógenos fungos são importantes reguladores das populações de insetos com potencial considerável como mycopesticides 1. Apenas recentemente, contudo, tem sido mostrado por fungos entomopatógenos a ocorrer como endófitos, ambos naturalmente e, em resposta a vários métodos de inoculação 2. A função ecológica da endofíticas entomopatógenos fúngicas permanece em grande parte desconhecida, mas alguns estudos têm implicado los no crescimento de plantas 3,4, resistência herbívoro 5-8, e resistência a doenças 9,10. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é a introdução de um entomopatógeno fungos como um endófito, em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) é a mais estudada entomopatógeno fúngica endofítica 5-9,11-19, e está disponível como uma mycopesticide comercial. Métodos de inoculação testados para estabelecer <em> B. bassiana como um endófito incluem poções solo 14,17, revestimentos de sementes 18 e 14 imersões, curativos radícula 13,15, de raiz e imersões rizoma, caule 11,16,18 injeções 17, pulverizações foliares 14,17,20 e sprays de flores 19. Utilizando estes métodos, os investigadores introduziram B. bassiana em 11 de banana, feijão 7, 13 cacau, café, 17, 7 milho, algodão 7, tamareira 12, juta 21, 20 papoula, abóbora 7, pinheiros radiata 18, 14 de sorgo, tomate e trigo 7 7. Evidências recentes sugerem que B. endofítica bassiana tem o potencial para proteger as plantas, não só a partir de pestes artrópodes 5-7,22-27, mas também de alguns agentes patogénicos de plantas 9.
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) está entre as culturas mais vulneráveis a pragase doenças. Ele pode ser afetada por mais de 400 pragas e patógenos 200, cujo ataque é pensado para ser o fator mais limitante da produção de feijão em todas as regiões 28. Por conseguinte, o feijão comum pode ser uma colheita excelente modelo para estudar o espectro de controlo biológico endofítica por B. bassiana. Como um primeiro passo nesta direção, este artigo descreve pulverizações foliares e poções do solo como métodos de inoculação para introduzir B.bassiana como um endófito em feijoeiro.
Muitos fatores podem influenciar o resultado de um experimento específico para estabelecer um entomopatógeno fungos como um endófito. Os nossos resultados demonstram o método de inoculação é um deles. Fatores biológicos para experimentar com incluem a colheita de espécies ou de cultivares selecionadas e do fungo entomopatogênico tensão espécies ou isolar usado. Outros factores a considerar incluem a manipulação da concentração do inoculo, a idade da planta durante a inoculação, e as condições de crescimento da planta.
Seria ideal para um método de inoculação de resultar em colonização planta sistémica por um fungo entomopatógeno 14,17,18,21. Em vez disso, parece que os métodos de inoculação tendem a favorecer um padrão específico de colonização local. No café, por exemplo, pulverizações foliares, ao passo que favorecem a colonização folha poções solo favorecem a colonização de raiz 17. Encontramos o mesmo padrão do feijoeiro comum. Finalmente, a escolha do método de inoculação deve serguiado pelo local pretendido do endófito dentro de uma planta, provavelmente combinando o nicho do herbívoro alvo ou patógeno de planta.
Embora comumente usado detecção, endófito e quantificação com base em meios de cultura pode ser caro, difícil e sujeito a erros. Por exemplo, um total de 10.800 partes de plantas (plaqueadas em placas de Petri 1800) foram avaliados num ensaio de optimizar B. inoculações bassiana em banana 16. Destes, 4.496 seções foram colonizados por um suposto B. bassiana, conforme identificado principalmente pela morfologia das colónias. Claramente, uma verificação microscópica das espécies para cada colônia teria sido um passo desejável, mas inacessível. Por outro lado, as secções 1176 foram colonizados por outros fungos e foram descartados e tratados como dados perdidos 16. A probabilidade de existir, no entanto, que a B. bassiana era um concorrente pobres ou mais lento a crescer, e poderia ter eventualmente emergiu dessas seções se umtempo suficiente llowed. Portanto, os métodos de detecção de endofíticos baseados em culturas de mídia estão sujeitos a falsos positivos e falsos negativos. Por conseguinte, o desenvolvimento de uma detecção mais fiável e quantificação de métodos, por exemplo aquelas baseadas em reacção em cadeia de polimerase (PCR) 20,21,24, é bem justificado.
O objetivo final para experimentos de inoculação deve ser desenvolver um tratamento eficaz que proporciona resistência sistêmica durável contra herbivoria e / ou doença. Um plausível, mas ainda não testados, a hipótese é a de que a extensão da colonização endofítica deve correlacionar-se positivamente com o grau de resistência mediada endófita. Um próximo passo natural após o refino métodos de inoculação, portanto, poderia ser a de examinar essa correlação. Vários protocolos de vídeo pode ajudar os pesquisadores a desenvolver um ensaio de resistência adequada para uma praga ou patógeno alvo 29-31. Em última análise, este ensaio é o que vai determinar o sucesso da inóculosmétodo ção, e do potencial para o controle biológico associado endofítica.
The authors have nothing to disclose.
A produção eo trabalho experimental aqui apresentados refletem a ajuda dedicado e entusiasta de Reynaldo Pareja. Financiado pelo Departamento Administrativo da Colômbia de Ciência, Tecnologia e Inovação (Colciencias) e por uma doação da Fundação Bill & Melinda Gates através da Grande iniciativa Explorations Desafios.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |