Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen fungina<em> Beauveria bassiana</em> Come endophyte nel fagiolo comune (<em> Phaseolus vulgaris</em>), In preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.
Beauveria bassiana è un entomopathogen fungina con la capacità di colonizzare piante endophytically. Come endophyte, B. bassiana può giocare un ruolo nel proteggere le piante da herbivory e malattia. Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per stabilire B. bassiana endophytically nel fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Le piante sono cresciute da semi sterilizzati in superficie per due settimane prima di ricevere una B. trattamento bassiana di 10 8 conidi / ml (o acqua) applicati sia come spray fogliare o inzuppare suolo. Due settimane più tardi, le piante vengono raccolte e le loro foglie, steli e radici vengono campionati a valutare endofitica colonizzazione fungina. Per questo, i campioni sono individualmente superficie sterilizzati, tagliato in più sezioni, e incubate in media patata destrosio agar per 20 giorni. Il supporto viene controllato ogni 2-3 giorni per osservare la crescita di funghi comesociated con sezioni dell'impianto e registrare il verificarsi di B. bassiana per stimare l'estensione della sua colonizzazione endofitica. Analisi di successo inoculazione confronta il verificarsi di B. bassiana all'interno di una parte dato impianto (cioè le foglie, steli o radici) attraverso trattamenti e controlli. In aggiunta al metodo di inoculazione, l'esito specifico dell'esperimento può dipendere coltura di destinazione o varietà, le specie fungine entomopathogen ceppo o isolare utilizzati, e condizioni di crescita della pianta.
Entomopatogeni fungine sono importanti regolatori di popolazioni di insetti con un notevole potenziale come mycopesticides 1. Solo recentemente, tuttavia, hanno entomopatogeni fungine stato verificato come endofiti, naturalmente o in risposta a vari metodi di inoculazione 2. La funzione ecologica di endofiti fungini entomopatogeni rimane in gran parte sconosciuta, ma alcuni studi li hanno implicato nella crescita delle piante 3,4, resistenza erbivoro 5-8, e la resistenza alle malattie 9,10. L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di introdurre un entomopathogen fungina come endophyte, in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) è il più studiato entomopathogen endofitica fungine 5-9,11-19, ed è disponibile come mycopesticide commerciale. Metodi di inoculazione testato per stabilire <em> B. bassiana come endofiti includono inzuppa suolo 14,17, rivestimenti di semi 18 e immersioni 14, condimenti radichetta 13,15, radici e rizoma immersioni 11,16,18, iniezioni stelo 17, spray fogliari 14,17,20 e spruzzi di fiori 19. Usando questi metodi, i ricercatori hanno introdotto B. bassiana in banane 11, fagiolo 7, cacao 13, caffè 17, mais 7, cotone 7, della palma da datteri 12, iuta 21, papavero da oppio 20, zucca 7, radiata pino 18, sorgo 14, pomodoro 7 e grano 7. Recenti evidenze suggeriscono che endofitica B. bassiana ha il potenziale per proteggere le piante non solo dai parassiti artropodi 5-7,22-27, ma anche da alcuni agenti patogeni delle piante 9.
Il fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), si classifica tra le colture più vulnerabili ai parassitie malattie. Esso può essere influenzata da più di 400 e 200 parassiti patogeni, la cui attacco è pensato per essere il più fattore limitante produzione di fagioli tra le regioni 28. Di conseguenza, il fagiolo comune può essere una coltura eccellente modello per esaminare l'intero spettro di endofitica controllo biologico di B. bassiana. Come primo passo in questa direzione, in questo articolo viene descritto spray fogliari e inzuppa suolo come metodi di inoculazione di introdurre B.bassiana come endophyte nel fagiolo comune.
Molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento specifico per stabilire una entomopathogen fungina come endophyte. I nostri risultati dimostrano il metodo di inoculazione è uno di loro. Fattori biologici di sperimentare sono il raccolto specie o cultivar selezionata e il ceppo fungina entomopathogen specie o isolare utilizzati. Altri fattori da considerare includono manipolare la concentrazione dell'inoculo, l'età della pianta durante inoculazioni, e condizioni di crescita della pianta.
Sarebbe ideale per un metodo di inoculazione di provocare colonizzazione vegetale sistemica da un fungo 14,17,18,21 entomopathogen. Invece, sembra che i metodi di inoculazione tendono a favorire un modello specifico di colonizzazione locale. Nel caffè, per esempio, spray fogliari favorire la colonizzazione foglia mentre inzuppa suolo favorire colonizzazione delle radici 17. Abbiamo trovato lo stesso modello nel fagiolo comune. In definitiva, la scelta del metodo di inoculazione dovrebbe essereguidati dalla posizione prevista del endofiti all'interno di un impianto, presumibilmente corrispondente alla nicchia del erbivoro di destinazione o patogeno per le piante.
Anche se comunemente usato, il rilevamento e la quantificazione endofiti basata sulle culture dei media può essere costoso, difficile e soggetto a errori. Ad esempio, un totale di 10.800 sezioni di impianto (piastrate su piastre Petri 1800) sono stati valutati in un esperimento per ottimizzare B. vaccinazioni bassiana su Banana 16. Di questi, 4.496 sezioni sono state colonizzate da un putativo B. bassiana, come individuate principalmente dalla morfologia delle colonie. Chiaramente, una verifica microscopica delle specie per ogni colonia sarebbe stato un passo auspicabile, ma inaccessibile. D'altra parte, 1.176 sezioni sono state colonizzate da funghi e altri sono stati scartati e trattati come dati mancanti 16. La probabilità esiste, tuttavia, che B. bassiana era un concorrente povero o più lento a crescere, e avrebbe potuto eventualmente emerse da queste parti se unllowed tempo sufficiente. Di conseguenza, i metodi di rilevamento endofiti basati sulle culture dei media sono soggetti a falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, lo sviluppo di un rilevamento più affidabile e quantificazione metodi, ad esempio quelle basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) saggi 20,21,24, è ben giustificata.
L'obiettivo finale per esperimenti di inoculazione dovrebbe essere quello di sviluppare un trattamento efficace che fornisce duratura resistenza sistemica contro erbivori e / o malattia. Una plausibile, ma ancora non testato, l'ipotesi è che l'entità della colonizzazione endofitica dovrebbe correlata positivamente con il grado di endofiti resistenza mediata. Un naturale passo successivo dopo la rifinitura metodi di inoculazione, quindi, potrebbe essere quello di esaminare la correlazione. Diversi protocolli video può aiutare i ricercatori a progettare un dosaggio adeguato di resistenza per un parassita o patogeno bersaglio 29-31. In definitiva, questo saggio è quello che determina il successo della inoculizione metodo, e il potenziale associato per endofitica controllo biologico.
The authors have nothing to disclose.
La produzione e il lavoro sperimentale qui presentato riflette l'aiuto devoto ed entusiasta di Reynaldo Pareja. Finanziato dal Dipartimento amministrativo della Colombia della Scienza, tecnologia e innovazione (Colciencias) e da una borsa di studio dalla Fondazione Bill & Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges Explorations iniziativa.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |