Summary
Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen fungina
Abstract
Beauveria bassiana è un entomopathogen fungina con la capacità di colonizzare piante endophytically. Come endophyte, B. bassiana può giocare un ruolo nel proteggere le piante da herbivory e malattia. Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per stabilire B. bassiana endophytically nel fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Le piante sono cresciute da semi sterilizzati in superficie per due settimane prima di ricevere una B. trattamento bassiana di 10 8 conidi / ml (o acqua) applicati sia come spray fogliare o inzuppare suolo. Due settimane più tardi, le piante vengono raccolte e le loro foglie, steli e radici vengono campionati a valutare endofitica colonizzazione fungina. Per questo, i campioni sono individualmente superficie sterilizzati, tagliato in più sezioni, e incubate in media patata destrosio agar per 20 giorni. Il supporto viene controllato ogni 2-3 giorni per osservare la crescita di funghi comesociated con sezioni dell'impianto e registrare il verificarsi di B. bassiana per stimare l'estensione della sua colonizzazione endofitica. Analisi di successo inoculazione confronta il verificarsi di B. bassiana all'interno di una parte dato impianto (cioè le foglie, steli o radici) attraverso trattamenti e controlli. In aggiunta al metodo di inoculazione, l'esito specifico dell'esperimento può dipendere coltura di destinazione o varietà, le specie fungine entomopathogen ceppo o isolare utilizzati, e condizioni di crescita della pianta.
Introduction
Entomopatogeni fungine sono importanti regolatori di popolazioni di insetti con un notevole potenziale come mycopesticides 1. Solo recentemente, tuttavia, hanno entomopatogeni fungine stato verificato come endofiti, naturalmente o in risposta a vari metodi di inoculazione 2. La funzione ecologica di endofiti fungini entomopatogeni rimane in gran parte sconosciuta, ma alcuni studi li hanno implicato nella crescita delle piante 3,4, resistenza erbivoro 5-8, e la resistenza alle malattie 9,10. L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di introdurre un entomopathogen fungina come endophyte, in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) è il più studiato entomopathogen endofitica fungine 5-9,11-19, ed è disponibile come mycopesticide commerciale. Metodi di inoculazione testato per stabilire
Il fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), si classifica tra le colture più vulnerabili ai parassitie malattie. Esso può essere influenzata da più di 400 e 200 parassiti patogeni, la cui attacco è pensato per essere il più fattore limitante produzione di fagioli tra le regioni 28. Di conseguenza, il fagiolo comune può essere una coltura eccellente modello per esaminare l'intero spettro di endofitica controllo biologico di B. bassiana. Come primo passo in questa direzione, in questo articolo viene descritto spray fogliari e inzuppa suolo come metodi di inoculazione di introdurre B.bassiana come endophyte nel fagiolo comune.
Protocol
1. Piante
- Surface-sterilizzare semi di fagiolo (cv. Calima) immergendole per due minuti in ipoclorito di sodio allo 0,5% e due minuti in etanolo al 70%. Sciacquare i semi tre volte in acqua distillata sterile.
- Valutare il successo della vostra sterilizzazione con placcatura 100 pl di l'ultima acqua di risciacquo per patate dextroxe agar (PDA) media, e incubando la piastra per 10 giorni a 25 ° C. Terminare e riavviare l'esperimento se la crescita è visto sul piatto.
- Piantare i semi in gruppi di tre in vasi contenenti una miscela sterile di terra e sabbia con un rapporto 2:1. Trasferire i vasi ad una camera di crescita a 25 ° C, ca. 50% UR e 12 ore fotoperiodo. Una settimana dopo la germinazione, eliminare le due piantine meno vigorose. Acqua, ogni 2-3 giorni con acqua distillata sterile e fertilizzare 10 e 20 giorni dopo la semina con un g / L 6 soluzione acquosa di concime NPK 15-15-15.
2. Fungo
- Ottenere un commerformulazione finanziaria di Beauveria bassiana ceppo GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia).
- Per generare una singola spora coltura madre, sospendere ca. uno inoculo anello pieno di conidi in 1 ml di una soluzione acquosa al 0,1% di Triton X-100 e vortex per 10 sec. Poi, piastra 100 microlitri della sospensione sul 2,5% agar Noble e incubare per 24 ore a 25 ° C. Trasferire un singolo conidio germinando in un PDA 100 millimetri piatto contenente e crescere fino a coprire l'intera piastra (circa 3-4 settimane).
- In condizioni di sterilità, raschiare la crescita fungina dalla superficie del terreno e sospendere in 10 ml sterile 0,1% Triton X-100. Vortex per un minuto. Poi, filtrare la sospensione attraverso una garza sterile per rimuovere ife e ottenere la sospensione stock.
- Utilizzare un emocitometro di valutare la concentrazione conidi della sospensione stock. Per facilitare i conteggi conidi, preparare un 10.000 volte diluizione seriale del magazzino, ogni volta che il trasferimento di 100 pl of sospensione di conidi in 900 pl di 0,1% Triton X-100, e di vortex per 10 secondi prima della successiva diluizione.
- Per generare l'inoculo, regolare la sospensione magazzino ad una concentrazione finale di 10 8 conidi / ml, usando la formula:
- Per valutare la redditività conidi, piastra 100 microlitri della 10.000 volte diluizione sul 2,5% agar Nobile e incubare per 24 ore a 25 ° C. Quindi, controllare tre gruppi casuali di 100 conidi per stimare la germinazione per cento. Considerare un conidio germinato quando un tubo germe visibile più di metà del diametro dei progetti conidio da esso. Utilizzare solo la sospensione quando la germinazione percentuale media superiore al 90%.
3. Inoculazione
- Seminare piante quando raggiungono la loro prima fase foglie vere (circa 14 giorni dopo la semina). Le piante acquatiche alla capacità del suolo con sterile distillareed acqua 24 ore prima di vaccinazioni.
- Per il metodo spray fogliare, utilizzare un atomizzatore manuale per applicare la sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) al adaxial (superiore) superficie delle foglie fino a raggiungere la saturazione. Coprire la parte superiore del vaso con un foglio di alluminio per evitare il deflusso conidi al suolo. Dopo la spruzzatura, coprire le piante con un sacchetto di plastica per 24 ore per mantenere un elevato livello di umidità facilitare invasione fungina.
- Per il metodo del suolo drench, utilizzare un cilindro graduato da applicare 10 ml di sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) alla superficie del terreno alla base della pianta.
- Dopo vaccinazioni, tornare impianti alle camere di crescita organizzare in un disegno randomizzato blocco completo. Non meno di quattro blocchi aggiuntivi sperimentali deve essere installato per consentire valutazioni di crescita delle piante, oltre a valutazioni di colonizzazione endofitica, nello stesso esperimento.
4. Evalgenza
- Valutare l'esperimento un blocco alla volta, selezionando i blocchi in ordine casuale. Ciò è particolarmente importante per gli esperimenti di grandi dimensioni che non possono essere valutati in un solo giorno.
- Prima di elaborare una pianta, misurare e registrare la sua altezza dalla base al meristema apicale. Poi, sradicare con attenzione e lavare accuratamente in acqua corrente.
- Da ogni campione vegetale, due foglioline, due pezzi di radice e due pezzi di stelo. Selezionare casualmente campioni foglietto dalla prima foglia vera della pianta. Quindi, ottenere due campioni staminali, 3 cm di lunghezza ciascuno, dal centro della pianta e dalla prossimità della superficie del terreno. Infine, ottenere due campioni Taproot, anche 3 cm di lunghezza ciascuno, a partire dalla metà della radice e da 1 cm dietro la punta della radice. Porre i campioni in tre sacchetti di carta separati e di etichette in modo appropriato.
- Dopo il lavaggio e campionamento tutte le piante in un blocco, iniziare lavorazione delle foglie, poi le radici, e, infine, i gambi.
- Surface sterilizzare tproblemi in una cappa a flusso laminare sterile come in 1.1, di cui sopra. Lavare ogni campione tre volte per immersione in acqua distillata sterile e lasciare asciugare in un tovagliolo di carta sterile. Poi, sezionare e scartare i suoi bordi esterni, dove endofiti potrebbe essere stato eliminato a causa del contatto con disinfettanti.
- Tagliare il campione tagliato in sei sezioni, con una media 6x6 millimetri per le foglie e 6 mm di lunghezza per steli e radici. Tavola delle sei sezioni su un piatto 60 millimetri Petri con i media PDA integrato con la tetraciclina antibiotici, streptomicina e penicillina a 2 mg / L ciascuno. Sigillare la piastra con parafilm e incubare al buio a 25 ° C. Ogni pianta produce sei piatti, due parti per impianti.
- Cambiare l'acqua di risciacquo dopo l'elaborazione di ogni blocco di una parte dato impianto. Prima di eliminare l'usato acqua di risciacquo, piatto un campione di 100 microlitri su supporti PDA e incubare per 10 giorni a 25 ° C per valutare il successo di sterilizzazione. Se la crescita fungina ne consegue, non considerano i campioni corrispondenti per le analisi.
- Ispezionare le piastre ogni 2-3 giorni per 20 giorni per osservare e registrare la crescita di funghi. Sezioni d'impianto accise e il trasferimento espone presenza di endofiti fungini alle piastre contenenti PDA fresco. Ciò consente di evitare la contaminazione delle sezioni d'impianto connessi applicabili alla piastra originale.
- Record B. crescita bassiana da sezioni dell'impianto. Beauveria bassiana può essere identificato dal caratteristico miceli bianco denso diventando crema a giallo pallido al bordo. In caso di dubbio, montare il campione in una goccia d'acqua e controllare al microscopio, alla ricerca di conidi globosi e zig-zag a forma di conidiofori, caratteristica della specie.
- Utilizzare ulteriori blocchi sperimentali per valutare l'impatto dei trattamenti sulla biomassa vegetale. Primo, misurare l'altezza dalla base alla sommità del meristema apicale. Poi, con attenzione sradicare le piante e lavare in acqua corrente e lasciarli asciugare a 45 ° C per tre giorni per determinare il loro peso secco.
Representative Results
B. bassiana è stato in grado di colonizzare endophytically-P. vulgaris in risposta ai trattamenti inoculazione dimostrato (Figura 1). Sia spray fogliari e inzuppa del suolo ha determinato la colonizzazione endofitica da B. bassiana in oltre l'80% delle piante trattate (Figura 2). Tuttavia, il grado di colonizzazione dipendeva da parte dell'impianto valutata e il metodo di inoculazione utilizzato. Foglie risposto meglio per vaccinazioni a spruzzo. Roots, invece, risposto solo a inoculazioni bagnarsi. Infine, steli risposto analogamente a entrambi i metodi di inoculazione. B. bassiana non è stata rilevata in nessuna delle sezioni dell'impianto di controllo.
Indipendentemente dalle endofiti, di trattamento di B. bassiana è cresciuto dal 15% delle sezioni d'impianto valutate, ma sono stati sezionati fuori dalle piastre di supporto prima che potessero invadere sezioni confinanti e influenzare i risultati.
Gli impianti di trattamento e di controllo sono visibilmente distinguibili due settimane dopo vaccinazioni. Nessuna differenza è stata rilevata nel loro peso secco e la loro altezza.
Figura 1. I risultati rappresentativi dei trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di piante di fagiolo (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Da Beauveria bassiana alto a sinistra:. Controllo lamiere senza crescita. In alto a destra: funghi endofiti da una sezione di impianto di contaminare l'intera piastra. In basso a sinistra: B. bassiana crescente da due sezioni di impianto. In basso a destra: endofiti B. bassiana conidi e conidiofori come si è visto al microscopio.
Figura 2. Effetto di trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di beaimpianti n (Phaseolus vulgaris cv. Calima) di Beauveria bassiana, due settimane dopo l'inoculazione con GHA ceppo. colonizzazione Percent rappresenta il numero di sezioni di impianto colonizzati diviso per il numero di sezioni di coltura.
Discussion
Molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento specifico per stabilire una entomopathogen fungina come endophyte. I nostri risultati dimostrano il metodo di inoculazione è uno di loro. Fattori biologici di sperimentare sono il raccolto specie o cultivar selezionata e il ceppo fungina entomopathogen specie o isolare utilizzati. Altri fattori da considerare includono manipolare la concentrazione dell'inoculo, l'età della pianta durante inoculazioni, e condizioni di crescita della pianta.
Sarebbe ideale per un metodo di inoculazione di provocare colonizzazione vegetale sistemica da un fungo 14,17,18,21 entomopathogen. Invece, sembra che i metodi di inoculazione tendono a favorire un modello specifico di colonizzazione locale. Nel caffè, per esempio, spray fogliari favorire la colonizzazione foglia mentre inzuppa suolo favorire colonizzazione delle radici 17. Abbiamo trovato lo stesso modello nel fagiolo comune. In definitiva, la scelta del metodo di inoculazione dovrebbe essereguidati dalla posizione prevista del endofiti all'interno di un impianto, presumibilmente corrispondente alla nicchia del erbivoro di destinazione o patogeno per le piante.
Anche se comunemente usato, il rilevamento e la quantificazione endofiti basata sulle culture dei media può essere costoso, difficile e soggetto a errori. Ad esempio, un totale di 10.800 sezioni di impianto (piastrate su piastre Petri 1800) sono stati valutati in un esperimento per ottimizzare B. vaccinazioni bassiana su Banana 16. Di questi, 4.496 sezioni sono state colonizzate da un putativo B. bassiana, come individuate principalmente dalla morfologia delle colonie. Chiaramente, una verifica microscopica delle specie per ogni colonia sarebbe stato un passo auspicabile, ma inaccessibile. D'altra parte, 1.176 sezioni sono state colonizzate da funghi e altri sono stati scartati e trattati come dati mancanti 16. La probabilità esiste, tuttavia, che B. bassiana era un concorrente povero o più lento a crescere, e avrebbe potuto eventualmente emerse da queste parti se unllowed tempo sufficiente. Di conseguenza, i metodi di rilevamento endofiti basati sulle culture dei media sono soggetti a falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, lo sviluppo di un rilevamento più affidabile e quantificazione metodi, ad esempio quelle basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) saggi 20,21,24, è ben giustificata.
L'obiettivo finale per esperimenti di inoculazione dovrebbe essere quello di sviluppare un trattamento efficace che fornisce duratura resistenza sistemica contro erbivori e / o malattia. Una plausibile, ma ancora non testato, l'ipotesi è che l'entità della colonizzazione endofitica dovrebbe correlata positivamente con il grado di endofiti resistenza mediata. Un naturale passo successivo dopo la rifinitura metodi di inoculazione, quindi, potrebbe essere quello di esaminare la correlazione. Diversi protocolli video può aiutare i ricercatori a progettare un dosaggio adeguato di resistenza per un parassita o patogeno bersaglio 29-31. In definitiva, questo saggio è quello che determina il successo della inoculizione metodo, e il potenziale associato per endofitica controllo biologico.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
La produzione e il lavoro sperimentale qui presentato riflette l'aiuto devoto ed entusiasta di Reynaldo Pareja. Finanziato dal Dipartimento amministrativo della Colombia della Scienza, tecnologia e innovazione (Colciencias) e da una borsa di studio dalla Fondazione Bill & Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges Explorations iniziativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
| Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
| Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
| Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
| Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
| Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Leica DM LB microscope | Leica | N/A | |
References
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