Bioengineering

エンドファイトのような真菌Entomopathogensの確立：内生生物制御に向けて

Published: April 11, 2013 doi: 10.3791/50360

Soroush Parsa¹, Viviana Ortiz¹, Fernando E. Vega²

¹Entomology, International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia, ²Sustainable Perennial Crops Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, USA

Summary

このプロトコルは、真菌昆虫病原物質を導入するには、2つの接種方法を示しています

Abstract

ボーベリアは endophytically植物にコロニーを形成する能力を持つ菌の昆虫病原物質である。エンドファイト、Bとバッシアナは草食や病気から植物を保護する役割を果たしている可能性がある。このプロトコルは、Bを確立する2つの接種方法を示しています内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために一般的な豆（ インゲンマメ ）でendophytically バッシアナ 。植物は、Bを受信する前に、2週間の表面殺菌した種子から栽培されている10 ⁸分生子/ ml（または水）のボーベリア治療は、葉面散布や土壌潅注のいずれかとして適用された。二週間後、植物を採取し、それらの葉、茎、根は内生菌類のコロニー形成を評価するためにサンプリングされます。このために、サンプルを個別に、滅菌した面である複数のセクションにカットし、20日間ポテトデキストロース寒天培地中でインキュベートした。メディアは次のように真菌の増殖を観察するために2〜3日ごとに検査されプラントセクションとレコード Bの発生とsociated バッシアナそのエンドファイトの植民地化の程度を推定する。接種の成功の分析は、Bの発生を比較するトリートメントやコントロール間で与えられた植物の部分の中でバッシアナ （ すなわち 、葉、茎または根）。接種方法に加えて、実験の具体的な成果が目標作物種または品種に依存することがあり、真菌種は、昆虫病原物質株または使用切り分け、植物の生育条件。

Introduction

真菌entomopathogensはmycopesticides ¹とかなりの可能性を秘めた昆虫集団の重要な調節因子である。ごく最近になって、しかし、真菌entomopathogensは両方の自然と様々な接種方法²に応答して、エンドファイトとして発生することが示されている。内部寄生菌類entomopathogensの生態学的機能の大部分は不明のままですが、いくつかの研究では、植物の成長^3,4、草食性^5-8、および病害抵抗^9,10でそれらが示唆されている。ここで紹介する方法の全体的な目的は、内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために、エンドファイトとして菌類昆虫病原物質を導入することである。

ボーベリア （バルサモ）Vullemin（子嚢菌門：ボタンタケ）が最も研究内生菌の昆虫病原物質^5-9,11-19であり、そしてそれは商業mycopesticideとして利用可能です。接種方法を確立するためにテスト14,17、種子コーティング¹⁸および浸漬^14、幼根ドレッシング^13,15、根および根茎はめ込み^11,16,18、幹注射^17、葉面スプレー^14,17,20と花スプレー^19を含む。これらのメソッドを使用して、研究者はBを導入していますバナナ¹¹にバッシアナ 、豆^7、カカオ^13、コーヒー^17、コーン^7、綿^7、ナツメヤシ^12、ジュート²¹ケシ^20、カボチャ^7、ラジアータ松^18、モロコシ^14、トマト^7、小麦^7。最近の証拠は、その内生Bを示唆しているバッシアナだけではなく、節足動物害虫^5-7,22-27から植物を保護するために可能性を秘めているだけでなく、いくつかの植物病原体⁹から。

インゲンマメ（ インゲンマメ ）害虫の影響を最も受けやすい作物間のランクと疾患。それは、その攻撃の領域²⁸を越え、最も制限的な豆生産要素であると考えられている400以上の害虫や病原体200によって影響を受けることができます。したがって、共通のBeanがBで内部寄生生物的防除の完全なスペクトルを調べるために優れたモデル作物かもしれませんバッシアナ 。この方向での最初のステップとして、この記事では、インゲンマメにおけるエンドファイトとしてB.bassianaを導入するために接種方法として葉面スプレーや土壌の水薬を説明しています。

Protocol

1。植物

0.5％次亜塩素酸ナトリウム、70％エタノールで2分で2分のためにそれらを浸漬することにより豆の種子（品カリマ）の表面殺菌。種子を滅菌蒸留水で3回リンスする。
ジャガイモdextroxeス寒天（PDA）培地上で最後のすすぎ水100μlをメッキし、25℃で10日間プレートをインキュベートすることによって殺菌の成功℃を評価するどんな成長がプレート上に確認された場合の実験を終了し、再起動します。
2:1の比率で土と砂の混合物を含有する無菌のポットに3つのグループに種を植える。 25℃で成長チャンバ℃、CAに鉢を移す。 50％RH、12時間日長。一週間発芽後、2つ以上積極的な苗を排除します。水滅菌蒸留水で2〜3日毎とNPK 15-15-15の肥料6g / Lの水溶液で播種後10日と20日肥やす。

2。菌

商業を得るボーベリアひずみGHA（Mycotrol SE、Laverlam、カリ、コロンビア）の金融製剤。
単一胞子在庫文化を生成するには、CAを中断します。 1は、Triton X-100、10秒間ボルテックスの0.1％水溶液1mlに分生子の完全なループを接種。その後、25℃で24時間プレートは2.5％ノーブル寒天とインキュベート上の懸濁液100μl℃、 PDAを含む100mmプレートに単発芽分生子を転送し、それがプレート全体（約3〜4週間）をカバーするまでに成長。
無菌条件下で、培地の表面から真菌の増殖を削ると10 mlの滅菌0.1％トリトンX-100でそれを中断します。 1分間ボルテックスする。その後、菌糸を除去し、純正サスペンションを得るために無菌寒冷紗を通して懸濁液をろ過する。
純正サスペンションの分生子濃度を推定するために血球計を使用してください。生子カウントを容易にするため、各時間は、100μlのoを譲渡、株式の10,000倍希釈を準備0.1％トリトンX-100、および次の希釈前に10秒間ボルテックス900μlの中のf分生子懸濁液。
接種材料を生成するには、次式を用いて、10 ⁸分生子/ mlの最終濃度に純正サスペンションを調整します。
25℃で24時間、2.5パーセントノーブル寒天、インキュベートで10,000倍希釈液の分生子の生存率、プレートを100μlを評価するために℃のその後、パーセント発芽を推定するために100分生子の3つのランダムなグループを検査します。発芽分生子を考えると、そこから分生子プロジェクトの直径の半分以上見える発芽管より長い。平均パーセント発芽率が90％を超えた場合にのみサスペンションを使用しています。

3。接種

彼らは最初の真の葉期（播種後約14日間）に達したときに植物を植菌する。無菌蒸留による土壌容量に水プラントED水の接種前に24時間。
葉面散布の方法については、それらが飽和状態に達するまでの葉の向軸（上側）表面に分生子懸濁液（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するには、手動噴霧器を使用しています。土壌に分生子の流出を避けるためにアルミホイルで鍋の上部を覆う。噴霧した後、菌の侵入を容易に湿度の高いレベルを維持するために24時間、ビニール袋で植物をカバーしています。
土壌灌注方法については、植物の根元の土壌の表面に分生子懸濁液10ml（治療）または0.1％トリトンX-100（コントロール）を適用するためにメスシリンダーを使用しています。
接種後、乱塊法でそれらを整理して成長室に植物を返す。劣らず4より追加の実験ブロックは同じ実験で、内生の植民地化の評価に加えて、植物の成長の評価を可能にするためにインストールする必要があります。

4。評価uations

ランダムな順序でブロックを選択し、一度に実験1ブロックを評価します。これは1日で評価できない大実験のために特に重要です。
植物を処理する前に、測定し基部から頂端分裂組織にその高さを記録します。その後、慎重に根絶し、水道水の流水でよく洗ってください。
各工場から、サンプル2リーフレット、根の2個、茎の二枚。植物の最初の本葉からランダムリーフレットのサンプルを選択します。その後、工場の真ん中から、土壌表面付近から、2幹サンプル、3センチ長さがそれぞれを得る。最後に、ルートの途中からと根端の後ろに1cmから、また、3 cmの長さがそれぞれ、2主根のサンプルを入手してください。適当に3つの別々の紙袋やラベルにサンプルを置きます。
ブロック内のすべての植物を洗浄、サンプリングした後、最終的に根、茎、次に葉を処理することによって開始します。
表面はトンを消毒上記1.1のような無菌層流フードで問題。滅菌蒸留水に浸漬することにより、各サンプルを3回リンスし、滅菌タオルペーパーで乾燥させます。その後、エンドファイトが消毒との接触により排除されている可能性があり、その外側のエッジを、解剖して廃棄します。
茎や根の葉と6mmの長い間、6x6のミリメートルを平均、6つのセクションにトリミングされたサンプルをカットします。プレート2 mg / Lのそれぞれにおける抗生物質テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ペニシリン、PDAのメディアと60ミリメートルペトリ皿の上に6つのセクション。パラフィルムでプレートをシールし、25℃、暗所でインキュベート℃を各工場では、6つのプレート、2当たりの植物の一部が得られます。
与えられた植物の部分の各ブロックを処理した後、すすぎ水を変更します。捨てる前に使用し、水洗、プレート℃は殺菌の成功を25℃で10日間インキュベートし、PDA、メディア上に100μlのサンプルを評価した。真菌の増殖が続いて起こる場合には、分析のための対応するサンプルを考慮していない。
真菌の増殖を観察し、記録するために20日間、2〜3日毎プレートを点検してください。物品税と移転植物のセクションでは、新鮮なPDAを含むプレートに真菌エンドファイトの存在を示す。これは、元のプレート内の隣接するプラントセクションの汚染を避けることができます。
レコード Bプラントセクションからバッシアナ成長 。 ボーベリアは、特徴的な白い菌糸が密なエッジで淡黄色にクリームになることによって識別することができます。疑問がある場合は、一滴の水に試料をマウントし、顕微鏡下で検査し、種の特徴、球形の分生子とジグザグ状の分生子柄を探しています。
植物バイオマスに治療の影響を評価するために、追加の実験的ブロックを使用します。まず、基地からの頂端分裂組織のトップには、高さを測定します。その後、慎重に根絶し、水道水で植物を洗うとその乾燥重量を決定するために、三日間45℃で、それらを乾燥させます。

Representative Results

B.バッシアナはPを endophytically -植民地化することができました実証接種トリートメント（ 図1）に対応して尋常性 。 B.によってエンドファイト植民地化につながっ葉面スプレーや土壌水薬両方処理された植物の80％以上でバッシアナ （ 図2）。しかし、植民地化の程度が評価さ植物部分および使用接種方法に依存していた。葉は、噴霧接種に最高の答え。ルーツは、他の一方で、水薬接種のみに対応した。最後に、両方の接種方法と同様に答えた茎。B.はバッシアナは制御プラントのどのセクションにも検出されなかった。

治療の独立したA、B以外のエンドファイトバッシアナが評価プラントセクションの15％から増加したが、彼らは隣接するセクションに侵入し、業績に影響を与える前に、彼らは、メディア·プレートから摘出された。

治療群と対照植物は2週間接種後に目に見えて区別がつかなかった。差異は、その乾燥重量にして、その高さで検出されなかった。

図1。 ボーベリアによって豆の植物の内生植民地化（。 インゲンマメ品種カリマ）の接種トリートメントの代表的な結果左上：制御なしに成長したプレート。右上：プレート全体を汚染プラントセクションから真菌エンドファイト。左下：Bバッシアナは、2つのプラントセクションから成長しています。右下：エンドファイトB.バッシアナ生子および分生子柄は、顕微鏡下で見られる。

図2。 BEAのエンドファイトの植民地に接種処理の効果ひずみGHAと接種後のボーベリア 、二週間で、n植物（ インゲンマメ品種カリマ）が。パーセント植民地化が培養されたセクションの数で割った植民地化プラントセクションの数を表します。

Discussion

多くの要因がエンドファイトのような真菌昆虫病原物質を確立するための実験の特定の結果に影響を与えることができる。我々の結果は、接種方法は、そのうちの一つであることを示している。を使って実験する生物学的要因は、作物の種や品種を選択し、真菌種昆虫病原物質の歪みを含めたり、隔離するために使用。操作に考慮すべきその他の要因としては、接種物の濃度、接種時の植物の年齢、および植物の生育条件が含まれています。

それは、真菌昆虫病原物質^14,17,18,21によって全身植物植民地化の結果に接種方法のために理想的であろう。代わりに、それは、接種方法は、ローカルの植民地化の特定のパターンを好む傾向があるように思われる。土壌水薬がルート植民^17を好むのに対し、コーヒーでは、例えば、葉面スプレーは葉の植民地化を支持している。我々は、共通のBeanで同じパターンを発見した。最終的には、接種方法の選択は、あるべきおそらくターゲット草食動物や植物病原体のニッチをマッチング、工場内のエンドファイトの意図された場所に導かれ。

一般的に使用されていますが、メディア文化に基づいたエンドファイト検出および定量は、高価難しく、エラーが発生しやすくなります。たとえば、10800植物切片（1800ペトリ皿上にプレート）の合計は、Bを最適化するために、実験で評価したバナナ¹⁶でバッシアナ接種 。これらのうち、4496セクションは推定Bによって植民地化されたとして主にコロニー形態によって識別バッシアナ 、。明らかに、各コロニーのための樹種の微視的検証が望ましいのですが手が届かない段階だっただろう。一方、1176セクションは他の菌類によって植民地化され、破棄され、データ^16を行方不明として扱われていました。確率はそのB.しかし、存在バッシアナが悪い選手や成長することが遅かったし、最終的にそれらのセクションから浮上している可能性がある場合十分な時間をllowed。したがって、メディア文化に基づいたエンドファイトの検出方法としては、偽陽性と偽陰性の対象となります。従って、例えば、より信頼性の高い検出および定量方法の開発は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイ^20,21,24に基づくものは、十分に正当化される。

接種実験のための究極の目標は、草食性および/または疾患に対して耐久性のある全身の抵抗を提供する効率的な治療法を開発することであるべきです。もっともらしいが、まだテストされていない、仮説は、エンドファイトの植民地化の程度は、エンドファイト媒介抵抗の程度と正の相関であるということです。接種方法を精緻化した後自然な次のステップは、そのため、この相関関係を調べることである可能性があります。いくつかのビデオプロトコルは、研究者が標的害虫や病原体^29から31に適した抵抗性検定を設計するのを助けることができます。最終的には、接種の成功を決定する何このアッセイであるる方法、および内部寄生生物的防除のために関連する潜在的な。

Disclosures

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

生産と実験的な作品は、本明細書でレイナルドパレハの献身的で熱心な助けを反映提示。科学技術革新のコロンビアの管理部門（Colciencias）により、グランドチャレンジレーションズ·イニシアチブを通じてビル＆メリンダ·ゲイツ財団からの助成金によって賄われて。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A