הקמת Entomopathogens פטרייתיים כEndophytes: לקראת ההדברה ביולוגית Endophytic

Summary

פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות חיסון להציג entomopathogen פטרייתי

Abstract

Beauveria bassiana הוא entomopathogen פטרייה עם היכולת ליישב צמחי endophytically. כendophyte, B. bassiana עשוי לשחק תפקיד בהגנת צמחים מתזונה צמחונית ומחלה. פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות חיסון להקמת B. bassiana endophytically בשעועית מצויה (Phaseolus vulgaris), כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic. צמחים גדלים מזרעי קרקע מעוקרת במשך שבועות לפני שקבל ב ' טיפול bassiana של 10 ⁸ נבגים / מ"ל (או מים) מיושם גם כתרסיס עלים או אדמה להציף. שבועות לאחר מכן, את הצמחים נקטפים והעלים, גבעוליהם והשורשים נדגמים להעריך קולוניזציה פטרייתי endophytic. לשם כך, דגימות בנפרד משטח מעוקרות, חתוכים למקטעים מרובים, וטופחו בתקשורת אגר דקסטרוז תפוחי אדמה במשך 20 ימים. התקשורת נבדקת כל 2-3 ימים להתבונן צמיחת פטרייה כsociated עם חלקי צמח ולהקליט את המופע של B. bassiana לאמוד את ההיקף של קולוניזציה endophytic. אנליזות של הצלחת חיסון להשוות את המופע של B. bassiana בתוך חלק צמח נתון (כלומר עלים, גבעולים או שורשים) על פני טיפולים ובקרות. בנוסף לשיטת החיסון, תוצאה המסוימת של הניסוי עשויה להיות תלויה במגוון מינים או חיתוך היעד, מין entomopathogen פטרייתיים להתאמץ או לבודד שימוש, ותנאים של גידול הצמחים.

Introduction

entomopathogens פטרייתיים הם רגולטורים חשובים של אוכלוסיות חרקים בעלי פוטנציאל רב כמו ¹ mycopesticides. רק לאחרונה, עם זאת, יש לי entomopathogens פטרייתיים הוכח להתרחש כendophytes, הוא באופן טבעי ובתגובה לשיטות חיסון שונות ^2. התפקוד האקולוגי של entomopathogens פטרייתיים endophytic נותר במידה רבה בלתי ידוע, אך מספר מחקרים מעורבים אותם בגידול צמחים ^3,4, התנגדות אוכלי עשב ^5-8, ועמידות למחלות ^9,10. המטרה הכוללת של השיטות שהוצגו כאן היא להציג entomopathogen פטרייתי כendophyte, כהכנה להערכות עתידיות של דברה ביולוגית endophytic.

Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) הוא entomopathogen ביותר למד endophytic פטרייתי ^5-9,11-19, והוא זמין כmycopesticide מסחרי. שיטות חיסון נבדקו כדי להקים 14,17, ציפוי זרעים ¹⁸ והתעמקות ^14, תחבושות radicle ^13,15, שורש וקנה שורש התעמקות ^11,16,18, גזע ¹⁷ זריקות, תרסיסי foliar ^14,17,20 ותרסיסי פרחי ^19. שימוש בשיטות אלה, חוקרים הציגו ב bassiana ^ל11 בננה, ⁷ שעועית, ¹³ קקאו, קפה ^17, תירס ^{7, 7} כותנה, תמרים ^12, יוטה ^21, פרג אופיום ^20, דלעת ^7, radiata ¹⁸ אורן, סורגום ^{14, 7} ו ⁷ עגבניות חיטה. הראיות האחרונות עולות כי ב endophytic bassiana יש פוטנציאל להגן על צמחים מפני מזיקים לא רק חרקים ^5-7,22-27, אלא גם מכמה פתוגנים צמח ^9.

השעועית מצויה (Phaseolus vulgaris) מדרגת בין גידולים לפגיעים ביותר למזיקיםומחלות. זה יכול להיות מושפע על ידי יותר מ 400 מזיקים ופתוגנים 200, התקפה שנחשב לגורם ייצור השעועית המגבילה ביותר על פני ²⁸ אזורים. בהתאם לכך, השעועית המשותפת עשויה להיות יבול מודל מצוין לבחון את מלוא הספקטרום של הדברה ביולוגית endophytic ידי B. bassiana. כצעד ראשון בכיוון זה, מאמר זה מתאר תרסיסי foliar ומתיז על קרקע כשיטות חיסון להציג B.bassiana כendophyte בשעועית המשותפת.

Protocol

1. צמחים

1. Surface-לעקר זרעי שעועית (cv. Calima) על ידי טבילתם במשך שתי דקות ב0.5% נתרן היפוכלוריט ושתי דקות באתנול 70%. יש לשטוף השלוש פעמי הזרעים במים מזוקקים סטריליים.
2. להעריך את ההצלחה שלך על ידי עיקור ציפוי 100 μl של מי השטיפה האחרונה על אגר תקשורת dextroxe תפוחי אדמה (PDA), ודוגר הצלחת במשך 10 ימים ב 25 ° C. להפסיק ולהפעיל מחדש את הניסוי אם כל צמיחה נראית על הצלחת.
3. לזרוע את הזרעים בקבוצות של שלושה בסירים המכילים תערובת סטרילית של אדמה וחול ב2:1. להעביר את הסירים לחדר צמיחה ב 25 ° C, CA. 50% לחות יחסית והשעות photoperiod 12. שבוע לאחר נביטה, לחסל את שני שתילים הנמרצים לפחות. מים כל 2-3 ימים עם מים מזוקקים סטריליים ולהפרות 10 ו 20 ימים לאחר השתילה בתמיסת 6 גרמה / ליטר מים של דשן NPK 15-15-15.

2. פטרייה

1. השג commerניסוח סוציאלי של Beauveria bassiana מתח GHA (Mycotrol SE, Laverlam, קאלי, קולומביה).
2. כדי ליצור תרבות מנייה יחידה נבג, להשעות CA. 1 inoculating לולאה מלאה של נבגים ב1 מ"ל של 0.1% תמיסת מים של טריטון X-100 ומערבולת עבור 10 שניות. ואז, 100 μl הצלחת של ההשעיה על אגרת 2.5% נובל ודגירה במשך 24 שעות ב 25 ° C. העברת conidium נובט יחידה לתוך PDA 100 מ"מ צלחת המכיל ולגדול עד שמכסה את כל הצלחת (3-4 שבועות בקירוב).
3. בתנאים סטריליים, לגרד את צמיחת הפטרייה מפני השטח של המדיום ולהשעות אותו ב0.1% סטרילי מ"ל 10 טריטון X-100. מערבולת במשך דקה אחת. לאחר מכן, מסנן את ההשעיה דרך גזה סטרילית להסרת עובש ולקבל השעית המניות.
4. השתמש hemocytometer להעריך את ריכוז הנבגים של השעית המניות. כדי להקל על ספירת נבגים, להכין דילול סדרתי 10,000 כפול של המניות, בכל פעם העברת 100 o μlו השעית נבגים ב900 μl של 0.1% טריטון X-100, וvortexing ל10 שניות לפני הדילול הבא.
5. כדי להפיק את הבידוד, להתאים את השעית המנייה לריכוז סופי של 10 ⁸ נבגים / מ"ל, תוך שימוש בנוסחא:
   
6. על מנת להעריך את הכדאיות, 100 μl צלחת נבגים של הדילול 10,000 פי אגר על 2.5% נובל ודגירה במשך 24 שעות ב 25 ° C. לאחר מכן, לבחון שלוש קבוצות אקראיות של 100 נבגים כדי להעריך נביטת אחוזים. שקול conidium מונבט כאשר חיידק צינור גלוי יותר ממחצית הקוטר של פרויקטי conidium ממנו. להשתמש רק בהשעיה כאשר נביטת האחוזים הממוצעת עולה על 90%.

3. התחסנות

1. לחסן צמחים כשהם מגיעים לשלב הראשון שלהם האמיתי העלה (14 ימים בקירוב לאחר שתילה). צמחי מים לאדמה עם קיבולת סטרילי לזקק24 שעתי מי אד לפני חיסונים.
2. לשיטת ריסוס עלים, להשתמש מרסס ידני כדי להחיל השעית הנבגים (טיפול) או 0.1% טריטון X-100 (שליטה) על פני שטח adaxial (העליון) של עלים עד שהם מגיעים רוויה. לכסות את החלק העליון של הסיר בנייר אלומיניום, כדי למנוע ניגר נבגים לאדמה. לאחר הריסוס, כיסוי צמחים בשקית ניילון למשך 24 שעות כדי לשמור על רמה גבוהה של לחות להקל פלישה פטרייתי.
3. לשיטה להציף אדמה, השתמש גליל סיים ליישם 10 מ"ל של השעית נבגים (טיפול) או 0.1% טריטון X-100 (שליטה) על פני השטח של הקרקע בבסיס הצמח.
4. לאחר חיסונים, יחזור צמחים לתאי צמיחת סידורן בעיצוב בלוק שלם אקראי. לא פחות מארבעה בלוקים ניסיוניים נוספים צריכים להיות מותקנים כדי לאפשר הערכות של גידול צמחים, בנוסף להערכות של קולוניזציה endophytic, באותו הניסוי.

4. עיבלuations

1. להעריך את ניסוי בלוק אחד בכל פעם, הבחירה בלוקים בסדר אקראי. הדבר חשוב במיוחד לניסויים גדולים שלא ניתן להעריכם ביום אחד.
2. לפני עיבוד צמח, למדוד ולתעד את שיאו מבסיס לקודקוד meristem. ואז, בזהירות ולעקור שטוף היטב במים זורמים מברז.
3. מכל צמח, מדגם שני עלונים, שתי פיסות השורש ושתי חתיכות של גזע. בחר דגימות כרוז באופן אקראי מהעלה האמיתי הראשון של הצמח. ואז, להשיג שתי דגימות גזע, 3 סנטימטרים כל אחד, ארוך, מאמצע הצמח ומליד פני הקרקע. לבסוף, להשיג שני מדגם שורש, גם 3 סנטימטר באורך כל אחת, מהאמצע ומהשורש 1 סנטימטר מאחורי קצה השורש. מניח את הדגימות בשלוש שקיות נייר נפרדות ותווית מתאימה.
4. לאחר השטיפה ודגימה כל הצמחים בבלוק, להתחיל בעיבוד העלים, אז שורשים, ולבסוף את הגבעולים.
5. משטח לא לעקרסוגיות בברדס זרימה למינרית סטרילי כמו ב1.1, לעיל. יש לשטוף את כל דגימה שלוש פעמים על ידי טבילה במים מזוקקים סטריליים ולתת לו להתייבש בנייר המגבת סטרילית. לאחר מכן, לנתח ולהשליך קצוות החיצוניים שלה, שבו אפשר היה לחסל endophytes תוצאה ממגע עם חומרי חיטוי.
6. חותך את המדגם הגזוז לשישה חלקים, עם ממוצע של מ"מ 6x6 לעלים ול6 מ"מ באורכם גבעולים ושורשים. צלחת השישה הסעיפים על צלחת פטרי 60 מ"מ עם תקשורת מחשבי כף יד והשלמה עם טטרציקלין האנטיביוטיקה, סטרפטומיצין ופניצילין בכל 2 מ"ג / ליטר. לאטום את הצלחת עם parafilm ודגירה בחושך ב 25 ° C. כל צמח המניב 6 צלחות, חלק שני במפעל ל.
7. שנה את מי שטיפה לאחר העיבוד כל בלוק של חלק צמח נתון. לפני השלכת השתמשה במים, שטיפת צלחת מדגם μl 100 בתקשורת ומחשבי כף יד אינקובטורים במשך 10 ימים ב 25 ° C כדי להעריך את הצלחת עיקור. אם צמיחת פטרייה מתפתחת, לא מחשיבים את הדגימות המתאימות לניתוח.
8. בדוק את הצלחות כל 2-3 ימים במשך 20 ימים כדי לצפות ולהקליט צמיחת פטרייה. חלקי צמח בלו והעברה מפגינים נוכחות endophytes פטריות לצלחות המכילות PDA טרי. זה ימנע זיהום של חלקי צמחים השכנים בצלחת המקורית.
9. שיא ב ' צמיחת bassiana מחלקי צמח. Beauveria bassiana ניתן לזהות על ידי mycelia הצפוף האופייני לבן הופך לקרם צהוב בהירה בקצה. במקרה של ספק, לעגן את הדגימה בטיפת מים ולבדוק תחת מיקרוסקופ, מחפש globose נבגים ונבגים בצורה זגזגה, אופייניים למין.
10. השתמש בלוקים ניסיוניים נוספים כדי להעריך את ההשפעה של הטיפולים בביומסה במפעל. ראשית, למדוד את הגובה שלהם מהבסיס לראש meristem הקודקוד. ואז, בזהירות ולעקור צמחים לשטוף במים ברז ולייבש אותו על 45 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים כדי לקבוע המשקל היבש שלהם.

Representative Results

ב bassiana הצליח endophytically-ליישב פ vulgaris בתגובה לטיפולי החיסון הפגין (איור 1). שני תרסיסי foliar ומתיז על הקרקע הביאו להתישבות endophytic ידי B. bassiana במעל 80% מהמפעלים שטופלו (איור 2). עם זאת, היקף ההתישבות תלויה בחלק הצמח העריך ואת שיטת החיסון בשימוש. עלים הגיבו טובים לחיסוני תרסיס. שורשים, לעומת זאת, הגיבו רק לחיסונים מספיגים. לבסוף, גבעולים הגיבו באופן דומה לשני שיטות החיסון. B. bassiana לא זוהה בכל אחד מחלקי צמחי הבקרה.

בלתי תלוי בטיפול, endophytes האחר מאשר B. bassiana גדל מ 15% מסעיפי הצמחים המוערכים, אך הם נותחו יצאו מצלחות תקשורת לפני שהם יכולים לפלוש לחלקים שכנים ולהשפיע על התוצאות.

מתקני טיפול ובקרה היו נבדלו בעליל שבועות לאחר חיסון. שום הבדל לא זוהה במשקל היבש שלהם ובגובה שלהם.

איור 1. נציג תוצאות של טיפולי חיסון על הקולוניזציה endophytic של צמחי שעועית (Phaseolus vulgaris קורות החיים Calima.) על ידי Beauveria bassiana למעלה משמאל:. בקרת צלחות ללא צמיחה. למעלה מימין: endophyte פטרייה מסעיף מפעל מזהם את כל צלחת. למטה משמאל: ב ' bassiana גובר משני חלקי צמח. Endophytic ב: ימני תחתון bassiana נבגים ונבגים כפי שניתן לראות במיקרוסקופ.

איור 2. השפעת הטיפולים על חיסון קולוניזציה endophytic של ביהצמחי n (Phaseolus vulgaris קורות חיים. Calima) על ידי Beauveria bassiana, שבועות לאחר חיסונים עם GHA המתח. קולוניזציה אחוזים מייצגים את מספר חלקי צמח יישבו מחולקים במספר הסעיפים בתרבית.

Discussion

גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה הספציפית של ניסוי להקמת entomopathogen פטרייתי כendophyte. התוצאות שלנו מראות את שיטת החיסון היא אחד מהם. גורמים ביולוגיים לניסוי עם כוללים מיני גידולים או זנים שנבחרו ומתח המינים entomopathogen פטרייתי או לבודד שימוש. גורמים נוספים לשקול מניפולציה כוללים ריכוז של הבידוד, גיל הצמח בחיסונים, ותנאים של גידול הצמחים.

זה יהיה אידיאלי לשיטת חיסון להביא לקולוניזציה צמח המערכתית ידי ^14,17,18,21 entomopathogen פטרייתי. במקום זאת, נראה כי שיטות חיסון נוטות לטובת דפוס מסוים של התישבות מקומית. בקפה, למשל, תרסיסי foliar להעדיף התישבות עלה בעוד מספיג אדמה להעדיף התישבות שורש ^17. אנחנו מצאנו אותו הדפוס בשעועית המשותפת. סופו של דבר, הבחירה של שיטת חיסון צריכה להיותמונחה על ידי המיקום המיועד של endophyte בתוך מפעל, ככל הנראה התאמת הנישה של אוכלי עשב היעד או פתוגן צמח.

למרות זיהוי נפוץ, endophyte וכימות מבוסס על תרבויות תקשורת יכולים להיות יקר, קשים ונוטים שגיאות. לדוגמה, בסך של 10,800 חלקי צמח (מצופה על צלחות פטר 1800) הוערך בניסוי כדי לייעל B. חיסוני bassiana על ¹⁶ בננות. מתוך אלה, 4496 סעיפים היו קולוניה ב משוער bassiana, כפי שזוהה בעיקר על ידי מורפולוגיה מושבה. ברור, אימות מיקרוסקופית של המין אנושי לכל מושבה הייתה צעד רצוי אך להרשות לעצמה. מצד השני, 1176 סעיפים היו מיושבים על ידי פטריות אחרות ונזרקו ומטופל כחסרי נתונים ^16. ההסתברות קיימת, עם זאת, כי ב ' bassiana היה מתחרה גרוע או איטי לגדול, וסופו של דבר היה יכול להופיע מסעיפים אלה, אםמספיק זמן llowed. לכן, שיטות זיהוי endophyte מבוססות על תרבויות תקשורת כפופות לתוצאות חיוביות שגויות ושליליים שווא. בהתאם לכך, הפיתוח של זיהוי אמין יותר ושיטות כימות, למשל אלה המבוססים על תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מבחנים ^20,21,24, מוצדק היטב.

המטרה הסופית של ניסויי חיסון צריכה להיות כדי לפתח טיפול יעיל המספק התנגדות מערכתית עמידה נגד תזונה צמחונית ו / או מחלה. סביר, אבל עדיין לא נבדק, השערה היא כי היקף התישבות endophytic צריך מיתאם חיובי עם המידה של התנגדות endophyte בתיווך. צעד טבעי הבא לאחר זיקוק שיטות חיסון, ולכן, יכול להיות לבחינת המתאם הזה. כמה פרוטוקולי וידאו יכולים לעזור לחוקרים לתכנן assay התנגדות מתאימה למזיקי יעד או פתוגן ^29-31. סופו של דבר, היא זו בדיקה שתקבע את ההצלחה של inoculaשיטת tion, והפוטנציאל הקשורים לבקרה ביולוגית endophytic.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A