Denne protokol viser to inokulering metoder til at indføre den fungale entomopathogen<em> Beauveria bassiana</em> Som en endofyt i den fælles bønne (<em> Phaseolus vulgaris</em>), Som forberedelse til de efterfølgende evalueringer af endophytic biologisk bekæmpelse.
Beauveria bassiana er en fungal entomopathogen med evnen til at kolonisere planter endophytically. Som en endofyt, B. bassiana kan spille en rolle i at beskytte planter fra herbivory og sygdom. Denne protokol viser to inokulering metoder til at etablere B. bassiana endophytically i den fælles bønne (Phaseolus vulgaris), som forberedelse til de efterfølgende evalueringer af endophytic biologisk bekæmpelse. Planter er vokset fra overflade-steriliserede frø i to uger før modtagelsen af en B. bassiana behandling af 10 8 konidier / ml (eller vand) påføres enten som en bladspray eller en jord drench. To uger senere er planterne høstet og deres blade, stilke og rødder udtages at evaluere endophytic svampekolonisering. Til dette prøver individuelt overfladesteriliseret, skåret i flere sektioner, og inkuberet i kartoffeldextroseagar medier i 20 dage. Medierne inspiceres hver 2-3 dage for at observere svampevækst sombundet med dele af anlægget og registrere forekomsten af B. bassiana at estimere omfanget af dens endophytic kolonisering. Analyser af inokulering succes sammenligne forekomsten af B. bassiana inden for en given plante del (dvs. blade, stængler eller rødder) på tværs af behandlinger og kontroller. Ud over den podningsmetode kan det specifikke resultat af forsøget afhænger af mål-afgrødeart eller sort, de fungale entomopathogen arter stamme eller isolat anvendes, og plantens vækstbetingelser.
Fungal entomopathogens er vigtige regulatorer af insektpopulationer med betydeligt potentiale som mycopesticides 1. Først for nylig har imidlertid fungale entomopathogens vist sig at forekomme som endofytter, både naturligt og som respons på forskellige inokulering metoder 2. Den økologiske funktion endophytic svampe entomopathogens stadig stort set ukendt, men nogle undersøgelser har impliceret dem i plantevækst 3,4, planteæder modstand 5-8, og sygdomsresistens 9,10. Det overordnede formål med de metoder, der præsenteres her, er at indføre en svampeinfektion entomopathogen som en endofyt som forberedelse til de efterfølgende evalueringer af endophytic biologisk bekæmpelse.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) er den bedst undersøgte endophytic fungal entomopathogen 5-9,11-19, og det er tilgængeligt som en kommerciel mycopesticide. Inokulering metoder testes for at fastslå <em> B. bassiana som en endofyt omfatter jord drenches 14,17, frø belægninger 18 og immersions 14, kimroden dressinger 13,15, rødder og jordstængler immersions 11,16,18, stængel injektioner 17, bladspraypræparater 14,17,20 og blomster sprays 19. Under anvendelse af disse fremgangsmåder har forskere indført B. bassiana i banan 11, bønne 7, cacao 13, kaffe 17, majs 7, bomuld 7, dato palm 12, jute 21, opiumvalmuer 20, græskar 7, radiata pine 18, sorghum 14, tomat 7 og hvede 7. De seneste oplysninger tyder på, at endophytic B. bassiana har potentiale til at beskytte planter ikke blot leddyrsskadedyr 5-7,22-27, men også fra nogle plantepatogener 9.
Den fælles bønne (Phaseolus vulgaris) rangerer blandt de afgrøder mest sårbare over for skadedyrog sygdomme. Det kan påvirkes af mere end 400 skadedyr og 200 patogener, hvis angreb menes at være den mest begrænsende bean produktionsfaktor i regionerne 28. Følgelig kan det fælles bønne være en fremragende model afgrøde at undersøge det fulde spektrum af endophytic biologisk bekæmpelse af B. bassiana. Som et første skridt i denne retning, beskriver denne artikel bladspraypræparater og jord makrodoser som inokulering metoder til at introducere B.bassiana som en endofyt i den fælles bønne.
Mange faktorer kan påvirke den specifikke resultat af et eksperiment at etablere en svampeinfektion entomopathogen som en endofyt. Vore resultater viser podningsmetode er en af dem. Biologiske faktorer at eksperimentere med bl.a. afgrøden arter eller kultivar valgt og svampe entomopathogen arter stamme eller isolere brugt. Andre faktorer til at overveje at manipulere omfatter koncentrationen af inoculum alder af anlægget i løbet af vaccinationer, og anlæggets vækstbetingelser.
Det ville være ideelt for en podningsmetode at resultere i systemisk plante kolonisering af en fungal entomopathogen 14,17,18,21. I stedet fremgår det, at inokulation fremgangsmåder tendens til at favorisere en bestemt mønster af lokale kolonisering. I kaffe, for eksempel bladspraypræparater favoriserer blad kolonisering henviser jord drenches favoriserer rodkolonisering 17. Vi fandt samme mønster i den fælles bønne. I sidste ende bør valget af podningsmetode værestyret af den påtænkte placering af endofyt i en plante, formentlig matcher niche af målet planteæder eller plantepatogen.
Skønt den almindeligvis anvendes, endofyt påvisning og kvantificering baseret på mediekulturer kan være dyrt, besværligt og risiko for fejl. For eksempel var i alt 10.800 plante sektioner (udpladet på 1800 petriskåle) evalueres i et forsøg på at optimere B. Bassiana vaccinationer på banan 16. Ud af disse blev 4.496 sektioner koloniseret af en formodet B. bassiana, som fastlægges primært af kolonimorfologi. Det er klart, ville en mikroskopisk kontrol af de arter, for hver koloni have været en ønskelig, men ubetalelig skridt. På den anden side, blev 1176 dele koloniseret af andre svampe og blev kasseret, og behandlet som manglende data 16. Sandsynligheden eksisterer imidlertid, at B. bassiana var en fattig konkurrent eller langsommere til at vokse, og kunne have tiden kommet fra disse sektioner, hvis enllowed tilstrækkelig tid. Derfor endofyt detektionsmetoder baseret på mediekulturer er underlagt falske positiver og falske negativer. Følgelig udvikling af mere pålidelig påvisning og kvantificering, for eksempel dem baseret på polymerasekædereaktion (PCR) assays 20,21,24, er velbegrundet.
Det ultimative mål for inokulering eksperimenter bør være at udvikle en effektiv behandling, der giver holdbar systemisk modstand mod herbivory og / eller sygdom. En plausibel, men hidtil uafprøvede, hypotese er, at omfanget af endophytic kolonisering bør korrelere positivt med graden af endofyt-medieret resistens. Et naturligt næste skridt efter raffinering podningen metoder, kunne derfor være at undersøge denne sammenhæng. Flere video-protokoller kan hjælpe forskerne designe en passende modstand analyse for et målparasitten eller patogen 29-31. I sidste ende, er det denne analyse, hvad der vil afgøre succes inokulation metode, og den dermed forbundne potentiale for endophytic biologisk bekæmpelse.
The authors have nothing to disclose.
Produktionen og det eksperimentelle arbejde præsenteret heri afspejler den hengivne og entusiastiske hjælp fra Reynaldo Pareja. Finansieret af Colombias Administrative Institut for Videnskab, Teknologi og Udvikling (Colciencias) og ved et tilskud fra Bill & Melinda Gates Foundation gennem Grand Udfordringer Explorations initiativ.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |