Denne protokollen viser to inokulering metoder for å innføre den sopp entomopathogen<em> Beauveria Bassiana</em> Som en endophyte i felles bønne (<em> Phaseolus vulgaris</em>), Som forberedelse for etterfølgende evaluering av endophytic biologisk kontroll.
Beauveria Bassiana er en sopp entomopathogen med evnen til å kolonisere planter endophytically. Som en endophyte, B. Bassiana kan spille en rolle i å beskytte planter fra herbivory og sykdom. Denne protokollen viser to inokulering metoder for å etablere B. Bassiana endophytically i felles bønne (Phaseolus vulgaris), som forberedelse for etterfølgende evaluering av endophytic biologisk kontroll. Plantene er dyrket fra overflate-steriliserte frø i to uker før du mottar en B. Bassiana behandling av 10 8 conidia / ml (eller vann) brukes enten som en foliar spray eller en jord drench. To uker senere, er plantene høstet og deres blader, stengler og røtter blir samplet å evaluere endophytic sopp kolonisering. For dette, er prøvene individuelt fra overflaten sterilisert, skåret i flere seksjoner, og inkubert i potet dekstrose agar-media i 20 dager. Mediene blir inspisert hver 2-3 dager å observere soppvekst somassosieres med plante seksjoner og registrere forekomst av B. Bassiana å anslå omfanget av dens endophytic kolonisering. Analyser av inokulering suksess sammenligne forekomsten av B. Bassiana innenfor en gitt plante del (dvs. blader, stengler eller røtter) på tvers behandlinger og kontroller. I tillegg til inokulering som benyttes, kan bestemt utfall av eksperimentet avhenge målet beskjære arter eller variasjon, sopp entomopathogen artene påkjenning eller isolere brukt, og plantens vekstforhold.
Fungal entomopatogener er viktige regulatorer av insekt populasjoner med betydelig potensial som mycopesticides en. Bare nylig har imidlertid fungal entomopatogener blitt vist å oppstå som endophytes, både naturlig og i respons til ulike inokulering metoder 2. Den økologiske funksjon endophytic sopp entomopatogener fortsatt i stor grad ukjent, men noen studier har antydet dem i plantevekst 3,4, herbivore motstand 5-8, og sykdomsresistens 9,10. Det overordnede målet for metodene som presenteres her, er å innføre en sopp entomopathogen som endophyte, som forberedelse for etterfølgende evaluering av endophytic biologisk kontroll.
Beauveria Bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) er den mest studerte endophytic sopp entomopathogen 5-9,11-19, og det er tilgjengelig som en kommersiell mycopesticide. Inokulasjon metoder testet for å etablere <em> B. Bassiana som endophyte inkluderer jord drenches 14,17, frø belegg 18 og dykk 14, radicle dressinger 13,15, root og jordstengler dykk 11,16,18, stem 17 injeksjoner, foliar spray 14,17,20 og blomst spray 19. Ved hjelp av disse metodene, har forskere introdusert B. Bassiana inn 11 banan, 7 bønne, 13 cacao, kaffe 17, mais 7, 7 bomull, dato palm 12, jute 21, opiumsvalmuen 20, 7 gresskar, radiata 18 furu, 14 sorghum, 7 tomat og 7 hvete. Nyere bevis tyder på at endophytic B. Bassiana har potensial til å beskytte plantene ikke bare fra leddyr skadedyr 5-7,22-27, men også fra noen plantepatogener 9.
Den felles bønne (Phaseolus vulgaris) rangerer blant de avlinger mest sårbare for skadedyrog sykdommer. Det kan bli påvirket av mer enn 400 skadedyr og 200 patogener, som angrep er antatt å være den mest begrensende bønne produksjonsfaktor på regioner 28. Følgelig kan den felles bønne være en utmerket modell beskjære å undersøke hele spektret av endophytic biologisk kontroll av B. Bassiana. Som et første skritt i denne retningen, beskriver denne artikkelen foliar spray og jord drenches som inokulering metoder for å innføre B.bassiana som endophyte i felles bønne.
Mange faktorer kan påvirke bestemt utfall av et eksperiment for å etablere en sopp entomopathogen som endophyte. Våre resultater viser inokuleringen metoden er en av dem. Biologiske faktorer å eksperimentere med blant annet beskjære arter eller sorten valgt og sopp entomopathogen arter belastning eller isolere brukt. Andre faktorer å vurdere manipulere inkludere konsentrasjonen av inokulum, alder av anlegget under inokulasjoner og plantens vekstforhold.
Det ville være ideelt for en innsprøytning metode for å gi systemisk plante kolonisering av en sopp entomopathogen 14,17,18,21. I stedet viser det seg at inokulering metoder tendens til å favorisere en bestemt mønster av lokale kolonisering. I kaffe, for eksempel foliar sprayer favorisere blad kolonisering mens jord drenches favorisere root kolonisering 17. Vi fant det samme mønsteret i felles bønne. Slutt, bør valget av inokulasjon metoden væreguidet av den bestemte plassering av endophyte innenfor en plante, formodentlig samsvarende nisje av målet herbivore eller plante patogen.
Selv brukte, endophyte deteksjon og kvantifisering basert på media kulturer kan være kostbart, vanskelig og utsatt for feil. For eksempel ble totalt 10 800 plante deler (belagt på 1800 petriskåler) evaluert i et eksperiment for å optimalisere B. Bassiana vaksinasjoner på banan 16. Av disse ble 4496 deler kolonisert av en antatt B. Bassiana, som er identifisert i hovedsak av kolonien morfologi. Åpenbart vil en mikroskopisk verifikasjon av arter for hver koloni er stemt en ønskelig men uoverkommelig trinn. På den annen side, ble 1176 deler kolonisert av andre sopp og ble kastet, og behandlet som manglende data 16. Sannsynligheten eksisterer imidlertid at B. Bassiana var en dårlig konkurrent eller tregere til å vokse, og kunne ha slutt dukket opp fra disse avsnittene hvis enllowed tilstrekkelig tid. Derfor endophyte deteksjonsmetoder basert på media kulturer er underlagt falske positive og falske negative. Følgelig utvikling av mer pålitelig deteksjon og kvantifisering metoder, for eksempel de som er basert på polymerase kjedereaksjon (PCR)-analysene 20,21,24, er godt begrunnet.
Det ultimate målet for inokulering eksperimenter bør være å utvikle en effektiv behandling som gir varig systemisk motstand mot herbivory og / eller sykdom. En plausibel, men som ennå uprøvd, er hypotesen at omfanget av endophytic kolonisering bør relatere positivt med omfanget av endophyte-mediert motstand. Et naturlig neste skritt etter raffinering inokulering metoder, derfor kan være å undersøke denne sammenhengen. Flere video-protokoller kan hjelpe forskerne designe en passende motstand analysen for et mål pest eller patogen 29-31. Til syvende og sist er det denne analysen det som vil avgjøre suksessen av inokulasjon-metoden, og den tilknyttede potensialet for endophytic biologisk kontroll.
The authors have nothing to disclose.
Produksjon og det eksperimentelle arbeidet som presenteres her reflekterer den hengivne og entusiastiske hjelp av Reynaldo Pareja. Finansiert av Colombias Administrasjonsavdelingen of Science, Technology and Innovation (Colciencias) og ved en bevilgning fra Bill & Melinda Gates Foundation gjennom Grand Utfordringer Explorations initiativ.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |