Detta protokoll visar två ympning metoder för att införa svampens entomopathogen<em> Beauveria bassiana</em> Som entofyt i det gemensamma bönor (<em> Phaseolus vulgaris</em>), Som förberedelse för efterföljande utvärderingar av endophytic biologisk kontroll.
Beauveria bassiana är en svamp entomopathogen med förmågan att kolonisera växter endophytically. Som en entofyt, B. Bassiana kan spela en roll för att skydda växter från herbivori och sjukdom. Detta protokoll visar två ympning metoder för att upprätta B. Bassiana endophytically i den gemensamma bönan (Phaseolus vulgaris), som förberedelse för efterföljande utvärderingar av endophytic biologisk kontroll. Växter odlas från ytsteriliserades-frön för två veckor innan de får ett B. Bassiana behandling av 10 8 konidier / ml (eller vatten) appliceras antingen som en bladspray eller en jord indränkning. Två veckor senare är plantorna skördas och deras blad, stjälkar och rötter samplas för att utvärdera endophytic svamp kolonisering. För detta tas prover individuellt ytsteriliserades, skars i flera sektioner och inkuberas i agar potatisdextrosagar media under 20 dagar. Medierna inspekteras varje 2-3 dagar att observera svamptillväxt somförknippade med anläggningsdelar och registrera förekomsten av B. Bassiana att uppskatta omfattningen av dess endophytic kolonisering. Analyser av ympning framgång jämföra förekomsten av B. Bassiana inom en given växtdel (dvs. blad, stjälkar eller rötter) över behandlingar och kontroller. Förutom den inokuleringsmetod, kan den specifika resultatet av experimentet beror på målarter gröda eller sort, de svamp entomopathogen arter stam eller isolera används och anläggningens odlingsförhållanden.
Svamp entomopathogens är viktiga regulatorer av insektspopulationer med stor potential som mycopesticides 1. Först nyligen har emellertid svamp entomopathogens visats förekomma som entofyter, både naturligt och som svar på olika inokulering metoder 2. Den ekologiska funktion endophytic svamp entomopathogens fortfarande till stor del okänd, men vissa studier har inblandade dem i växtligheten 3,4, växtätare motstånd 5-8, och sjukdomsresistens 9,10. Det övergripande målet för de metoder som presenteras här är att införa en svamp entomopathogen som entofyt, som förberedelse för efterföljande utvärderingar av endophytic biologisk kontroll.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Sporsäcksvampar: Hypocreales) är den mest studerade endophytic svamp entomopathogen 5-9,11-19, och det finns som en kommersiell mycopesticide. Inokulering metoder testats för att fastställa <em> B. Bassiana som entofyt inkluderar mark indränkningar 14,17, beläggningar utsäde 18 och nedsänkningar 14, rotanlaget dressingar 13,15, rot och rhizom nedsänkningar 11,16,18, stam injektioner 17, bladsprayer 14,17,20 och blomma sprayer 19. Med användning av dessa metoder har forskare infört B. Bassiana i banan 11, 7 böna, kakao 13, kaffe 17, majs 7, 7 bomull, dadelpalm 12, jute 21, vallmo 20, pumpa 7, radiata tall 18, sorghum 14, tomat 7 och vete 7. Nya rön tyder på att endophytic B. Bassiana har potential att skydda växter inte bara från artropoda skadedjur 5-7,22-27, men också från vissa växtpatogener 9.
Den gemensamma böna (Phaseolus vulgaris) rankas bland grödorna mest utsatta för skadedjuroch sjukdomar. Det kan påverkas av mer än 400 skadedjur och 200 patogener, vars angrepp tros vara den mest begränsande bönor produktionsfaktor i olika regioner 28. Således kan den gemensamma bönan vara en utmärkt modell gröda för att undersöka hela spektrumet av endophytic biologisk kontroll av B. Bassiana. Som ett första steg i denna riktning, beskriver denna artikel bladsprayer och indränkningar jord som ympning metoder för att införa B.bassiana som entofyt i den gemensamma bönan.
Många faktorer kan påverka den specifika resultatet av ett experiment att upprätta en svamp entomopathogen som entofyt. Våra resultat visar att ympningen metoden är en av dem. Biologiska faktorer att experimentera med bland annat grödor eller sort valts och svamp entomopathogen arter stam eller isolat används. Andra faktorer att beakta manipulera inkluderar koncentrationen av inokulatet, åldern på anläggningen under vaccinationer och växtens odlingsförhållanden.
Det skulle vara perfekt för en inokuleringsmetod att resultera i systemisk växt kolonisering av en svamp entomopathogen 14,17,18,21. Istället verkar det som ympning metoder tenderar att gynna ett specifikt mönster av lokala kolonisering. I kaffe, exempelvis bladsprayer gynnar blad kolonisering medan jord indränkningar gynnar rot kolonisering 17. Vi fann samma mönster i den gemensamma bönan. Slutligen bör valet av inokuleringsmetod varavägledas av den avsedda placeringen av entofyt i en växt, förmodligen matchar nisch av målet växtätare eller växtpatogen.
Även vanliga, entofyt detektion och kvantifiering baserad på media kulturer kan vara kostsamt, svårt och felbenägen. Till exempel var totalt 10.800 växter sektioner (stryks ut på 1.800 Petriskålar) utvärderades i ett experiment för att optimera B. Bassiana inokulationer på banan 16. Av dessa var 4.496 sektioner koloniserats av en förmodad B. bassiana, som identifieras huvudsakligen av kolonimorfologi. Uppenbarligen skulle en mikroskopisk kontroll av de arter för varje koloni ha varit en önskvärd men dyr steg. Å andra sidan var 1.176 sektioner koloniserades av andra svampar och kastades och behandlas som uppgifter som saknas 16. Sannolikheten existerar dock att B. Bassiana var en dålig konkurrent eller långsammare att växa, och kunde så småningom fram ur de delar omllowed tillräcklig tid. Därför entofyt detektionsmetoder baserade på media kulturer är föremål för falska positiva och falska negativa. Följaktligen, de som baseras på polymeraskedjereaktion (PCR) analyser 20,21,24, utveckling av mer tillförlitlig detektering och kvantifiering metoder, till exempel väl motiverat.
Det slutgiltiga målet för ympning experiment bör vara att utveckla en effektiv behandling som ger varaktig systemisk resistens mot herbivori och / eller sjukdom. En trolig, men ännu oprövat, är hypotesen att graden av endophytic kolonisering bör korrelera positivt med graden av entofyt-medierad resistens. Ett naturligt nästa steg efter raffinering inokulering metoder därför skulle kunna vara att undersöka detta samband. Flera video-protokoll kan hjälpa forskarna utforma en lämplig resistans analys för ett mål skadedjur eller patogen 29-31. Ytterst är det denna analys vad kommer att avgöra framgången för inokulatning metod, och den tillhörande risken för endophytic biologisk kontroll.
The authors have nothing to disclose.
Produktionen och det experimentella arbetet som presenteras här speglar hängivna och entusiastiska hjälp Reynaldo Pareja. Finansierat av Colombias administrativa avdelningen för vetenskap, teknik och innovation (Colciencias) och ett bidrag från Bill & Melinda Gates Foundation genom Grand Challenges Explorations initiativ.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |