Etablering Fungal entomopatogener som Endophytes: Mot Endophytic biologisk kontroll

Summary

Denne protokollen viser to inokulering metoder for å innføre den sopp entomopathogen

Abstract

Beauveria Bassiana er en sopp entomopathogen med evnen til å kolonisere planter endophytically. Som en endophyte, B. Bassiana kan spille en rolle i å beskytte planter fra herbivory og sykdom. Denne protokollen viser to inokulering metoder for å etablere B. Bassiana endophytically i felles bønne (Phaseolus vulgaris), som forberedelse for etterfølgende evaluering av endophytic biologisk kontroll. Plantene er dyrket fra overflate-steriliserte frø i to uker før du mottar en B. Bassiana behandling av 10 ⁸ conidia / ml (eller vann) brukes enten som en foliar spray eller en jord drench. To uker senere, er plantene høstet og deres blader, stengler og røtter blir samplet å evaluere endophytic sopp kolonisering. For dette, er prøvene individuelt fra overflaten sterilisert, skåret i flere seksjoner, og inkubert i potet dekstrose agar-media i 20 dager. Mediene blir inspisert hver 2-3 dager å observere soppvekst somassosieres med plante seksjoner og registrere forekomst av B. Bassiana å anslå omfanget av dens endophytic kolonisering. Analyser av inokulering suksess sammenligne forekomsten av B. Bassiana innenfor en gitt plante del (dvs. blader, stengler eller røtter) på tvers behandlinger og kontroller. I tillegg til inokulering som benyttes, kan bestemt utfall av eksperimentet avhenge målet beskjære arter eller variasjon, sopp entomopathogen artene påkjenning eller isolere brukt, og plantens vekstforhold.

Introduction

Fungal entomopatogener er viktige regulatorer av insekt populasjoner med betydelig potensial som mycopesticides ^en. Bare nylig har imidlertid fungal entomopatogener blitt vist å oppstå som endophytes, både naturlig og i respons til ulike inokulering metoder ^2. Den økologiske funksjon endophytic sopp entomopatogener fortsatt i stor grad ukjent, men noen studier har antydet dem i plantevekst ^3,4, herbivore motstand ^5-8, og sykdomsresistens ^9,10. Det overordnede målet for metodene som presenteres her, er å innføre en sopp entomopathogen som endophyte, som forberedelse for etterfølgende evaluering av endophytic biologisk kontroll.

Beauveria Bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) er den mest studerte endophytic sopp entomopathogen ^5-9,11-19, og det er tilgjengelig som en kommersiell mycopesticide. Inokulasjon metoder testet for å etablere 14,17, frø belegg ¹⁸ og dykk ^14, radicle dressinger ^13,15, root og jordstengler dykk ^11,16,18, stem ¹⁷ injeksjoner, foliar spray ^14,17,20 og blomst spray ^19. Ved hjelp av disse metodene, har forskere introdusert B. Bassiana inn ¹¹ banan, ⁷ bønne, ¹³ cacao, kaffe ^17, mais ^{7, 7} bomull, dato palm ^12, jute ^21, opiumsvalmuen ^{20, 7} gresskar, radiata ¹⁸ furu, ¹⁴ sorghum, ⁷ tomat og ⁷ hvete. Nyere bevis tyder på at endophytic B. Bassiana har potensial til å beskytte plantene ikke bare fra leddyr skadedyr ^5-7,22-27, men også fra noen plantepatogener ^9.

Den felles bønne (Phaseolus vulgaris) rangerer blant de avlinger mest sårbare for skadedyrog sykdommer. Det kan bli påvirket av mer enn 400 skadedyr og 200 patogener, som angrep er antatt å være den mest begrensende bønne produksjonsfaktor på regioner ^28. Følgelig kan den felles bønne være en utmerket modell beskjære å undersøke hele spektret av endophytic biologisk kontroll av B. Bassiana. Som et første skritt i denne retningen, beskriver denne artikkelen foliar spray og jord drenches som inokulering metoder for å innføre B.bassiana som endophyte i felles bønne.

Protocol

1. Planter

1. Surface-sterilisere bønne frø (valset Calima) ved å dyppe dem i to minutter i 0,5% natriumhypokloritt og to minutter i 70% etanol. Skyll frøene tre ganger i sterilt destillert vann.
2. Evaluere hvor vellykket sterilisering ved plating 100 ul av den siste skyllevannet på potet dextroxe agar (PDA) medier, og inkubering av platen i 10 dager ved 25 ° C. Avslutte og starte eksperimentet hvis noen vekst er sett på plate.
3. Plante frøene i grupper på tre i potter inneholdende en steril blanding av jord og sand på et 2:1 forhold. Overfør pottene i et vekstkammer ved 25 ° C, ca. 50% RH og 12 timer daglengde. En uke etter spiring, eliminere de to minst livskraftige spirer. Vann hver 2-3 dager med sterilt destillert vann og gjødsle 10 og 20 dager etter planting med en 6 g / L vann oppløsning av NPK 15-15-15 gjødsel.

2. Sopp

1. Skaff en kommersieltfinansiell formulering av Beauveria Bassiana stamme GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia).
2. For å generere en enkelt-spore lager kultur, suspendere ca. en podeøse full av conidia i 1 ml av en 0,1% vannoppløsning av Triton-X 100 og virvle i 10 sek. Deretter, plate 100 ul av suspensjonen på 2,5% Noble agar og inkuber i 24 timer ved 25 ° C. Overføre en enkelt spirende conidium i et 100 mm plate som inneholder PDA og vokse til det dekker hele platen (ca. 3-4 uker).
3. Under sterile betingelser, skrape soppveksten fra overflaten av mediet og suspendere den i 10 ml steril 0,1% Triton-X 100. Vortex i ett minutt. Deretter, filtrer suspensjonen gjennom et sterilt cheesecloth å fjerne hyfer og skaffe lager suspensjon.
4. Bruk en hemocytometer å estimere conidial konsentrasjonen av bestanden suspensjon. Å legge til rette conidial teller, utarbeide en 10.000 ganger seriell fortynning av aksjen, hver gang overføre 100 ul of conidial suspensjon i 900 ul av 0,1% Triton-X 100, og virvling i 10 sek før neste fortynning.
5. Å generere inokulatet, juster lager suspensjonen til en endelig konsentrasjon på 10 ⁸ conidia / ml, ved hjelp av formelen:
   
6. Å vurdere conidial levedyktighet, plate 100 ul av den 10 000-dobbel fortynning på 2,5% Noble agar og inkuber i 24 timer ved 25 ° C. Deretter inspisere tre tilfeldige grupper av 100 conidia å beregne prosent spiring. Betrakt et conidium germinated når en synlig bakterie tube lenger enn halvparten av diameteren av de conidium prosjekter fra den. Bare bruke suspensjon når den gjennomsnittlige prosent spiring overstiger 90%.

3. Inokulering

1. Inokuler planter når de nå sin første ekte bladstadiet (ca. 14 dager etter planting). Vannplanter til jord kapasitet med steril destillereed vann 24 timer før vaksinasjoner.
2. For foliar påføringsmetode, bruke en manuell atomizer å påføre conidial suspensjonen (behandling) eller 0,1% Triton-X 100 (kontroll) til adaxial (øvre) overflate av bladene til de når metning. Dekker toppen av potten med aluminiumsfolie for å unngå conidial avrenning til jorda. Etter sprøyting, dekker plantene med en plastpose for 24 timer for å opprettholde et høyt nivå av fuktighet tilrettelegge sopp invasjon.
3. For jordsmonnet drench metode, bruker en gradert sylinder for å anvende 10 ml conidial suspensjon (behandling) eller 0,1% Triton-X 100 (kontroll) til overflaten av jorden ved bunnen av anlegget.
4. Etter vaksinasjoner, returnerer planter til vekstkamre arrangere dem i en randomisert komplett blokk design. Ikke mindre enn fire ytterligere eksperimentelle blokker bør være installert for å tillate evaluering av plantevekst, i tillegg til evaluering av endophytic kolonisering, i det samme eksperimentet.

4. Evalueringer

1. Vurdere eksperiment ett kvartal om gangen, velge blokkene i tilfeldig rekkefølge. Dette er spesielt viktig for store eksperimenter som ikke kan vurderes på en enkelt dag.
2. Før behandlingen av en plante, måle og registrere sin høyde fra bunn til den apikale meristem. Deretter rykke nøye og vask grundig i rennende vann fra springen.
3. Fra hver plante, prøve to ark, to stykker av rot og to stykker av stammen. Velg pakningsvedlegget prøver tilfeldig fra den første virkelige blad av planten. Deretter, få to stilk prøver, 3 cm lang hver, fra midten av anlegget og fra nær jordoverflaten. Endelig få to taproot prøver, også 3 cm lange hver, fra midten av rot og fra 1 cm bak rotspissen. Plasser prøvene på tre separate papirposer og etiketten på riktig måte.
4. Etter vask og prøvetaking alle plantene i en blokk, start ved behandling bladene, så røtter, og til slutt stilkene.
5. Overflaten sterilisere tproblemer i et sterilt laminær hetten som i 1.1, ovenfor. Skyll hver prøve tre ganger ved nedsenkning i sterilt destillert vann og la det tørke i sterilt håndkle papir. Deretter dissekere og kast sine ytterkanter, hvor endophytes kan ha blitt eliminert på grunn av kontakt med desinfeksjonsmidler.
6. Skjær trimmet prøven inn i seks seksjoner, gjennomsnitt 6x6 mm for blader og 6 mm lange for stengler og røtter. Plate de seks deler på en 60 mm petriskål med PDA medier supplert med antibiotika tetracyklin, streptomycin og penicillin ved 2 mg / L hver. Forsegl plate med parafilm og inkuberes i mørke ved 25 ° C. Hver plante gir seks plater, to per plante del.
7. Endre skyllevannet etter bearbeiding hver blokk av en gitt plante del. Før deponering brukt skyllevann, plate en 100 ul prøve på PDA medier og inkuber i 10 dager ved 25 ° C for å vurdere sterilisering suksess. Hvis soppvekst følger, ikke anser de tilsvarende prøver for analyser.
8. Inspisere platene hver 2-3 dager 20 dager for å observere og registrere soppvekst. Avgiftsdirektoratet og overføring plante seksjoner viser tilstedeværelse av sopp endophytes til plater som inneholder fersk PDA. Dette vil unngå forurensning av nabokommunene plante seksjoner i den opprinnelige platen.
9. Record B. Bassiana vekst fra anlegget seksjoner. Beauveria bassiana kan identifiseres ved karakteristiske hvite tett mycelia blir krem til blek gul på kanten. Når du er i tvil, montere prøven i en dråpe vann og inspisere under et mikroskop, på jakt etter globose conidia og sikksakk-formet conidiophores, karakteristisk for arten.
10. Bruk flere eksperimentelle blokker for å evaluere virkningen av behandlinger på anlegget biomasse. Først måle høyden fra bunnen til toppen av den apikale meristem. Så forsiktig uproot og vask planter i vann fra springen og la dem tørke ved 45 ° C i tre dager for å fastslå deres tørrvekt.

Representative Results

B. Bassiana var i stand til å endophytically-kolonisere P. vulgaris i respons til den påviste inokulering behandlinger (figur 1). Både foliar spray og jord drenches resulterte i endophytic kolonisering av B. Bassiana i over 80% av de behandlede planter (figur 2). Imidlertid avhang omfanget av kolonisering på plante del evalueres og inokulasjon metode. Blader reagerte best på spray vaksinasjoner. Røtter, på den annen side, reagerte bare gjennomfukt inokulasjoner. Endelig stammer reagert på samme måte for begge inokulering metoder. B. Bassiana ble ikke påvist i noen av kontrollpunktene plante seksjoner.

Uavhengig av behandling, endophytes andre enn B. Bassiana vokste fra 15% av de evaluerte plante delene, men de ble dissekert ut fra media platene før de kunne invadere nabolandet seksjoner og påvirke resultatene.

Behandling og kontroll plantene var synlig utvisket to uker etter vaksinering. Ingen forskjeller ble funnet i deres tørrvekt og i høyden sin.

Figur 1. Representative resultater av inokulasjon behandlinger på endophytic kolonisering av bønneplanter (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Ved Beauveria bassiana øverst til venstre:. Kontroll plater med ingen vekst. Øverst til høyre: Fungal endophyte fra en plante seksjon forurenser hele platen. Nederst til venstre: B. Bassiana vokser fra to anlegg seksjoner. Nederst til høyre: Endophytic B. Bassiana conidia og conidiophores sett under et mikroskop.

Figur 2. Effekt av inokulering behandlinger på endophytic kolonisering av bean planter (Phaseolus vulgaris cv. Calima) av Beauveria bassiana, to uker etter inoculations med belastningen GHA. Prosent kolonisering representerer antall koloniserte plante seksjoner dividert med antall dyrkede seksjoner.

Discussion

Mange faktorer kan påvirke bestemt utfall av et eksperiment for å etablere en sopp entomopathogen som endophyte. Våre resultater viser inokuleringen metoden er en av dem. Biologiske faktorer å eksperimentere med blant annet beskjære arter eller sorten valgt og sopp entomopathogen arter belastning eller isolere brukt. Andre faktorer å vurdere manipulere inkludere konsentrasjonen av inokulum, alder av anlegget under inokulasjoner og plantens vekstforhold.

Det ville være ideelt for en innsprøytning metode for å gi systemisk plante kolonisering av en sopp entomopathogen ^14,17,18,21. I stedet viser det seg at inokulering metoder tendens til å favorisere en bestemt mønster av lokale kolonisering. I kaffe, for eksempel foliar sprayer favorisere blad kolonisering mens jord drenches favorisere root kolonisering ^17. Vi fant det samme mønsteret i felles bønne. Slutt, bør valget av inokulasjon metoden væreguidet av den bestemte plassering av endophyte innenfor en plante, formodentlig samsvarende nisje av målet herbivore eller plante patogen.

Selv brukte, endophyte deteksjon og kvantifisering basert på media kulturer kan være kostbart, vanskelig og utsatt for feil. For eksempel ble totalt 10 800 plante deler (belagt på 1800 petriskåler) evaluert i et eksperiment for å optimalisere B. Bassiana vaksinasjoner på banan ^16. Av disse ble 4496 deler kolonisert av en antatt B. Bassiana, som er identifisert i hovedsak av kolonien morfologi. Åpenbart vil en mikroskopisk verifikasjon av arter for hver koloni er stemt en ønskelig men uoverkommelig trinn. På den annen side, ble 1176 deler kolonisert av andre sopp og ble kastet, og behandlet som manglende data ^16. Sannsynligheten eksisterer imidlertid at B. Bassiana var en dårlig konkurrent eller tregere til å vokse, og kunne ha slutt dukket opp fra disse avsnittene hvis enllowed tilstrekkelig tid. Derfor endophyte deteksjonsmetoder basert på media kulturer er underlagt falske positive og falske negative. Følgelig utvikling av mer pålitelig deteksjon og kvantifisering metoder, for eksempel de som er basert på polymerase kjedereaksjon (PCR)-analysene ^20,21,24, er godt begrunnet.

Det ultimate målet for inokulering eksperimenter bør være å utvikle en effektiv behandling som gir varig systemisk motstand mot herbivory og / eller sykdom. En plausibel, men som ennå uprøvd, er hypotesen at omfanget av endophytic kolonisering bør relatere positivt med omfanget av endophyte-mediert motstand. Et naturlig neste skritt etter raffinering inokulering metoder, derfor kan være å undersøke denne sammenhengen. Flere video-protokoller kan hjelpe forskerne designe en passende motstand analysen for et mål pest eller patogen ^29-31. Til syvende og sist er det denne analysen det som vil avgjøre suksessen av inokulasjon-metoden, og den tilknyttede potensialet for endophytic biologisk kontroll.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A