Teknikker til at dissekere mekanismerne bag udskillelsen af HIV-1 Nef i exosomes beskrevet. Specifikke korte peptider afledt fra Nef og protein transfektion blev udnyttet til at bestemme strukturen, funktionen og bindingspartnere af Nef s Sekretion Ændring Region. Disse procedurer har generel relevans i mange mekanistiske undersøgelser.
Specifikke korte peptider afledt fra motiver fundet i proteiner i fuld længde, i vores tilfælde HIV-1 Nef, ikke blot bevarer deres biologiske funktion, men kan også kompetitivt at inhibere funktionen af fuldlængde-proteinet. Et sæt af 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyrer i længde med hver overlappende 10 aminosyrer af dets nabo, blev brugt til at identificere motiver i Nef ansvarlig for induktion af apoptose. Peptider indeholdende disse apoptotiske motiver apoptose på niveauer svarende til den fulde længde Nef-protein. En andet peptid, der stammer fra Sekretion Ændring region (SMR) i Nef bevaret evnen til at interagere med cellulære proteiner involveret i Nef s sekretion i exosomer (exNef). Denne SMRwt peptid blev anvendt som "lokkemad" protein i co-immunopræcipitation eksperimenter at isolere cellulære proteiner, der binder specifikt til Nef s SMR motiv. Protein transfektion og antistof hæmning blev anvendt til fysisk at forstyrre vekselvirkningen betlem Nef og Mortalin, en af de isolerede SMR-bindende proteiner, og virkningen blev målt med et fluorescerende-baserede exNef sekretion assay. Den SMRwt peptid evne til at udkonkurrere fuld længde Nef for cellulære proteiner, som binder SMR motiv, gør det til det første hæmmer af exNef sekretion. Således, ved anvendelse af teknikkerne beskrevet her, der udnytter de unikke egenskaber af specifikke korte peptider afledt fra motiver fundet i proteiner i fuld længde, kan man accelerere identifikation af funktionelle motiver i proteiner og udvikling af peptid-baserede inhibitorer af patogene funktioner.
Med fremkomsten af anti-retroviral behandling er aids-epidemien i den vestlige verden er blevet bremset, men ikke indskrænket, og udbredelsen af hiv fortsætter med at være et stort sundhedsmæssigt belastning i hele verden. Med undtagelse af den marginalt effektive RV144 Thai retssag, har HIV-vacciner hidtil vist manglende beskyttelse mod infektion. Således er forskning i yderligere potentielle terapeutiske mål stadig berettiget.
Sammen med CD4 T-celle depletion, er vedvarende generaliseret immunaktivering kendetegnende for HIV-infektion. Denne Kronisk immunaktivering (CIA), fører til stigninger i celle omsætning, aktiverede og differentieret lymfatisk delpopulationer, cellulære udmattelse og ældning, og drabene på T-celler og B-celler via aktivering celledød (AICD) 1,2,3, og det er godt etableret som en af de stærkeste prædiktorer for sygdomsprogression 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Men mekanismerne bag CIA og CD4T-celle depletion ved HIV-infektion er endnu ikke fuldt belyst.
Evidens fra vores laboratorium, og andre førte os til en model for sygdomsprogression (figur 1), hvor HIV-proteinet Nef (Negativ Regulatory Factor) inducerer sin sekretion i exosomes fra HIV-1 inficerede celler 13,14. Disse Nef-holdige exosomer (exNef) inducere apoptose i en række cellelinier, herunder inficerede CD4 T-celler 15,16. Alternativt, i monocytter / makrofager exNef ændrer genekspression mønstre, f.eks cytokinekspression, og synes at inducere en tilstand af uplanlagt immunaktivering. Dette organ bevis antyder en vigtig rolle for exNef i CIA og CD4 T-celle depletion.
Forstå de mekanismer, der ligger til grund Nef evne til at manipulere exosomal trafficking vej vil være nyttige i tekniske hidtil ukendte inhibitorer af exNef sekretion. Inhibering af exNef sekretion vil aftage CD4 T-celle depletionog CIA at drive HIV / AIDS patogenese.
At samle de beviser, der førte til vores model for HIV / AIDS sygdomsprogression og de efterfølgende data, bygget på denne model, har vi udviklet en række nye reagenser og metoder, tilladt os at analysere genetik exNef sekretion, og begynde at bestemme cellulære proteiner involveret. I det indledende arbejde, fandt vi, at Nef-protein inducerer apoptose i bystander celler og frigives ekstracellulært fra Nef-transficerede og HIV-inficerede celler 15. Peptider afledt af SDF-1α (stromacelle Derived Factor-1, med alternativ splejsning alfa) tidligere er blevet vist at bevare meget af den bindende og signalering aktivitet molekyle i fuld længde 17. Vi spekuleret på, at peptider af Nef kunne bevare nogle af den apoptotiske aktivitet af den fulde protein-, og at disse peptider ville nødvendigvis indeholde Nef apoptotiske domæne (r). At identificere disse peptider, og dermed Nefapoptotic domæne (r), opnåede vi et sæt af 20 HIV-1-Nef scanning peptider fra NIH AIDS forskning og referencereagenten Program. Disse 20-aa peptider er hver overlappende 10 aminosyrer af sin nabo, navngivet af antallet af deres sidste aminosyre, dvs N20 spænder Nef aminosyrerne 1-20, N30 spænder Nef aminosyrer 11-30, osv. 16.. Vi fandt at udsætte T-celler ekstracellulært til specifikke peptider overlappende to forskellige 10-aa domæner i fuld længde Nef-protein induceret apoptose i disse celler. Efterfølgende analyse af disse Nef-afledte apoptotiske peptider viste deres evne til fysisk at interagere med chemokinreceptor CXCR4 på overfladen af T-celler, med bindingskinetik der tillod disse peptider til kompetitivt at inhibere binding mellem CXCR4 og dens naturlige ligand SDF-1α. Endelig blev de Nef-afledte apoptotiske peptider interaktion med CXCR4 sig at inducere en stress-respons i disse T-celler, hvilket fører til apoptose. Dette beviser tilladt os at quicKLY map Nef funktionelle domæner, en proces, der ville have taget meget længere tid ved hjælp af standard DNA mutagene teknikker såsom alaninscanningsmutagenese. Det viste også, at disse korte Nef-afledte peptider bibeholdt den biologiske funktion af de apoptotiske domæner i fuld-længde proteinet.
Efter at have identificeret en rolle for ekstracellulær Nef, dvs apoptose af T-celler, søgte vi en bedre forståelse af, hvordan Nef blev udskilt fra cellerne. Anvendelse af en serie af muterede Nef konstruktioner kortlagde vi stærkt konserverede Nef proteinmotiver i de N-terminale regioner af både HIV Nef, og dens Rhesus macaque tilsvarende SIV mac (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, der er kritiske for exNef sekretion 13. En af disse motiver, sekretion Ændring Region (SMR, 66VGFPV70), var særligt kritisk, da alanin udskiftning af nogen af sine fem aminosyrer enten stærkt reduceret eller afskaffet exNef sekretion. Ved levering til celler via Active Motif s Chariot Protein Delivery Reagent, et peptid indeholdende SMR fastgjort til en FLAG peptidsekvens (SMRwt) blev fundet at inhibere exNef sekretion fra både Nef-transficerede og HIV-inficerede celler 18. Baseret på vores tidligere erfaringer med peptider, besluttede vi at bruge dette peptid at belyse molekyler og mekanismerne bag det Nef SMR rolle i exNef sekretion.
Brug af SMRwt peptid som vores "bait protein", vi co-immunofældet cellulære bindende partnere i SMR fra inficerede T-cellelysater 18. FLAG-peptidsekvensen billede en praktisk håndtag til at opfange SMRwt peptid under anvendelse af anti-FLAG affinitetsharpiks. Vores tidligere fund, at en enkelt valin til alanin mutation i SMRwt peptid var tilstrækkelige til at afvikle sin hæmning af exNef sekretion identificeret en bekvem, meget særlige kontrol peptid (SMRmut), som vi brugte til at udelukke co-immunopræcipiterede proteiner ikke specifikke for SMR. Ved hjælp af et peptid med sPECIFIKKE domæne af interesse snarere end fuld-længde proteinet tilladt os at omgå screening af dusinvis af cellulære faktorer, der binder til andre domæner i Nef 19..
Når vi identificeret de SMR-bindende partnere et logisk næste skridt var at vise, at de identificerede cellulære bindende partnere er vigtige for den biologiske funktion 18.. Den normale procedure at opnå dette er at Knockdown protein niveauer ved hjælp målprotein-specifik miRNA eller siRNA, og efterfølgende assay effekt på den biologiske funktion. Vi udførte miRNA knockdown, som hæmmer translation af mål-mRNA'et, hvilket reducerer produktionen af dette mål, i dette tilfælde en SMR-bindende protein. Denne reduktion af målproteinet er en indirekte effekt, og muligvis har en forsinket virkning på den biologiske funktion den tilsigtede protein spiller en rolle i. Derfor har vi også ansat den mindre almindelige antistof hæmning teknik at afgøre, om direkte forstyrre aktiviteten afmålproteinet reducerer eller eliminerer den biologiske funktion. I denne procedure, rejst antistoffer mod målrettet proteinet, transficeres ind i cellen ved hjælp Chariot reagens, og interagere direkte med målproteinet enten sekvestrerende det fra sin hjemmeside af funktion, eller blokere dens relevante bindende domæne. Inhibering af målproteinet gennem denne procedure direkte forstyrrer dens funktion, og kan supplere RNA knockdown procedurer ved yderligere bekræfter betydningen af målproteinet til den biologiske funktion.
Mens Chariot Reagent er effektivt til at levere peptider og proteiner i celler denne proces er tidskrævende og begrænser de typer af eksperimenter, fx langvarig eller gentagen eksponering og in vivo dyreforsøg, der kan udføres. Derfor har vi tilføjet en celle-gennemtrængende peptid (CPP) sekvens med SMRwt peptid (SMRwt-CPP) 18 at generere et peptid, der kunne optages af celler passivtfra kulturmedier. Denne version var lige så effektivt som den førstnævnte inhibering exNef sekretion.
Dataene fra disse publicerede eksperimenter viser evnen hos små peptider indeholdende specifikke funktionelle motiver til at antagonisere funktionen af fuldlængde proteinet gennem kompetitiv inhibering, og at isolere de proteiner, der binder disse motiver. Man ville forvente, at disse teknikker bør være nyttige i mange forsøgsprotokoller. De bør også være effektiv i engineering nye peptidbaserede inhibitorer af mange cellulære processer, en funktion, der kan blive yderligere forstærket af kobling til CPP sekvenser.
Forstå de mekanismer, der ligger til grund Nef evne til at manipulere exosomal trafficking vej vil være nyttige i tekniske hidtil ukendte inhibitorer af exNef sekretion. Hæmning af exNef sekretion bør mindske CD4 T-celle depletion og CIA at drive HIV / AIDS patogenese. Til dette mål, har vi udviklet en række nye reagenser og metoder, tilladt os at analysere genetik exNef sekretion, og begynde at bestemme de cellulære involverede proteiner. Denne fremgangsmåde førte også til udviklingen af den første inh…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finansiering tilskud GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA tilskud F31AI091484, Emory CFAR tilskud P30 A1050409. Denne undersøgelse blev gennemført i et anlæg bygget med støtte fra Research Facilities Improvement Grant # C06 RR18386 fra NIH / NCRR. Jurkat-celler, det sæt af 20 HIV-1-Nef-peptider, såvel som kanin-anti-HIV-1 Nef antiserum blev opnået fra NIH AIDS Research & referencereagens Program (Rockville, MD).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |