Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

На основе пептидов идентификации функциональных мотивов и их партнерами по связыванию

doi: 10.3791/50362 Published: June 30, 2013

Summary

Методы, чтобы рассекать механизмы, лежащие в основе секреции ВИЧ-1 Неф в экзосомах описаны. Конкретные короткие пептиды, полученные из белка Nef и трансфекции были использованы, чтобы определить структуру, функции и связывающих партнеров секреции региона Модификация Nef автора. Эти процедуры имеют общий интерес во многих механистических исследований.

Abstract

Конкретные короткие пептиды, полученные из мотивов, найденных в полноразмерных белков, в данном случае ВИЧ-1 Nef, не только сохраняют свою биологическую функцию, но также может конкурентно ингибируют функцию полноразмерного белка. Набор 20 Nef сканирования пептиды, 20 аминокислот в длину с каждого перекрытие 10 аминокислот его сосед, были использованы для выявления мотивов в Nef, ответственным за его индукции апоптоза. Пептиды, содержащие эти апоптоза мотивы индуцированный апоптоз на уровне, сопоставимом с полной длиной Nef белка. Второй пептид, полученный из области секреции модификации (СМР) из Nef, сохранили способность взаимодействовать с клеточных белков, участвующих в секреции Nef в экзосомы (exNef). Этот пептид SMRwt был использован в качестве "приманки" белок в коиммунопреципитации экспериментов по выделению клеточных белков, которые специфически связываются с SMR мотив Nef в. Ингибирование белка трансфекции и антитело, используемое для физического нарушать взаимодействие ставкуWEEN Nef и mortalin, один из изолированного SMR-связывающих белков, и эффект измеряли с помощью флуоресцентного анализа на основе секреции exNef. Способность пептидов SMRwt к вытеснять полнометражный Nef для клеточных белков, которые связываются SMR мотив, сделать его первым ингибитором секреции exNef. Таким образом, при использовании методов, описанных здесь, в которых используются уникальные свойства конкретного короткие пептиды, полученные из мотивов, найденных в полноразмерных белков, можно ускорить идентификации функциональных мотивов в белках и разработка на основе пептидов ингибиторы патогенных функций.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

С появлением антиретровирусной терапии, эпидемия СПИДа в западном мире было замедлено, но не урезаны, а распространение ВИЧ по-прежнему является основным бременем для здравоохранения во всем мире. За исключением минимально эффективное RV144 испытание Thai, вакцины против ВИЧ до сих пор показано неспособностью защитить от инфекции. Таким образом, исследования по дополнительным, потенциальные терапевтические цели по-прежнему оправдано.

Наряду с CD4 Т-клеток, персистирующая генерализованная активация иммунной системы является отличительной чертой ВИЧ-инфекции. Эта хроническая активация иммунной системы (CIA) приводит к увеличению обновления клеток, активированных и дифференцированные субпопуляциями, сотовая истощение и старение, и убийство Т-клеток и В-клеток с помощью активации индуцированных гибель клеток (AICD) 1,2,3, и она хорошо известна как одна из самых сильных предикторов прогрессирования заболевания 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Тем не менее, механизмы, лежащие ЦРУ и CD4Т-клеток при ВИЧ-инфекции еще предстоит полностью не выяснены.

Данные, полученные в нашей лаборатории и другие привели нас к модели прогрессирования заболевания (рис. 1), где белок ВИЧ Неф (негативный регуляторный фактор) индуцирует его секреции в экзосомах от ВИЧ-1 инфицированных клеток 13,14. Эти Nef содержащих экзосомы (exNef) индуцируют апоптоз в ряде клеточных линий, включая неинфицированные CD4 Т-клеток 15,16. Кроме того, в моноциты / макрофаги exNef изменяет экспрессию генов узоры, например, выражение цитокинов, и, кажется, вызывает состояние иммунной активации незапланированное. Этот данных свидетельствует о важной роли exNef в ЦРУ и CD4 Т-клеток.

Понимание механизмов, лежащих в основе способности Nef, чтобы манипулировать экзосомальных пути торговли будут полезны в технике новых ингибиторов секреции exNef. Ингибирования секреции exNef должна уменьшать CD4 Т-лимфоцитови ЦРУ, что диск с ВИЧ / СПИДом патогенез.

Чтобы собрать доказательства того, что привело к нашей модели по профилактике ВИЧ / СПИД прогрессирования заболевания и последующие данные, которые построены на этой модели, мы разработали ряд новых реагентов и методик, которые позволили нам проанализировать генетику exNef секреции, и начинают определять клеточные белки участвуют. В начальной работы, мы обнаружили, что Nef белок индуцирует апоптоз в клетках наблюдателем и освобождается от внеклеточно Nef-трансфицированных и ВИЧ-инфицированные клетки 15. Пептиды, полученные из SDF-1α (стромальных клеток, полученных Фактор-1, с альтернативными альфа сплайсинг) было показано ранее, сохранить большую часть обязательных и сигнальную активность полноразмерной молекулы 17. Мы предположили, что пептиды Nef может сохранить некоторые апоптотической активности полный белок, и что эти пептиды обязательно содержать Nef апоптоза домена (ов). Чтобы определить эти пептиды, и, следовательно, Нефапоптоза домен (ы), мы получили набор из 20 ВИЧ-1 Неф сканирования пептидов из NIH исследований СПИДа и программы Ссылки реагента. Эти 20-ак пептидов, каждое перекрытие 10 аминокислот его сосед, именуются по числу их последней аминокислоты, то есть N20 пролетов Nef аминокислот 1-20, N30 пролетов Nef аминокислоты 11-30, и т.д. 16. Мы обнаружили, что воздействие на Т-клетки внеклеточного со специфическими пептидами перекрытия двух различных 10-AA доменов в полнометражном Nef белок индуцирует апоптоз в этих клетках. Последующий анализ этих Nef-производных пептидов апоптоза показало их способность физически взаимодействовать с рецептором хемокинов CXCR4 на поверхности Т-клетки, с кинетику связывания, которые позволили эти пептиды конкурентно ингибировать связывание между CXCR4 и его природным лигандом SDF-1α. Наконец, взаимодействие Nef полученных апоптоза пептидов с CXCR4 был найден, чтобы вызвать стрессовую реакцию в этих Т-клеток приводит к апоптозу. Эти данные позволили нам QUICKly карту Неф в функциональных областей; процесс, который был бы гораздо больше времени с использованием стандартных ДНК мутагенных методы, такие как аланин сканирующий мутагенез. Он также показал, что эти короткие Nef-пептидов сохранили биологическую функцию апоптоза доменов в полноразмерного белка.

Выявив роль внеклеточной Неф, т.е. апоптоз Т-клеток, мы стремились лучше понять, как Неф был секретируется клетками. Используя серию мутировал конструкций Неф, мы сопоставили высоко консервативных мотивов Nef белка в N-концевых участков как ВИЧ, так Неф, и его макаки резус эквивалентной SIV Mac ​​(Simian Вирус иммунодефицита) Неф, которые имеют решающее значение для секреции exNef 13. Один из этих мотивов, регион секреции Модификация (СМР; 66VGFPV70), было особенно важным, как аланин замены любого из пяти аминокислот, либо значительно сокращены или отменены exNef секреции. Когда доставлены в клетки с помощью C активность мотиваhariot белка поставки реагента, пептид, содержащий SMR прикреплена к последовательности FLAG пептид (SMRwt) было обнаружено, ингибирует секрецию exNef с обеих Nef-трансфицированных и ВИЧ-инфицированные клетки 18. На основе нашего предыдущего опыта с пептидами, мы решили использовать этот пептид выяснить молекул и механизмов, лежащих в основе роли Nef SMR в секреции exNef.

Использование SMRwt пептида, как наш "приманки белка», мы совместно иммунопреципитировало сотовой связывающих партнеров МСП из неинфицированных Т-клеточных лизатов 18. Последовательность пептида FLAG предоставил удобную ручку для захвата SMRwt пептида с использованием анти-FLAG смоле. Наш предыдущий вывод, что один валин на аланин в пептидной SMRwt было достаточно для его отмене ингибирования секреции exNef определили удобно, весьма специфический контрольный пептид (SMRmut), которые мы использовали, чтобы исключить совместное иммуноосажденного белки не специфичны для SMR. Использование пептид с секpecific область интересов, а не полноразмерного белка позволило нам обойти скрининг десятков клеточных факторов, которые связываются с другими доменами в Неф 19.

Как только мы определили SMR-связывающих партнеров, следующим логическим шагом было показать, что выявленные сотовой связывающие партнеры важны для биологической функции 18. Стандартной процедурой для достижения этой цели является нокдаун белка использованием белок-мишень конкретных микроРНК или миРНК, а впоследствии анализ влияния на биологические функции. Мы провели микроРНК нокдаун, которое ингибирует трансляцию мРНК-мишени, снижение производства этой цели, в данном случае SMR-связывающий белок. Это уменьшение целевого белка косвенное воздействие, и, возможно, имеет задержку влияние на биологическую функцию целевой белок играет роль дюйма Следовательно, мы также использовали менее распространенный метод ингибирование антителами, чтобы определить, непосредственно нарушения деятельностицелевого белка уменьшает или устраняет биологической функции. В этой процедуре антител, полученных против белка-мишени трансфицируют в клетку использованием Колесница реагентов и взаимодействуют непосредственно с белком-мишенью, либо изолирующий его от места его функции или блокирования его соответствующим связывающим доменом. Ингибирование целевого белка через эту процедуру непосредственно нарушает его функции, и могут дополнять процедуры нокдауна РНК дальнейшим что подтверждает важность целевого белка в биологической функции.

В то время как Колесница реагент является эффективным при доставке пептидов и белков в клетки, этот процесс занимает много времени и ограничивает типа экспериментов, например продолжительного или повторяющегося воздействия и в естественных условиях исследования на животных, которые могут быть выполнены. Следовательно, мы добавили клеточной проникающих пептидов (CPP) последовательность SMRwt пептид (SMRwt-CPP) 18, генерируя пептид, который может быть воспринята клеткой пассивноиз культуральной среды. Эта версия была так эффективна, как бывший в подавлении секреции exNef.

Данные, полученные в этих опубликованных экспериментов демонстрируют способность небольшие пептиды, содержащие специфические функциональные мотивы противодействовать функцию полноразмерного белка посредством конкурентного ингибирования, и изолировать белками, которые связывают эти мотивы. Можно было бы ожидать, что эти методы должны быть полезны во многих экспериментальных протоколов. Они также должны быть эффективными в инженерных романа пептидные ингибиторы многих клеточных процессах; функция, которая может быть расширена путем связывания с CPP последовательностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I. Использование коротких пептидов в биологических анализов

I.1. Отображение биологически функциональных мотивы с применением пептидов

  1. Обработка клеток с пептидами Nef сканирования
    1. Закупка набор пептидов сканирование области, представляющей интерес. В наших экспериментах 20mer пептидов, с перекрытием 10 аминокислотных кислота, охватывающих всю ВИЧ-1 Nef белок (205 аа), были получены из программы Реагент СПИДа. Пептиды анализируют индивидуально следующим образом:
    2. Добавить 10 нг / мл пептида к среде для культивирования клеток.
    3. Добавить 10 мл культуральной среды на пластину Jurkat клеточных культурах.
    4. Выдержите культур в течение 24 ч при 37 ° С.
  2. Терминал дезоксинуклеотидилтрансферазы-опосредованной дУТФ биотин Ник Конец маркировки (TUNEL) анализа апоптоза
    1. Мытье клеток с 1X PBS, и исправить в течение 30 мин при комнатной температуре с 4% параформальдегида в 1X PBS, рН 7,4.
    2. Промыть 1X PBS, и проницаемыми с 0,1% Triton X-100 в течение 10мин при комнатной температуре.
    3. Промойте клетки дважды с 1X PBS.
    4. Граф окрашенных клеток по эпифлуоресцентной по компьютерным управлением микроскопии системы.

I.2. Конкурентный анализ ингибирования с применением пептидов

  1. Котрансфекции Пептиды использованием Доставка Колесница Белка Набор реагентов
    1. На трансфекции реакционной смеси, разбавленной 1 мкг wtNef-GFP плазмидной ДНК и 100 нг либо дикого типа пептиды, полученные из области СМР, или пептиды, содержащие аланин-замена отдельных аминокислот в мотиве СМР, до конечного объема 100 мкл 1X PBS.
    2. Развести 6 мкл 1/10 разбавления реагента Колесница до конечного объема 100 мкл стерильной воды, и в сочетании с разбавленной ДНК-пептид смеси.
    3. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы позволить формирование Колесница / ДНК-пептид.
    4. Гранула 3 х 10 5 Jurkat клетки центрифугированием при 600 х г в течение 5 мин.
    5. Вымойте клетки дважды 1X PBS, и ресуспендируйте в колеснице / ДНК-пептидный комплекс.
    6. Добавить 400 мкл бессывороточной среды RPMI 1640 к суспензии и инкубировали клетки в культуре пластин при 37 ° С в течение 2 часов.
    7. Добавляют 1 мл свежей RPMI 1640, содержащей 10% FBS в каждой пластине, и инкубируют клетки в течение 48 ч при 37 ° С.
    8. Урожай клеток и определить эффективность трансфекции методом флуоресцентной микроскопии.
  2. Неф-GFP секреции флуоресцентного анализа ридере пептидных ингибирования
    1. Собирают бесклеточной кондиционированных сред из собранных клеток и передачи 100 мкл в отдельные лунки 96-луночного черного планшета для микротитрования.
    2. Измерение флуоресценции GFP в средствах массовой информации на флуориметра Tecan GENEios с длиной волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 515 нм в относительных единицах флуоресцентные.
    3. Установите уровень флуоресценции GFP в контроле (СМИ из клеток котрансфицировали Неф-GFP и пептид яичницу) На 100%.
    4. Сравните эту уровню флуоресценции GFP в средствах массовой информации от клетки совместно трансфицируют с различными пептидами СМР для определения изменений в Nef-GFP секреции.

I.3. Изоляция Мотив связывающих партнеров с применением пептидов в качестве приманки

  1. Коиммунопреципитации SMR с пептидами
    1. Grow Jurkat клеток в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS при 37 ° С в Т-75 колбу культуры ткани, а осадок клеток путем центрифугирования при 1000 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Определить эффективность трансфекции, путем размещения пластины под флуоресцентным микроскопом, захват изображений, а затем подсчитывают общее и меченых клеток и определить процент меченых клеток.
    2. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл 1X PBS, и передать его на 1,5-мл трубки Эппендорф. Микроцентрифуги при 1000 мкг в течение 1 мин. Ресуспендируют гранул в 1 мл α-FLAG буфера для лизиса, осторожно пипеткой. Лизис буфера: Смешать 50 мМ Трис HCl • рН 7,4, 150 мМ натрия хлфторидов [NaCl], 1 мМ ЭДТА и 1% Тритон Х-100, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида [PMSF] и 10 мкл / мл ингибитора протеазы коктейль для использования с клеткой млекопитающего и тканей экстракты [ПОС; Sigma]. Сделайте непосредственно перед использованием.
    3. Дифференциально микроцентрифужных суспензий при 2000 х г в течение 5 мин и при 13000 х г в течение 10 мин дл осаждени клеточного дебриса и ДНК соответственно. Сбор супернатанта (далее именуемый как "лизата»).
    4. Добавить 1 мг лизата белка и 1 мкг или SMRwt или SMRmut пептида к 20 мкл анти-FLAG M2 Affinity Gel (здесь и далее называемый "смола", Sigma). Заметим, что оба SMRwt и SMRmut используемые здесь, имеют последовательность FLAG тэг, встроенный в пептидами. Доведите смесь до конечного объема 1 мл в Co-IP буфере (α-FLAG лизирующего буфера минус PMSF и PIC). Инкубируют смесь при 4 ° С в течение ночи с донышка на конец вращения. В качестве отрицательного контроля, инкубируют лизат со смолой в отсутствие или пептида.
    5. Pelleт смолы микроцентрифугированием на 5000 - 8000 мкг в течение 30 сек. Разрешить смолы урегулировать в течение 2 минут прежде, чем обращаться образца, и затем аспирата супернатант. Удалить супернатант с узким концом пипетки или шприца Гамильтона, соблюдая осторожность, не передавать никаких смол. Узкий конец наконечники могут быть сделаны с помощью щипцов, чтобы зажать открытие пластиковым наконечником пипетки, пока не будет частично закрыто. Промыть смолу четыре раза 500 мкл промывочного буфера (50 мМ Трис • HCl, рН 7,4 и 150 мМ NaCl). Элюировать связанного клеточных белков с 15 мкг 3X пептида FLAG (Sigma) в 50 мкл промывочного буфера и инкубируют на коромысло / шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре.
    6. Концентрат элюата путем ацетон осадков, с последующим кипячением в Laemmli буфера для образцов (Bio-Rad). Отделить белки в ДСН-ПААГ на 4-20% Трис-HCl Критерий сборного геля (Bio-Rad). Пятно гель кумасси бриллиантовым голубым R-250 (Bio-Rad). Примечание: для массовых экспериментов спектрометрии идентификации (
  2. Коиммунопреципитации с Nef-белка GFP
    1. Смешать 50 мкл Dynabeads Protein G магнитных шариков (Invitrogen) с 2 мкг мышиного моноклонального анти-GFP в 1 мл 1X PBS с 0,02% Tween 20 (PBS-T). Инкубируют в смеси с концом вверх-вниз вращения в 1,5 мл пробирку Эппендорфа в течение 1 ч при 4 ° С.
    2. Отдельные гранулы из буфера путем размещения пробирку на 1,5 мл MagnaSphere Технология Магнитная стойка Разделение (Promega корпорации, Madison, WI), позволяющий магнитного выпадающего последующим удалением надосадочной жидкости. Промыть анти-GFP покрытые гранулы с 1 мл PBS-T использованием осторожно пипеткой.
    3. Lyse Nef-GFP трансфицированных клеток Jurkat с 1 мл RIPA буфере 1X +, осторожно пипеткой и инкубации в течение 15 мВ на льду. RIPA буфере +: 10Х буфера для лизиса RIPA, рН 7,4 [Millipore, Bedford, MA] разбавленный 1:10 в стерильной воде, 0,02% азида натрия [Sigma] и 0,1% додецилсульфата натрия [SDS], с 1 мМ PMSF и 10 мкл / мл ПИК добавляется непосредственно перед использованием.
    4. Гранул клеточного дебриса микроцентрифугированием при 2000 х г в течение 10 мин. Сбор супернатанта (далее именуемый как "лизата»).
    5. Добавить 1 мг лизата белка с анти-GFP покрытые гранулы, довести до конечного объема 1 мл 1X + RIPA буфере и инкубируют смесь с концом вверх-вниз вращение в течение 1 ч при 4 ° С. Примечание: пептид исследования конкуренции, 1 мг лизата белок может быть предварительно инкубируют с 2 мкг SMRwt или SMRmut пептида в 1 мл 1X буфере RIPA +, перед добавлением к анти-GFP покрытые гранулы.
    6. Промыть шарики через ресуспендирования в 1 мл промывочного буфера (50 мМ Трис • HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl и 0,1% Твин 20). Инкубируют с концом вверх-вниз вращение в течение 5 мин при 4 ° C. Отделите бусы дляROM тонким слоем Магнитная стойка разделения. Промыть бусы второй и третий раз промывочным буфера, содержащего 250 мМ и 300 мМ NaCl, соответственно.
    7. Ресуспендируют бисером в 200 мкл PBS, переноса смеси в чистую пробирку, и отдельные шарики из промывных на магнитной подставке. Отварить бусины в 50 мкл буфера для образцов Laemmli 5 мин при 95 ° С, дайте смеси остыть в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем поместить смесь на магнитную подставку для разделения, и собирают супернатант ("элюатах") .
    8. Отделить белки из элюата путем SDS-PAGE с 8-16% Трис-HCl гель Критерий сборных.
  3. Масс-спектрометрия
    1. Акцизный полос белка интереса со Coomassie окрашенных гелей.
    2. Уменьшить образцов в 10 мМ 1,4-дитиотреитола (DTT) в течение 45 мин при 37 ° С.
    3. Алкилата образцов в 55 мМ иодацетамида в течение 45 мин при 25 ° С.
    4. Дайджест образцов в течение ночи при попытке программируемая шкалаpsin (Promega) при 37 ° С.
    5. Обессоливания образца пептидов с C-18 Ziptip (Millipore). Смешайте образец пептидов с ХГС альфа-матрицы (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния), и определить их на целевой кадр MTP III (Bruker Daltonics Инк, Billerica, MA).
    6. Выполните тандеме матрицы-активированной лазерной десорбцией / ионизацией время пролета (MALDI-TOF/TOF) Масс-спектрометрический анализ использования Bruker Daltonics Ultraflex III TOF / TOF.
    7. Сравните MS / MS данных NCBI без избыточности и Swiss-Prot баз данных с использованием алгоритма Талисман ( www.matrixscience.com ).
  4. Иммуноблоттинге
    1. Отдельные образцы белка в ДСН-ПААГ на 4-20% или 8-16% Трис-HCl Критерий сборных гели (Bio-Rad). Передача полосы электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану.
    2. Промойте мембраны в Трис-солевом буфере (TBS, Bio-Rad) в течение 5 мин. Блок с 5% обезжиренным молоком в TTBS (TBS с 0,1% твина 20) в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре.
    3. Процесс мембраны для иммуноблоттинга с использованием конкретного первичного антитела в 5% обезжиренного молока при встряхивании при 4 ° С в течение ночи. Промыть в TTBS в течение 20 мин, а затем вторичной HRP конъюгированного IgG (H + L) антитела у 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте в БВУ в течение 30-60 мин.
    4. Обнаружение полос белка методом вестерн-блоттинга Люминол реагент (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA). Expose фильтр для фотопленки. Примечание: В некоторых экспериментах извлекающего реагента был использован, чтобы лишить мембраны (Pierce, Rockford, IL) с последующей гибридизацией с различными первичными и вторичными антителами.
    5. Сканирование рентгеновских снимков в Adobe Photoshop 5.0.2. Выполнить анализ с использованием денситометрии ImageJ программное обеспечение (Национальные Институты Здоровья, Bethesda, MD).

II. Использование антител торможения в функциональный анализ

II.1. Котрансфекции антителамх годов использованием Доставка Колесница Белка Набор реагентов

  1. На трансфекции реакционной смеси, разбавленной 1 мкг wtNef-GFP плазмидной ДНК и 1 мкг либо анти-mortalin антитело или анти-α-тубулина антителами, до конечного объема 100 мкл 1X PBS. Примечание: Ранее было обнаружено, что котрансфекции анти-α-тубулина антител не оказывает заметного влияния на секрецию exNef, и, таким образом, он служит в качестве эффективного отрицательного контроля в этих экспериментах.
  2. Развести 6 мкл неразбавленного Реагент Колесница до конечного объема 100 мкл стерильной воды, и в сочетании с разбавленной ДНК-антитело смеси.
  3. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы позволить формирование Колесница / ДНК-антитело.
  4. Гранула 3 х 10 5 Jurkat клетки центрифугированием при 600 х г в течение 5 мин.
  5. Вымойте клетки дважды 1X PBS, и ресуспендируйте в колеснице / ДНК-антитело.
  6. Добавить 400 мкл сыворотки RPMI 1640 до приостановления и инкубировать Cлоктей в культуральных планшетах при 37 ° С в течение 2 часов.
  7. Добавляют 1 мл свежей RPMI 1640, содержащей 10% FBS в каждой пластине, и инкубируют клетки в течение 48 ч при 37 ° С.

II.2. Неф-GFP секреции флуоресцентного исследования ридере из антител ингибирования

  1. Собирают бесклеточной кондиционированных сред из собранных клеток и передачи 100 мкл в отдельные лунки 96-луночного черного планшета для микротитрования.
  2. Измерение флуоресценции GFP в средствах массовой информации на флуориметра Tecan GENEios с длиной волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 515 нм в относительных единицах флуоресцентные.
  3. Установить уровень флуоресценции GFP в контроле (носитель из клетки совместно трансфицируют Nef-GFP и анти-α-тубулина антитела), на 100%.
  4. Сравните эту уровню флуоресценции GFP в средствах массовой информации от клетки совместно трансфицируют с анти-mortalin антител для определения изменений в Nef-GFP секреции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Отображение биологически функциональных Мотивы использования пептидов. Два региона были определены на белки Nef, которые индуцируют апоптоз. Пептид управляемой апоптоза наблюдается (рис. 2) с начала пептид N50 (AA30-50), достигая максимума в N60 (AA40-60) и N70 (AA50-70), и уменьшение к фоновому уровню в пептид N100 (aa80-100). Основной мотив 1 (M1) пика, сконцентрировав усилия на AA50-60, индуцирует> 80% от уровня апоптоза полнометражный Nef белка. Второй, меньший апоптоза наблюдается пик охватывает пептиды N180 (aa160-180) и N190 (aa170-190). Это незначительное Мотив 2 (M2) пик, в центре aa170-180, вызывает ~ 30% от уровня апоптоза полнометражных белка Nef 16.

Конкурентный анализ ингибирования использованием пептидов. На рисунке 3, пептидов, содержащих нетронутыми SMR значительно ингибирует секрецию exNef. Это было верно ли мотив был расположен на N-конце (WildtyПЭ-1) или среднего (дикого типа-2) пептида, или был повторен в пептид (дикого типа-3). Кроме того, аланин-замещение любую аминокислоту мотива, независимо от положения мотив или номер в пептиде, аннулирован функцию пептида 18. 11-аминокислотный яичницу версии апоптоза Мотив Nef в 1 (sM1), описанных ранее и 14, полученных из Sigma Genosys, был использован в качестве отрицательного контроля и не оказывает влияния на секрецию exNef. В таблице 1 приведен список пептидных последовательностей.

Изоляция Мотив связывающих партнеров Использование пептидов в качестве приманки. Фиг.4А показывает коиммунопреципитации из четырех белков пептид SMRwt (60, 65, 75 и 250 кДа). Отрицательный контроль SMRmut пептид не захватить эти белки, и эти белки не неспецифически взаимодействуют с сродство смолы в отсутствие пептида, предполагая, что совместное иммунопреципитации белки взаимодействуютименно с SMR мотивы SMRwt пептида. Эти белки были впоследствии определены MALDI-TOF тандемной масс-спектрометрии (см. рисунок 4B для репрезентативной выборки), а также проверяется иммуноблоттинге 18.

Использование антител торможения в функциональном анализе. Ингибирование с анти-антител mortalin полностью отменены exNef секреции (рис. 5). Это подтвердило, что нетронутыми Неф / mortalin необходимости вмешательства для секреции exNef. Кроме того, наводит на мысль о том, что механизм, с помощью которого пептид SMRwt exNef ингибирует секрецию через разрушение этого взаимодействия по прямой конкуренции за mortalin 18.

Таблица 1
Таблица 1. Группа SMR пептиды разработаны и испытаны на предмет их влияния на Nef-индуцированной секреции exNef. Эта вкладкале была впервые опубликована в Шелтон и др.., ОВИ, 2012 18. В предыдущих исследованиях, аланин-замена одной аминокислоты SMR мотив значительно снижается, или отменить, Nef-индуцированную секрецию 18. Вирус, выделенный от одного долгосрочного nonprogressor выразил вариант Nef на изолейцин вместо V66;. Одно из немногих сообщили вариации в высоко-консервативный мотив SMR 20 Нажмите здесь, чтобы увеличить таблицу .

Рисунок 1
Рисунок 1. Воздействие Nef экзосомах на основных типов клеток иммунной. Эта модель отображает exNef выпустили из инфицированных клеток, и он предсказал, воздействие на моноциты и лимфатических клеток, которые привели бы к СПИДупатогенез. AICD, активация индуцированной гибели клеток. I. инфицированной клетки релизы вируса, нормальные экзосомах и exNef. exNef активирует неактивированный, неинфицированных моноцитов (B). Активация моноцитов (С) приводит к изменениям в экспрессии генов приводит к увеличению воспалительных состояний и приводит к активации и истощение CD4 + и CD8 + Т-клеток. II. Зараженные вирусом клетки выбросы, нормальные экзосомы и exNef. exNef активирует неактивированный, неинфицированных лимфоцитов (D). Активированных лимфоцитов (Е) подвергаются экспрессии генов изменения, в результате AICD в результате апоптоза клетки (F). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Peptidэлектронной сканирующей анализ ВИЧ-1 Nef белок для апоптоза мотив (ы). Набор 20mer пептидов, каждый из 10 аминокислотных перекрытия кислота, охватывающих 205 аминокислот белка КНФС Nef, была получена из программы Реагент СПИД и использовали в отображении Nef апоптоза доменов. Эта цифра была впервые опубликована в Хуанг и др.., ОВИ, 2004 13. Y-ось показывает процент клеток, которые помечены TUNEL, а по оси Х обозначает условие обработки. Полный белка Nef [Nef], необработанных клетках [UT], или пептидов, начиная с 20-aa1 [N20], и заканчивая aa190-205 [N205]. Ошибка полосы обозначают стандартной ошибки измерения, и результаты являются компиляцией не менее 3 независимых экспериментов. Пики апоптоза обозначаются Мотив Мотив 1 и 2.

Рисунок 3
Рисунок 3. SMRwt пептид ингибирует exNef. Пептидов, содержащиходного или более дикого типа мотивов Nef SMR последовательность тормозил секрецию exNef, в то время как аланин-замены любого кислота Анимо этой области значительно снижается эффективность пептида. Эта цифра была впервые опубликована в Шелтон и др.., ОВИ, 2012 15. Культуральные среды из Jurkat Т-клеток, совместно трансфецированных Nef-GFP клон и различные пептиды СМР, анализировали на секрецию exNef. Величина измеренной флуоресценции GFP эквивалентен сумме exNef-GFP во внеклеточной среды. Статистическую значимость определяли с помощью непарного т-тест. Влияние на exNef секреции различных пептидов по сравнению с яичницей случайно контрольный пептид (sM1; * значение р <0,05; ** р-значение <0,01; *** р-значение <0,001).

Рисунок 4
Рисунок 4. Пептид SMRwt специфически взаимодействует с белками клетки-хозяина, в том числе мор Талин. (A) Белки из Jurkat Т-клетки совместно иммунопреципитировали либо SMRwt или SMRmut пептидов с использованием анти-FLAG M2 антитела связью смоле. Заметим, что оба SMRwt и SMRmut используемые здесь, имеют последовательность FLAG тэг, встроенный в пептидами. Эта цифра была впервые опубликована в Шелтон и др.., ОВИ, 201215. Эту процедуру повторяют в отсутствии или пептида в качестве контроля для неспецифического взаимодействия с сродство смолы. Окрашенный кумасси голубым гелем изображено отображает белков с молекулярной массой 60, 65, 75 и 250 кДа (стрелки) разобрано SMRwt, которые не были разобрали пептидом SMRmut или нет пептида. (Б) 75-кДа , вырезали из геля, трипсин-переваренной и анализировали с помощью MALDI-TOF тандемной масс-спектрометрии. MS / MS ионный поиска определили 75 кДа, как mortalin. Стрелки обозначают последовательности соответствующего пептидов.large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок

Рисунок 5
Рисунок 5. Mortalin антитело ингибирование блоков экзосома секреции. Внеклеточной культуральной среде с клетками Jurkat, совместно трансфецированных Nef-GFP и клон антитела против либо mortalin или α-тубулина, анализировали на секрецию exNef. По сравнению с эффектом антитела против белка, не участвует в секреции exNef (α-тубулина), нарушение деятельности mortalin путем ее антитело в результате полной отмены секреции exNef. Статистическую значимость определяли по непарного т-тест сравнения exNef секреции в присутствии антитела mortalin по сравнению с α-тубулина антителами (*** значение р <0,001). Эта цифра была впервые опубликована в Шелтон и др.., ОВИ, 2012 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Понимание механизмов, лежащих в основе способности Nef, чтобы манипулировать экзосомальных пути торговли будут полезны в технике новых ингибиторов секреции exNef. Ингибирования секреции exNef должна уменьшать CD4 Т-клеток и ЦРУ, что диск с ВИЧ / СПИДом патогенез. Для достижения этой цели, мы разработали ряд новых реагентов и методик, которые позволили нам проанализировать генетику exNef секреции, и начинают определять клеточные белки участвуют. Этот подход также привело к разработке первого ингибитора нацелены непосредственно exNef секреции, SMRwt пептида.

Основной вывод нашей работы является то, что конкретные короткие пептиды, полученные из мотивов, найденных в полноразмерных белков, в нашем случае ВИЧ-1 Неф, не только сохраняют свою биологическую функцию, но также может конкурентно ингибируют функцию полноразмерного белка. Поскольку эти пептиды сохраняют свою биологическую функцию, они могут быть использованы для идентификации функциональных доменовВ полноразмерного белка. Две вещи, которые необходимы: генерация пептидов, которые сканируют белка, представляющего интерес, либо по всей длине или области белка, как полагают, содержат функциональный домен и анализа для тестирования биологической функции, о котором идет речь. Поскольку отсутствует информация, что позволило бы сузить поиск апоптоз-индуцирующей мотивов в конкретных регионах Nef, мы использовали набор пептидов сканирование всей ее длине. Хотя этот процесс был сделан проще, относительно небольшой размер Nef, мы также применили этот подход к большим (> 75 кДа) белков. Хорошо установленным дл оценки апоптоз (TUNEL) был использован для идентификации пептидов, сохраняя интерес биологическую функцию, в данном случае, Nef-индуцированный апоптоз клеток CD4 Т-клеток. Интересно, что последующий анализ в оригинальной работе показали, что выявленные апоптоза пептиды сохранил> 80% биологической активности полнометражный Nef белка и конкурентный механизм ингибирования связывания CXCR4его природным лигандом SDF-1α.

Кроме того, короткий пептид, содержащий SMR мотив Nef сохранил свою биологическую способность взаимодействовать с клеточных белков, участвующих в секреции exNef. Тем не менее, в данном случае сохранение активности не привело к мимикрии функции Nef, как это было в случае с индукцией апоптоза, но вместо того, чтобы привели торможения. Поскольку пептид SMRwt эффективно связаны SMR-сайтов связывания этих клеточных белков, он нарушен их взаимодействие с Nef, а следовательно, предотвратить выделение Nef в экзосомы. Как Nef мотив интереса было известно из предыдущих генетических исследований отображение, мы смогли ограничить развитие пептида к вариациям SMR. Вместо выявления новых функциональных мотивов, мы использовали эти пептиды и ранее разработанных на основе флуоресценции анализа для измерения exNef секреции, чтобы продемонстрировать, что роль МСП в секреции exNef была напрямую связана с его конкретной первичной последовательности.

ВИЧ-1, Человек взаимодействия с базой данных белков насчитывает более 60 клеточных белков, которые взаимодействуют непосредственно с Неф и, возможно, больше, чем 200, которые взаимодействуют прямо или косвенно 19. Ограничивая последовательность нашей приманки белка к мотиву интереса, мы избежали того, чтобы разобраться в десятки белков, которые были бы совместно иммунопреципитировало на полнометражный Nef белка. Большинство из этих белков, в то время как специфичных для Nef, не будет партнеры для связывания SMR Nef, а, таким образом, представляют собой фона / шум. Консервативный расчет, что мы снизили шум 15x (60/4). По сути, наш подход эффективно увеличить отношение сигнал / шум за счет минимизации фона, обусловленного пределами площадки, или в нашем случае не совсем мотив связывания, что позволяет нам IDEntify белки, которые специфически связываются SMR. Тем не менее, возможно, что с помощью этого метода, мы не смогли охватить все SMR-связывающий клеточных белков, в частности те, которые требуют взаимодействия как с СМР и второй мотив связывать Nef, или те, связывание которого зависит от вторичных или третичной структуры.

Mortalin, клеточный белок со-иммунопреципитации пептидом SMRwt, было показано, что требуется для секреции exNef по нокдаун микроРНК и ингибирование антителами. Первая из них является устоявшейся техники, которая уменьшает или устраняет выражение белка-мишени. Напротив, ингибирование антителами не влияет на уровень экспрессии белка, но вместо физически ингибирует взаимодействие белка-мишени с другими белками. Мы использовали этот второй метод, чтобы продемонстрировать важность Nef-mortalin взаимодействия для секреции exNef. Антитело ингибирование прямым процедура, которая требует способ введения антителавнутрь клетки и анализа на тестирование его влияние на биологическую функцию, о котором идет речь. Мы использовали Доставка Колесница Белки Реагент курсировать анти-mortalin антител в клетки, и вышеупомянутые флуоресцентного анализа на основе измерить изменения в секреции exNef. Как и большинство антител основе процедур, эффективность антител ингибирование ограничено сродство и специфичность антитела к целевой белок.

Основная цель исследования ВИЧ является развитие новых терапевтических средств и выявление потенциальной мишенью для терапии. Процедуры, описанные здесь конкретные рычаги короткие пептиды, которые сохраняют свою биологическую функцию и может конкурентно ингибируют функции полноразмерных белков, чтобы ускорить этот процесс. Хотя описанные эксперименты были направлены на понимание функциональной клавиши ВИЧ, методы, используемые должны быть применимы к изучению белок-белковых взаимодействий и развитие на основе пептидовИнгибиторы в нескольких областях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH / NIGMS / MBRS (грант 58268), NIH / NCRR / RCMI (грант G12-RR03034), Грузия исследований Альянс грантов GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA грант F31AI091484, Эмори CFAR грант P30 A1050409. Это исследование было проведено в объекта, построенного при поддержке исследовательских установок Улучшение грант № C06 RR18386 от NIH / NCRR. Jurkat клетки, набор 20 ВИЧ-1 Nef пептидов, а также кроличьих анти-ВИЧ-1 Nef антисыворотки были получены из NIH исследований СПИДа и программы ссылочные реагенты, (Rockville, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16, (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3, (1), 60 (2006).
  4. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90, (3), 376-382 (1992).
  5. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6, (8), 904-912 (1993).
  6. Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, (8), 827-834 (1996).
  7. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16, (2), 83-92 (1997).
  8. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
  9. Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, (6), 819-831 (2010).
  10. Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79, (8), 4877-4885 (2005).
  11. Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116, (6), 1514-1524 (2006).
  12. Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180, (1), 350-360 (2008).
  13. Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26, (2), 173-192 (2010).
  14. Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27, (2), 167-178 (2011).
  15. James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78, (6), 3099-3109 (2004).
  16. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78, (20), 11084-11096 (2004).
  17. Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8, (7), 369-376 (1998).
  18. Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86, (1), 406-419 (2012).
  19. Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24, (12), 1497-1502 (2008).
  20. Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67, (8), 4639-4650 (1993).
На основе пептидов идентификации функциональных мотивов и их партнерами по связыванию
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).More

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter