Summary
हम एक उपन्यास का वर्णन
Abstract
हम सफलतापूर्वक एकीकृत पहले intracranially ऊतक संरचना में परिवर्तन का सीधा लंबी अवधि के दृश्य के लिए अनुमति देता है कि एक उपन्यास प्लेटफार्म विकसित करने intravital साथ 2 फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी Intracranial खिड़की (ICW) प्रौद्योगिकी 1-4 की स्थापना की है. एक वास्तविक समय फैशन में एक एकल कोशिका प्रस्ताव पर इमेजिंग ऊतक की 'तस्वीर शॉट' पार वर्गों में पूरी तरह लग रहा है जो मानक अंत बिंदु ऊतकीय विश्लेषण द्वारा प्रदान परे है कि अनुपूरक गतिशील जानकारी प्रदान करता है.
फ्लोरोसेंट काइमेरिक चूहों में इस intravital इमेजिंग तकनीक की स्थापना, हम एक साथ छवि चार फ्लोरोसेंट चैनलों करने में सक्षम हैं. ऐसी GFP के रूप + अस्थि मज्जा शामिल fluorescently लेबल कोशिकाओं, के द्वारा, यह ऊतक के भीतर अपने लंबी अवधि के प्रवास, एकीकरण और भेदभाव का अध्ययन कर इन कोशिकाओं के भाग्य को ट्रैक करने के लिए संभव है. इस तरह के एक mCherry तंत्रिकाबंधार्बुद ट्यूमर पंक्ति के रूप में एक माध्यमिक संवाददाता सेल, के आगे एकीकरण के चरित्र के लिए अनुमति देता हैसेल बातचीत: सेल की terization. ऊतक microenvironment में संरचनात्मक परिवर्तन उदाहरण CD31 टैग एंटीबॉडी और Dextran अणुओं के लिए, अंतर महत्वपूर्ण रंगों और एंटीबॉडी के अलावा के माध्यम से प्रकाश डाला जा सकता है.
इसके अलावा, हम आयनीकरण विकिरण के प्रशासन के बाद होती है कि गतिशील ऊतक परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है, जिसके माध्यम से एक मंच बनाने, stereotactic विकिरण प्रदान करता है कि एक छोटे पशु सूक्ष्म irradiator साथ हमारे ICW इमेजिंग मॉडल के संयोजन का वर्णन है.
हमारे मॉडल की वर्तमान सीमाओं मस्तिष्क के पृष्ठीय अक्ष के लिए इमेजिंग सीमित, उप cortical सतह से 900 मीटर तक की गहराई तक सीमित है जो माइक्रोस्कोप, के अंतर्वेधन शामिल हैं. खोपड़ी की हड्डी की उपस्थिति वर्तमान में स्तन ऊतक और वसा पैड 5-7 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया और अधिक स्थापित और उपयोग चैम्बर मॉडल की तुलना में, ICW एक अधिक चुनौतीपूर्ण तकनीकी प्रक्रिया बनाता है. इसके अलावा, ICW provइडस कई चुनौतियों इमेजिंग जब अनुकूलन.
Introduction
विभिन्न विकृतियों के जवाब में मस्तिष्क में उठता है कि संरचनात्मक और जैविक परिवर्तन, और उपचारात्मक उपायों की एक बेहतर समझ उपचार रणनीतियों में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, विशेष रूप से इंट्राक्रेनियल विकृतियों के बारे में, इन संरचनात्मक और जैविक परिवर्तनों का अध्ययन करने में वर्तमान चुनौतियों में से एक, ऊतक की पहुंच और अस्थायी विकास और इन विवो सेटिंग में एक में परिवर्तन की गतिशील प्रगति का अध्ययन करने की अक्षमता है. "खिड़की" प्रौद्योगिकी की पीढ़ी पहले 5-7 ट्यूमर के विकास के माध्यम से नरम ऊतक परिवर्तन की जांच करने में सफल साबित हुआ है. ICW मॉडल का विकास और अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों में संक्रमण भड़का को नुकसान पहुँचाए बिना खोपड़ी की हड्डी को दूर करने की आवश्यकता के कारण साबित होता है. पिछला कागजात उच्च संकल्प स्पष्ट IM के निर्माण करने के लिए, लेकिन ऊतक 8-10 कल्पना करने के लिए खोपड़ी पतली करने का प्रयास किया हैखोपड़ी की हड्डी की उम्र पूर्ण हटाने 11 की आवश्यकता है. लंबे समय तक इमेजिंग (30 दिन) हाल ही में इमेजिंग 1,11 के माध्यम से एक व्यवहार्य विकल्प बन गया है दोहराएँ, पहले से कम समय फ्रेम 5 अध्ययन किया गया है.
पिछले एक दशक में एक प्रमुख लक्ष्य ट्यूमर के इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्य प्रदान करने, ट्यूमर गठन और प्रगति के जवाब में विशेष रूप से, नव वाहिका निम्नलिखित रोग उत्तेजनाओं के मूल स्पष्ट करने के लिए किया गया है. काफी विवाद ट्यूमर के विकास या निम्न विकिरण के दौरान मस्तिष्क में नई वाहिका संरचना के स्रोत के आसपास बनी हुई है. परंपरागत रूप से vascularization angiogenesis, नए बर्तन पहले से मौजूद जहाजों 12 के अंकुरण से जो फार्म से एक प्रक्रिया के माध्यम से होती माना गया है. हाल के अध्ययनों तथापि, vasculogenesis के पहले ग्रहण भ्रूण प्रक्रिया रोग वाहिका संरचना के गठन में एक अधिक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा हो सकता है. Vasculogenesis बदले में फिर सीधे नए पोत अन्तःचूचुक 12-14 के गठन में शामिल हैं जो अस्थि मज्जा से वयस्क रक्तकोरक समकक्षों की भर्ती शामिल है. सबूत जमते endothelial कोशिकाओं अग्रदूत oncogenic मध्यस्थों 15-17 के जवाब में नए सिरे से वाहिनियों के गठन आरंभ करने के लिए अस्थि मज्जा से जुटाए जाते हैं जो इंगित करता है. हालांकि, इन अध्ययनों रोग प्रोत्साहन और उपचार 18-21 के जवाब के प्रकार के साथ बदलती प्रतिशत योगदान के साथ पोत अन्तःचूचुक को इन अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रत्यक्ष योगदान (BMDCs) के लिए विरोधाभासी सबूत प्रदान करते हैं.
इसलिए, ट्यूमर vasculature में और उपचार के लिए प्रतिक्रिया में BMDC एकीकरण की प्रक्रिया के दोहराया लंबे समय तक अध्ययन के लिए उच्च संकल्प intravital इमेजिंग की अनुमति है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक विधियों की स्थापना अमूल्य है. स्टैंडर्ड ऊतकीय तकनीक गतिशील सूचनाओं उपलब्ध कराने में विफलसूचना neovasculature को जन्म दे सकता है और इसलिए निश्चित सेल बातचीत के तंत्र को प्रदर्शित नहीं कर सकते हैं कि कोशिकाओं के लंबे समय तक जीवित रहने, भेदभाव और एकीकरण निर्धारित करने की आवश्यकता है.
हम इंट्राक्रेनियल विकिरण और ट्यूमर के विकास को दोनों का पालन BMDC भर्ती का एक अलग डिग्री है, लेकिन है कि एक भर्ती, विकृति विशिष्ट साइट और नहीं पूरे इंट्राक्रेनियल ऊतक 11,22 के एक आक्रमण है कि वहाँ हमारे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर दिखाया है. हम भर्ती एक भी पशु 11,22 के दोहराया इमेजिंग द्वारा प्रदर्शन एक संवेदनशील समय स्वरूप इस प्रकार है कि पता चला है. Fluorescently टैग ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे अपनी ही अन्तःचूचुक लिए फार्म का ट्यूमर सेल transdifferentiation की संभावना को उजागर करने के लिए endothelial कोशिकाओं के लिए एक अंतर महत्वपूर्ण CD31 एंटीबॉडी के साथ imaged और लगाया जा सकता है जिससे इसी तरह, vivo इमेजिंग में भी ट्यूमर सेल अनुकरण में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
हमारे मॉडल की अनुकूलन क्षमता है, साथ ही ऊपर उल्लेख सेल सेल बातचीत को प्रदर्शित करने के लिए, हम दवा सेल बातचीत का अध्ययन करने में सक्षम है. हम AMD3100, एक एसडीएफ -1 अवरोध करनेवाला, और BMDC भर्ती 11 में शामिल नेटवर्क संकेतन में अपनी भूमिका की तरह दवा अवरोधकों पर ध्यान दिया है. इसी तरह हम आनुवंशिक रूप से एक GFP अणु को एक IRES के माध्यम से संयोजन के रूप में VEGFTrap, एक VEGF अवरोध 25, व्यक्त करने के लिए U87 तंत्रिकाबंधार्बुद xenografts कोशिकाओं को बाहर इंजीनियर है. आरएफपी + बी.एम. का उपयोग करके हम VEGF के vasculature को BMDCs की भर्ती पर है भूमिका का अध्ययन करने में सक्षम हैं. सबसे हाल ही में हम mec को देख दवा कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए मॉडल का उपयोग किया हैएक सेलुलर स्तर पर ट्यूमर वर्णन दवा Fluorescein 26, पीछे hanism. के उपयोग के माध्यम से एक कस्टम का निर्माण हम उपचार के लिए ट्यूमर और BMDCs दोनों की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए स्टीरियोटैक्टिक वितरित विकिरण को एकीकृत करने में सक्षम है घर छोटे जानवर irradiator में.
हमारे उपन्यास intravital इमेजिंग विधि शोधकर्ताओं के उपयोग के माध्यम से ऊतक परिवर्तन के कई कार्यात्मक और जैविक विशेषताओं की व्याख्या सहायता, विभिन्न विकृतियों और प्रणालियों में पाए जाते हैं कि एकल कक्ष वास्तविक समय परिवर्तन में जानकारी हासिल करेंगे.
Protocol
सभी पशु काम एक जानवर की देखभाल के अंतर्गत किया जाता है और उपयोग समिति सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के अनुपालन में प्रोटोकॉल को मंजूरी दी और मार डाला गया है.
समस्या निवारण के संदर्भ तालिका 2 के लिए.
1. अस्थि मज्जा पुनर्गठन (वैकल्पिक) चित्रा 1 (30 मिनट प्रस्तुत करने का, माउस प्रति 5 मिनट)
सभी सर्जरी autoclaved बाँझ उपकरणों के साथ सख्त सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए.
एक दाता माउस पुनर्गठित तीन मेजबान चूहों होगा.
- Gammacell 40 'अनुचित' irradiator के केंद्र के अंदर, सिर ढाल बढ़त के साथ बेहोश करना प्राप्तकर्ता NODscid चूहों और स्थिति,.
- 2.5 Gy के कुल शरीर विकिरण (TBI) के साथ NODscid चूहों चमकाना.
महत्वपूर्ण कदम: TBI के अनुकूलन के कारण पर्याप्त मेजबान प्रतिरक्षा CE के लिए आवश्यक खुराक में बदलाव करने की जरूरत हो सकती हैविभिन्न माउस उपभेदों में करूँगा कमी.
रोकें बिंदु: मेजबान चूहों अग्रिम में विकिरणित किया जा सकता है लेकिन irradiating के 24 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए.
- संस्थागत पशु की देखभाल समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार दाता चूहों euthanize. Hindlimbs साफ और हड्डियों (आंकड़े 1ai, 1aii) से सभी अतिरिक्त ऊतक अलग करना, दोनों से टिबिया और फीमर हटा दें.
महत्वपूर्ण कदम: अनुजंघास्थिक हड्डियों बहुत संकीर्ण लुमेन के कारण इस्तेमाल के लिए व्यवहार्य नहीं हैं.
- चार निकाली हड्डियों के दोनों सिरों से अंत प्लेटें निकालें और वे उपस्थिति (चित्रा 1aiii) में सफेद होते हैं जब तक एक 22 जी सुई और 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस का प्रयोग कर उन्हें बाहर फ्लश. संदर्भ तालिका 2.
- अच्छी तरह से निकाले अस्थि मज्जा (बीएम) निलंबन मिक्स और तीन 27 जी टुबरकुलीन सुइयों में 300 μl आकर्षित. निकाले बी.एम. लगभग 2 x 10 7 कोशिकाओं होते हैं और चाहिए3 मेजबान चूहों reconstitutions के लिए पर्याप्त है. संदर्भ तालिका 2.
- 1.1 कदम (चित्रा 1 बी) से तीन पहले से विकिरणित NODscid चूहों के पार्श्व पूंछ नस में निलंबन इंजेक्षन. संदर्भ तालिका 2.
चेतावनी: बी.एम. के बाँझपन जांच करने के लिए हम संक्रमण के लिए जाँच करने के लिए 24 घंटे के लिए शेष बी.एम. और संस्कृति चढ़ाना की सिफारिश इंजेक्शन. इस बिंदु पर मौत का प्रमुख कारण नव पुनर्गठन चूहों में संक्रमण है.
2. Intracranial विंडो पीढ़ी - चित्रा 2 (माउस प्रति 30 मिनट)
सभी सर्जरी (2A चित्रा) जानवरों को गर्म रखने के लिए autoclaved बाँझ उपकरणों के साथ और एक गर्मी दीपक के तहत सख्त सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए.
- IACUC अनुमोदित संवेदनाहारी, 0.5 पर Avertin आईपी इंजेक्शन से बेहोश करना प्राप्तकर्ता NODscid चूहों सिर ढाल बढ़त के साथ मिलीग्राम / छ और स्थिति, के केंद्र के अंदरGammacell 40 'अनुचित' irradiator. खोपड़ी से बालों को हटा दें. इसके अलावा कॉर्निया निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंसू जेल लागू होते हैं.
- तब Betadine समाधान और शराब के साथ साथ पहली स्वच्छ खोपड़ी, तो बस आँखों से ऊपर के लिए कान के मध्य से एक चीरा बनाने. खोपड़ी और खोपड़ी की सतह के स्थलों (चित्रा 2Bi) उजागर खोपड़ी 3 मिमी या तो पहले चीरा के पक्ष निकालें.
- 2% lidocaine के इंजेक्शन लगाने के द्वारा periosteum तरक्की: एपिनेफ्रीन समाधान और खोपड़ी की सतह (चित्रा 2Bii) से दूर काटना.
- 2.7 मिमी trephine ड्रिल का प्रयोग, लैम्ब्डा और शीर्षस्थान के बीच सही गोलार्द्ध के प्रांतस्था पर खोपड़ी के एक 2.7 मिमी चक्र कमजोर. ड्रिल (चित्रा 2Biii) के साथ हड्डी घुसना नहीं है. संदर्भ तालिका 2.
महत्वपूर्ण कदम: ड्रिल खोपड़ी के माध्यम से चला जाता है तो मस्तिष्क की सतह अतिरिक्त टीआरए के साथ प्रभावित करने परिणामों क्षतिग्रस्त हो जाएगाउमा. इसके अलावा अत्यधिक रक्तस्राव उत्पन्न किया जा रहा से एक स्पष्ट खिड़की रोकने घटित होगा.
- विच्छेदन चिमटी और दंत हुक और जानबूझकर लेकिन नियंत्रित बल (चित्रा 2Biii) का उपयोग कमजोर हड्डी फ्लैप निकालें.
- ट्यूमर विकृति को देख (वैकल्पिक), तो 2.5 कदम में उत्पन्न खिड़की के केंद्र में चुना ट्यूमर सेल लाइनों (फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन के साथ) इंजेक्षन.
- एक stereotactic फ्रेम में सेल निलंबन और लोड सुई के साथ 10 μl 30 जी हैमिल्टन सिरिंज लोड.
महत्वपूर्ण कदम: सेल संख्या अपेक्षित विकास का उपयोग करें और समय में ट्यूमर कोशिकाओं के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी. U87 संस्कृतियों के लिए हम माउस प्रति 10 μl में 2 x 10 5 कोशिकाओं का उपयोग करें. - डिजिटल स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर माउस लोड उत्पन्न खिड़की के केंद्र बिंदु के लिए सुई संरेखित.
- यह सिर्फ cortical सतह को छूता है और डिजिटल निर्देशांक रीसेट लोअर सुई जब तक.
- निम्नएर cortical ऊतक में 3.2 मिमी सुई और गहरी 3 मिमी में इंजेक्षन.
- सुई वापस लेना धीरे फिर फ्रेम से माउस को हटा दें.
महत्वपूर्ण कदम: 1 मिनट की अवधि पर समाधान इंजेक्षन और वापस कम प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए स्थिति का पालन इंजेक्शन में सुई छोड़ दें.
महत्वपूर्ण कदम: नाबालिग ख़ून का बहाव का सामना करना पड़ा है, तो सतही रक्तस्राव को रोकने के लिए 1-5 मिनट के लिए बाँझ खारा के साथ सिंचाई. बाद के चरणों के साथ आगे बढ़ें.
- एक stereotactic फ्रेम में सेल निलंबन और लोड सुई के साथ 10 μl 30 जी हैमिल्टन सिरिंज लोड.
- मस्तिष्क के ऊतकों सिंचित रखने के लिए बाँझ पीबीएस की एक बूंद के साथ मस्तिष्क की सतह गीला हो जाना.
- उत्पन्न 2.7 मिमी खिड़की के आसपास पूरी तरह से सील करने के लिए मस्तिष्क की सतह पर एक 3 मिमी coverslip फ्लोट. संदर्भ तालिका 2.
- सूखी आसपास खोपड़ी फिर खोपड़ी की हड्डी और जगह में coverslip को reseal खोपड़ी के ऊतकों को पूरे उजागर खोपड़ी को Vetbond लागू हड्डी. यह कांच के तहत रिसाव और इमेजिंग क्षमता में कमी होगी के रूप में एक अतिरिक्त के लिए लागू नहीं है.
- एम आईएक्स ताजा दंत एक्रिलिक पाउडर और समाधान, लगभग 30% (w / वी), और Vetbond के शीर्ष पर लागू होते हैं. एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा गिलास coverslip किनारे (चित्रा 2Biv) पर ऐक्रेलिक ओवरलैप. संदर्भ तालिका 2.
चेतावनी: डेंटल हम दस्ताने और प्रक्रियाओं भर मुखौटा के उपयोग की सलाह देते हैं तो ऐक्रेलिक अत्यंत खतरनाक है.
महत्वपूर्ण कदम: चिकित्सकीय एक्रिलिक एक अच्छा सील सुनिश्चित करने और अधिक कम करने के लिए ढलाई के दौरान लचीला रहने की जरूरत है. खिड़की पर एक्रिलिक के निर्माण छवियों धब्बा होगा.
- चूहों एक गर्म पिंजरे में ठीक करने के लिए अनुमति दें.
3. Stereotactic विकिरण (वैकल्पिक) - 3 चित्र (माउस प्रति 25 मिनट)
विविधताओं का इस्तेमाल किया और के रूप में इस तरह के अनुकूलन की आवश्यकता होगी अलग irradiators में मौजूद होगा. हम एक कस्टम डिजाइन irradiator इस्तेमाल किया.
- चूहों बेहोश करना0.5-1 लीटर 2 हे एक मिनट, और stereotactic irradiator अंदर कस्टम सिर restrainer पर जगह (चित्रा 3Ai) के साथ प्रक्रिया के दौरान 1.5-2% द्वारा पीछा शामिल होने के लिए 4% पर Isoflurane का उपयोग कर.
- एक्स - रे ट्यूब एक 2 मिमी एल्यूमीनियम फिल्टर के माध्यम से 40 केवीपी और 0.05 मा पर चलने के साथ एक 360 डिग्री के कोन बीम सीटी स्कैन प्राप्त करते हैं. यह पृष्ठीय वेंट्रल दिशा में केंद्रीय है यह सुनिश्चित करने के दाएँ गोलार्द्ध को विकिरण isocentre निर्देशन, मंच के आंदोलन का मार्गदर्शन करने के लिए छवि का उपयोग करें.
- Hemispheric संधानक, 8 मिमी x 11 मिमी ब्लॉक सम्मिलित करें.
महत्वपूर्ण कदम: collimators कई अलग अलग व्यवस्था के लिए तैयार किया जा सकता है और इसलिए मस्तिष्क के विभिन्न हिस्सों में शामिल और बाहर करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. 8 मिमी x 11 मिमी मस्तिष्क के एक hemispheric क्षेत्र को परिभाषित करता है.
- आगे मस्तिष्क, Anat की नियुक्ति को बढ़ाने के लिए संधानक के माध्यम से ऊपर (एपी) और नीचे (पीए) से दोनों एकल सीटी ओर्थोगोनल चित्र प्राप्तomical हड्डी संरचनाओं reproducibility के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- विनिमय एक 0.93 एमएम तांबा उपचार के लिए एल्यूमीनियम फिल्टर फिल्टर और एक्स - रे ट्यूब एक एपी दिशा में ऊपर से 225 केवीपी और 13 मा पर चलने के साथ वांछित विकिरण खुराक का आधा प्रशासन.
- नीचे की स्थिति को गैन्ट्री लौटें और एक्स - रे ट्यूब 225 केवीपी और 13 मा फार्म एक पीए दिशा में निचले स्थान पर चल रहा है के साथ फिर से विकिरण खुराक की दूसरी छमाही प्रशासन.
महत्वपूर्ण कदम: यह ऊपर और मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से आर टी ढाल कम करने के लिए नीचे दोनों से प्रकाशित करना आवश्यक है, यह भी मस्तिष्क के केंद्र के लिए isocentre के संरेखण के साथ एड्स.
4 विवो में दो फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोपी -. चित्रा 3 (प्रति सत्र 1-3 घंटा)
विविधताओं का इस्तेमाल किया और के रूप में इस तरह के अनुकूलन की आवश्यकता होगी अलग सूक्ष्मदर्शी में मौजूद होगा. हम एक कार्ल Zeiss LSM510 मेटा लेजर स्कैनिंग Confoc इस्तेमाल कियाअल माइक्रोस्कोप.
- IACUC अनुमोदित संवेदनाहारी, शराब स्प्रे का उपयोग कर 0.5 मिलीग्राम / छ और साफ खिड़की पर Avertin आईपी इंजेक्शन के साथ चूहों बेहोश करना.
- (वैकल्पिक) इमेजिंग के लिए पहले पूंछ नस में इमेजिंग के लिए पहले टैग किया संवहनी डाई 5-10 मिनट, इंजेक्षन. Alexa647-Dextran 0.35 ग्राम 0.2 ग्राम / जी पर इस्तेमाल किया / जी या APC-CD31 पर इस्तेमाल किया. तालिका 2 देखें.
- (वैकल्पिक) ट्यूमर चित्रित करना, इमेजिंग के लिए पहले 7.7 मिलीग्राम / किलोग्राम, 5 मिनट की एक खुराक पर पूंछ नस के माध्यम से Fluorescein इंजेक्षन. संदर्भ तालिका 2.
- उत्पन्न कैमेरिक माउस में इस्तेमाल fluorochrome द्वारा निर्धारित confocal खुर्दबीन पर सेटअप चैनलों. तालिका 1 इस मॉडल में वर्णित चैनलों को दर्शाता है.
- जंगम खुर्दबीन मंच पर माउस पलटना और moldable प्लास्टिसिन. (चित्रा 3Aii) संदर्भ तालिका 2 के साथ स्थिति में सिर को स्थिर.
- पहला चैनल लेजर पर मुड़ें और ICW के केंद्र में स्थित करने के लिए उपयोग करें.
- 5x लेंस का प्रयोग करें और आगे उच्च संकल्प छवियों के लिए एक नक्शे के रूप में उपयोग करने के लिए पूरे खिड़की की एक छवि ले.
- इमेजिंग सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता लाने के लिए 10X और 20X 'लंबी दूरी की' लेंस का उपयोग किया जाना चाहिए.
महत्वपूर्ण कदम: 2PLM पर चैनल और उद्देश्यों को वे सही fluorochrome उजागर सुनिश्चित करने के लिए पहले murine मॉडल की इमेजिंग के लिए इन विट्रो में इंजीनियर कोशिकाओं का उपयोग कर स्थापित किया जाना चाहिए.
| Fluorochrome | पाकिस्तानी | GFP / Fluorescein / FITC | mCherry / आरएफपी / dsRed | एपीसी / अलexa647 | एसएचजी Autofluorescence |
| उत्तेजना लेजर | 458 एनएम | 488 एनएम | 543 एनएम | 633 एनएम | गिरगिट लेजर 820 एनएम |
| संग्रह फ़िल्टर | 480-520 एनएम | 500-550 एनएम | 565-615 एनएम | 650-710 एनएम | 390-465 एनएम |
तालिका 1. उपयोगकर्ता के लिए fluorochrome सेटअप. गाइड्स मॉडल में उपलब्ध चैनलों में से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल उत्तेजना लेजर और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा कलेक्टर को देखने के लिए.
Representative Results
NODscid चूहों के बी.एम. पुनर्गठन के वैकल्पिक कदम NODscid 'मेजबान' चूहों की 100% में फ्लोरोसेंट 'दाता' बी एम की एक 80% तेज में परिणाम चाहिए, TBI के तथापि अनुकूलन अन्य गैर में पुनर्गठन को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो जाएगा -immunocompromsed उपभेदों. चूहों असफल पुनर्गठन कर रहे हैं तो वे बीमार हो और प्रक्रिया के बाद तेजी से मर जाएगा, कमजोर चूहों अतिरिक्त भोजन और पानी के स्रोतों की आवश्यकता हो सकती.
एक बार समाप्त ICW चित्रा 2Biv में देखा कि तरह दिखना चाहिए. यह इस खोपड़ी के साथ शामिल होने के लिए ताकत देता है के रूप में कांच coverslip आसपास एक्रिलिक से एक रिज करने के लिए आदर्श है. परफेक्ट खिड़कियों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और उनकी पीढ़ी (चित्रा -2) के बाद 8 सप्ताह तक के लिए दोहराया इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं. इन इष्टतम खिड़कियों के माध्यम से उत्पादित छवियाँ चित्रा 3Bi में देखा उन लोगों के रूप में दिखेगा. खिड़की पीढ़ी में खामियों गरीब की छवियों का उत्पादन होगाउदाहरण के लिए गुणवत्ता, खिड़की के तहत हवाई बुलबुले imaged किया जा रहा देखने के पूरे क्षेत्रों को रोकने जाएगा, क्षेत्रों हवा लेजर इमेजिंग (चित्रा 3Bii) रोकता है. अंधेरा दिखाई देगा coverslip पर अतिरिक्त गोंद और एक्रिलिक के साथ पृष्ठभूमि की एक उच्च स्तर हो जाएगा प्रतिदीप्ति और गंदगी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की खिड़की छोटे डॉट्स पर है इसी तरह अगर, चित्रा 3Biii में देखा के रूप में बाहर blotted किया जा रहा है क्षेत्र के क्षेत्रों क्षेत्र (चित्रा 3Biv) में दिखाई जाएगी.
ICW इमेजिंग की सफलता सर्जिकल तकनीक की अखंडता द्वारा पूर्व निर्धारित है, फिर भी, यहां तक कि इष्टतम ICWs इमेजिंग सत्र के दौरान समस्याओं का सामना कर सकते हैं. जैसे, स्पष्टता की एक सीमा है और डिग्री के रूप में 3 चित्र में देखा जनित छवियों में मौजूद है. सब कुछ इष्टतम है जब चित्रा -3 सी में चित्रित प्रकाशन गुणवत्ता छवि होती है. यह सभी चूहों के लिए संभव नहीं है, यह छवि के 80% की उम्मीद करना संभव हैइस तरह देखने के लिए उत्पन्न. वर्तमान माइक्रोस्कोपी सेटअप में बड़ी खामियों में से एक औंधा लेसरों का उपयोग है. चूहे इमेजिंग के दौरान सांस लेने अस्वाभाविक को जन्म दे सकती है कि अत्यधिक तनाव और बेचैनी में उनकी पीठ और इस परिणाम पर तैनात किया जाना है. साँस लेने में होता है कि औसत के साथ हस्तक्षेप के रूप में यह एक 'लाइन' छवि का उत्पादन इमेजिंग के दौरान, जिससे प्रत्येक पिक्सेल पंक्ति में चार बार और चार की औसत अंतिम छवि में प्रदर्शित होता है imaged है. साँस लेने के रूप में चित्रा 3 डी में देखा छवि पर एक लाइन के रूप में प्रकट होता है कि एक artifact बनाएगा अस्वाभाविक द्वारा इस तरह के रूप में है कि औसतन, के दौरान किसी भी आंदोलन का कारण बना. इमेजिंग के दौरान अपर्याप्त anaesthetized हैं कि चूहे भी इस समस्या का सामना कर सकते हैं. 'लाइन' पर प्रभाव के लिए औसत छवि को सीमित करके कम किया जा सकता है, लेकिन इस में छवि गुणवत्ता कम हो जाएगा और समस्या को खत्म नहीं हो सकता है. वैकल्पिक रूप से चूहों repositioned या सांस लेने सामान्यीकृत गया है जब से प्रयास किया जा सकता है. उपयोग ओचूहों 'प्रवण स्थिति में' imaged किया जा सकता है के रूप में च एक ईमानदार 2PLM इस समस्या को नकारना होगा. एक औंधा 2PLM पर इमेजिंग के साथ एक अतिरिक्त समस्या माउस माइक्रोस्कोप पर है, और इस चित्रा 3E में देखा उन लोगों की तरह 'खंडित' छवियों की ओर जाता है एक बार ICW स्थिति के लिए सीमित पहुँच भी शामिल है. यहाँ लेजर और coverslip एक दूसरे से सीधा तैनात है और इस तरह इमेजिंग एक कोण पर होता है के रूप में नहीं कर रहे हैं. देखने के क्षेत्र के पक्षों imaged नहीं कर रहे हैं, जहां एक 'खंडित' छवि की पीढ़ी में यह परिणाम है. समस्या को आसानी से coverslip के रूप में चित्रा 3Aii में देखा माउंट सिर पर एक बार पूरी तरह से क्षैतिज है यह सुनिश्चित करने के लिए माउस के repositioning के साथ हल है.
makin - मॉडल विशेष रूप से ट्यूमर के ऊतक के vascularization में BMDCs की भूमिका की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक साथ तीन अलग अलग चैनलों के उपयोग करने की क्षमता (Alexa647 और एपीसी चेरी, GFP, सुदूर लाल) को दर्शाता था यहाँ प्रस्तुतजी इस विशेष कहानी के लिए पाकिस्तानी और एसएचजी बेमानी. हम खिड़की की वजह से कोई हानिकारक प्रभाव के साथ, एक एकल कोशिका के स्तर पर वाहिका में बी.एम. कोशिकाओं की भर्ती और एकीकरण का अध्ययन, ऊपर 8 सप्ताह के लिए अनुलंबीय छवि चूहों में सक्षम थे. इस मॉडल स्रोत और वाहिका संरचना के गठन और पहले से अंत बिंदु ऊतकीय विश्लेषण के माध्यम से खो ब्याज की विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की बातचीत पर गतिशील जानकारी इकट्ठा करने में आसानी दर्शाता है.
| कदम | समस्या | तर्क | समाधान |
| 1.4 | चकनाचूर अस्थि | ब्लंट उपकरण | तेज कैंची या ताजा स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर एक ताजा माउस फार्म अस्थि मज्जा लीजिए, हड्डी के टुकड़े टीवी इंजेक्शन रोकना होगा |
| 1.5 | कम निकासी (कम viscositवाई) | अस्थि endplates भी distally कटौती, गरीब संग्रह विधि | हड्डी के रूप में proximally के रूप में संभव कटौती और वापस छप रोकने के लिए संग्रह ट्यूब के अंदर की हड्डी के साथ एकत्र होना चाहिए समय ज़्यादा से ज़्यादा और देखभाल के साथ बी.एम. निकालने के लिए खर्च किया जाना चाहिए 1 मिलीलीटर में आवश्यक पूल एक से अधिक माउस हैं |
| उच्च निष्कर्षण (उच्च चिपचिपापन) | कम संग्रह बफर | , अतिरिक्त 0.1% BSA के साथ समाधान पतला माउस अधिकतम प्रति 500 μl को तीन प्राप्तकर्ता चूहों के लिए अलग हो जाते हैं | |
| 1.6 | बुरा नसों में इंजेक्शन | गरीब vasodilation और पोत दृश्यता | गर्मी दीपक के साथ फैलाव बढ़ाएँ. उपयोग के लिए सहायता करने के लिए प्रकाश स्रोत में बनाया के साथ पूंछ नस restrainer में जगह माउस |
| 1 | बीमार चूहे | संक्रमण | संस्था के नियमों के अनुसार चूहों बलिदान. पूंछ से पहले इंजेक्शन को साफ कर रहे हैं सुनिश्चित करें और बाँझपन की जांचसंस्कृति में निकाले बी.एम. की |
| चूहे मर | गरीब बी.एम. तेज | मृत चूहे के फ्लोरोसेंट बी.एम. तेज% की जाँच करें. इस्तेमाल किया जा रहा चूहों के तनाव के लिए TBI का अनुकूलन बी.एम. इंजेक्शन (उदाहरण के दो प्राप्तकर्ताओं के लिए उपयोग एक दाता माउस) की राशि में वृद्धि | |
| 2.4 | माइनर ख़ून का बहाव | ड्यूरा ड्रिलिंग के दौरान उल्लंघन | जेल पैड के साथ दबाव और और निरंतर बाँझ खारा धोने |
| मेजर ख़ून का बहाव | ब्रेन ड्रिलिंग द्वारा क्षतिग्रस्त | संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार माउस बलिदान | |
| 2.8 | Coverslip के तहत एयर बुलबुले | Cortical सतह के साथ गरीब संपर्क उचित स्थान रोकता | Coverslip निकालें और बुलबुले को दूर करने के लिए खिड़की पर coverslip के लिए नाव की अतिरिक्त पीबीएस जोड़ने |
| 2.10 | Gluing के दौरान coverslip के slippage | Acrylic जन coverslip पर दबाव डाल, भारी है और जिस तरह की coverslip के बाहर कदम | Vetbond और एक्रिलिक लागू किया जाता है, जबकि चिमटी coverslip के नीचे पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए |
| 4.2 | बुरा नसों में इंजेक्शन | गरीब vasodilation और पोत दृश्यता | गर्मी दीपक के साथ फैलाव बढ़ाएँ. उपयोग के लिए सहायता करने के लिए प्रकाश स्रोत में बनाया के साथ पूंछ नस restrainer में जगह माउस |
| 4.4 चित्रा -3 सी | 'लाइन' छवियों | अस्वाभाविक या अनियमित साँस लेने | फ्रेम से माउस निकालें और ठीक करने की अनुमति संवेदनाहारी प्रशासित का स्तर बढ़ाने के लिए और गर्दन सुनिश्चित करने के लिए स्थिति को समायोजित पीढ़ी flexed या साँस लेने को रोकने के लिए लागू नहीं है |
| चित्रा -3 सी | 'खंडों' छवि | ब्रेन उद्देश्यों के समानांतर नहीं है | यह फ्लैट है सुनिश्चित करने के लिए coverslip की स्थिति को समायोजित करें |
| पोत कल्पना नहीं | इंजेक्शन intravascularly नहीं देखा | अच्छा वाहिकाप्रसरण सुनिश्चित करने के लिए वैकल्पिक पूंछ नस, गर्म पूंछ में इंजेक्शन फिर से करें | |
| उच्च पृष्ठभूमि | गंदा coverslip, एयर बुलबुले, एक्रिलिक | नम 70% इथेनॉल के कपड़े के साथ coverslip साफ कर लें, एक्रिलिक तहत घुसना सकता है के रूप में लेना और मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान नहीं है |
तालिका 2. समस्या निवारण. प्रक्रियाओं के समस्याग्रस्त क्षेत्रों के लिए आवश्यक सुधारात्मक कदम के लिए एक दिशानिर्देश.
स्कीमेता 1. प्रायोगिक प्रवाह आरेख. इस प्रयोगात्मक कदम 1-4 के माध्यम से घटनाओं के समय को दर्शाता है. माउस मॉडल के लिए, एक सप्ताह से अधिक सेटअप कर रहे हैंट्यूमर ग्राफ्ट सुनिश्चित करने के लिए ट्यूमर के दिन 7. जब तक बी.एम. ठीक reconstitutes, और नशीली दवाओं के साथ इलाज नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 1. बी.एम. पुनर्गठन. (ए) बी.एम. निष्कर्षण प्रक्रिया पिछले अंग हड्डियों की मैं. विच्छेदन. हिंद अंग से द्वितीय. Dissected फीमर और टिबिया, साफ और निकासी के लिए तैयार है. Iii. हड्डियों अंत थाली के साथ सफेद उपस्थिति का प्रदर्शन है, के माध्यम से हटा दिया है और प्लावित खाली हड्डियों की. (बी) के इंजेक्शन के लिए पार्श्व नसों पूंछ में तैनात हैं जहां स्कीमेता का प्रदर्शन है.
चित्रा 2. ICW पीढ़ी. (ए) की सिफारिश की सड़न रोकनेवाला सेटअप (बी) मैं. उजागर खोपड़ी सतह सर्जरी के लिए आवश्यक स्थलों का पता चलता है, ICW पर्वबिन्दु और lamda से समान दूरी सही गोलार्द्ध पर तैनात किया जाना चाहिए. द्वितीय. Periostieum हटाने के लिए तैयार है, lidocaine के समाधान के साथ उठाया . ग. ड्रिल के साथ उत्पन्न हड्डी टुकड़ा को हटाने के लिए आवश्यक चिकित्सकीय हुक. iv. दंत ऐक्रेलिक साथ ICW समाप्त. (सी) के तीन उदाहरण खिड़कियों विधि के reproducibility प्रदर्शित करता है.
चित्रा 3. 2PLM प्रत्याशित परिणाम. सभी छवियों हरी बी.एम. लाल, ट्यूमर, ब्लू (छद्म रंग का अब तक लाल) वाहिका दिखा. (ए) मैं. छोटे जानवर irradiator अंदर isoflurane के प्रवाह को बरकरार रखे हुए है, जो सिर फ्रेम दर्शाता है. 8 x 11 मिमी संधानक भी में गैन्ट्री. द्वितीय. माउस के माध्यम से चारों ओर घूम रहा है देखा जा सकता है इमेजिंग के लिए आवश्यक सिर फ्रेम में तैनात उलटा, moldable plastercine सभी खिड़कियों को शामिल किया जा सकता है. समस्याओं के परिणामों का (बी) भावप्रदर्शक तस्वीरें मैं से खिड़की पीढ़ी के साथ. एक इष्टतम खिड़की, द्वितीय. coverslip और चार से अधिक ग ऐक्रेलिक बहाव, नीचे फंस हवाई बुलबुले के साथ एक खिड़की. खिड़की पर ही गंदगी. (सी) एक ICW मैं का सफल पीढ़ी का पालन इमेजिंग के साथ होने वाली समस्याओं पर प्रकाश डाला गया. इष्टतम इमेजिंग द्वितीय . साँस लेने कलाकृतियोंबनाने के एक 'लाइन' छवि स. coverslip के लेजर एक 'खंडित' छवि उत्पन्न करने के लिए सीधा नहीं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
4 चित्रा. कार्यात्मक उपयोग करता है और मॉडल के रूपांतरों. GFP छवि सफेद में अन्य तीन चैनलों overlayed किया जा सकता है कि सच पाकिस्तानी छवि प्रकट करने के लिए पाकिस्तानी छवि से घटाया जाता है जिससे (ए) पाकिस्तानी पोस्ट इमेजिंग प्रसंस्करण. ग्रीन बी.एम., लाल ट्यूमर, व्हाइट सीएससी, ब्लू (छद्म रंग का अब तक लाल) वाहिका (बी) के स्वसहायता समूहों के साथ imaged किया जा सकता है कि कोलेजन फाइबर के प्रदर्शन. ग्रीन Dextran, लाल बी.एम., सियान कोलेजन (सी) मैं. vitr में VEGFTrap कोशिकाओंVEGFtrap. द्वितीय के साथ उत्पादन GFP संकेत प्रदर्शित ओ. में vivo इमेजिंग स्पष्ट रूप से VEGFtrap कोशिकाओं को दर्शाता है और इसके अलावा में आप देख रहे हैं प्रणाली प्रदर्शित करने के लिए चैनल स्विचन में आसानी पर प्रकाश डाला गया. ग्रीन VEGFTRap + ट्यूमर, लाल बी.एम., नीला (रंग का छद्म अब तक लाल) वाहिका. (डी) ट्यूमर के स्ट्रोमा में Fluorescein का संग्रह दर्शाता है और न कोशिकाओं में सीधे, लाल ट्यूमर के साथ हरी झंडी ओवरले की कमी से दिखाया गया है. ग्रीन Fluorescein, लाल ट्यूमर. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
सभी छवियों में वर्णित तीन चैनलों को अब तक एक कई प्रकार की कोशिकाओं और बातचीत देखने के लिए उपकरणों की एक अमूल्य सेट के साथ अन्य मॉडल और पत्तियों शोधकर्ताओं में ब्याज की तीन मार्करों के लिए विनिमय करने योग्य हैं. योजना सभी मार्करों और सेल प्रकार सफलतापूर्वक एक अलग चैनल में एक संवाददाता प्रतिदीप्ति अणु एकीकृत है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है.
यहां इस्तेमाल मानक तीन चैनलों के अलावा हम भी एक चौथे पाकिस्तानी चैनल (चित्रा -4 ए) और एक एसएचजी आधारित कोलेजन चैनल 7 (चित्रा 4 बी) एकीकृत कर रहे थे. यह vivo में और इसके अलावा में सेलुलर बातचीत में देख की संभावना फैली अनुमति देता है उपयोगकर्ता अन्य मार्करों के लिए दो चैनलों को बनाए रखना है, जबकि विशिष्ट सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के मिश्रण आबादी का कार्य करने के लिए. उदाहरण के लिए, हम अपने intratum की तुलना में एक ब्याज के साथ 01:03 के अनुपात में ट्यूमर कोशिकाओं (आरएफपी) और कैंसर स्टेम कोशिकाओं (पाकिस्तानी) पर ध्यान दिया हैमौखिक बातचीत (चित्रा -4 ए). हम मिश्रित आबादी के 7 दिनों के बाद आरोपण के अनुपात को सही ठहराया गया था और दोनों सेल आबादी अभी भी देखा जा सकता है कि मनाया.
पाकिस्तानी चैनल + कोशिकाओं वास्तव + GFP हैं कि उन लोगों से सच पाकिस्तानी परिभाषित करने के लिए पोस्ट इमेजिंग प्रसंस्करण की आवश्यकता उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा दोनों में और जैसे GFP चैनल के साथ ओवरलैप के कारण तकनीकी मुद्दों प्रदान करता है. पोस्ट इमेजिंग प्रसंस्करण Zeiss LSM सॉफ्टवेयर सीधे जिससे में निर्मित 2 फोटॉन माइक्रोस्कोप पर बाहर किया जा सकता है, GFP छवि (चित्रा -4 ए) को पीछे छोड़ दिया जा रहा है सच पाकिस्तानी कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप पाकिस्तानी छवि से घटाया जाता है. अनुपात घटाव के लिए आधार भी उतना ही चमकदार छवियों पर निर्भर है और GFP लेजर (488 एनएम) whilst के पाकिस्तानी और GFP कोशिकाओं दोनों fluorescing पाकिस्तानी लेजर (458 एनएम) के कारण है पाकिस्तानी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के लिए बहुत अधिक है. CFP के अलावा हम भी स्वयं सहायता समूह को देखने के लिए पहले प्रकाशित setups का उपयोग करने में सक्षम हैस्तर और इसलिए वाहिका आसपास के तहखाने झिल्ली, (चित्रा 4 बी) को बनाने के जो कोलेजन फाइबर को दर्शाती है.
इस मॉडल की एक और अनुकूलन व्यास में 2 मिमी के रूप में छोटे रूप में ऊतक के वर्गों चमकाना स्टीरियोटैक्टिक निर्देशित विकिरण का उपयोग करने की क्षमता है जो एक कस्टम बनाया छोटे जानवर irradiator का लाभ ले लिया है. विकिरण के साथ खिड़की को लक्षित करके यह है अंतर्निहित ऊतक पर प्रभाव विकिरण को देखने के लिए संभव है. हमने हाल ही में प्रभाव विकिरण को देख एक अध्ययन प्रकाशित किया है vasculature को BMDCs की भर्ती के संबंध में सामान्य मस्तिष्क के ऊतकों पर है, के बाद विकिरण ऊतक परिवर्तन में उनकी भूमिका पर विशेष रूप से देख रहे हैं. हम BMDCs की भर्ती समय और सामान्य ऊतकों 11 में निर्भर खुराक दोनों था.
यह दवा उपलब्ध कराने के चिकित्सा विज्ञान के वितरण और एकीकरण के तंत्र का अध्ययन करने के लिए संभव है एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग है. दौरानहमारे शोध हम VEGFTrap के उत्पादन, उत्पादन 25 की स्थानीय क्षेत्र में सभी VEGF के संकेत को रोकता है जो एक विरोधी angiogenic दवा को ट्रैक करने में सक्षम है. VEGFtrap उत्पादन, BMDC बातचीत और एक साथ वाहिका (चित्रा 4Cii): आनुवंशिक EGFP के लिए एक IRES के साथ मिलकर VEGFtrap जीन (चित्रा 4Ci) व्यक्त करने के लिए हमारे ट्यूमर कोशिकाओं को संशोधित करने और आरएफपी 'दाता' बी.एम. का उपयोग करके हम छवि EGFP करने में सक्षम थे. इस मॉडल और उपलब्ध चैनलों की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया. यह एकल कक्ष संकल्प के वादे के कारण दवा के कैनेटीक्स को देखने के लिए भी संभव है. Fluorescein (+ GFP) अधिक से अधिक लकीर 26 हासिल की है सुनिश्चित करने के लिए सर्जरी के दौरान ट्यूमर चित्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. नसों whilst के इमेजिंग इंजेक्शन लगाने के द्वारा यह चित्रण ट्यूमर कोशिकाओं को खुद में Fluorescein की सक्रिय तेज के माध्यम से नहीं होता है कि प्रदर्शित करने के लिए संभव है, लेकिन इसके बजाय दवा का संग्रह के माध्यम से टी के साथ स्ट्रोमल क्षेत्र मेंFluorescein (चित्रा 4D) के इंजेक्शन के बाद सह स्थानीयकरण 10 मिनट की कमी से देखा IME,.
कुल मिलाकर हमारी रणनीति गतिशील सेलुलर बातचीत के अध्ययन में फायदेमंद है, जो एक अद्वितीय प्रयोगात्मक मंच, प्राप्त करने के लिए उपन्यास और मौजूदा तकनीकों को जोड़ती है. इस रणनीति intracranially, चिकित्सा के जवाब में BMDC, ट्यूमर और सामान्य मस्तिष्क vascularity के उच्च संकल्प एकल कक्ष गतिशील विकास की जांच के लिए एक अमूल्य तरीका साबित हो गया है. Intravital इमेजिंग BMDC भर्ती, प्रवास और भेदभाव इंट्राक्रेनियल मस्तिष्क ट्यूमर vasculature में और साथ ही अन्य अनुसंधान क्षेत्रों के लिए अनुकूलनीय कई अन्य गतिशील प्रक्रियाओं का आणविक नियामकों की एक बेहतर समझ प्रदान कर सकते हैं. अन्य चिकित्सीय रणनीतियों के साथ संयोजन में BMDC कि विनियमित बाधा ख्यात कारकों मिश्रित उपचारों के सटीक समय की पहचान की सहायता कर सकते हैं. इसके अलावा, इस रणनीति के कई भविष्य के जनसंपर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैविवो intravital धुंधला रंगों में न केवल उपयोग, लेकिन यह भी छोटे आणविक अवरोधकों और fluorescently शोधकर्ताओं साथ ही उनके कैनेटीक्स पर अनुलंबीय देखने के रूप में और अधिक लक्षित चिकित्सा विज्ञान के वितरण और माइग्रेशन पैटर्न का पता लगाने के लिए अनुमति टैग कर रहे हैं कि नैनोकणों ojects.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम 2Photon माइक्रोस्कोप पर चैनलों की प्रारंभिक सेटअप में उनकी सहायता के लिए विशेष रूप से जेम्स Jonkman में, राजकुमारी मार्गरेट अस्पताल में उन्नत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सुविधा को धन्यवाद देना चाहूंगा. लेखकों विकिरण रिस्पांस (STTARR) कार्यक्रम और इसके संबद्ध आर्थिक सहायता एजेंसियों की spatio-अस्थायी लक्ष्यीकरण और प्रवर्धन स्वीकार करना चाहते हैं. हम VEGFTrap प्लास्मिड की आपूर्ति करने के लिए और उनकी पांडुलिपि सुधार और प्रतिक्रिया के लिए डॉ. पीटर टोंगे, Dr.Iacovos माइकल और Dr.Andras नागी धन्यवाद. BTRC में कर्मचारियों से समर्थन जारी रखा और चर्चा अमूल्य किया गया है और हम उनकी वैज्ञानिक इनपुट के लिए Dr.Abhijit गुहा मनाने करना चाहते हैं. काम CIHR और एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI | |
References
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