Summary
Vi beskriver en roman
Abstract
Vi har nå integrert tidligere etablert Intrakranial vindu (ICW) teknologi 1-4 med intravital to-foton konfokalmikroskopi å utvikle en ny plattform som gir mulighet for direkte langsiktig visualisering av vev strukturen endres intracranially. Bildebehandling til en enkelt celle oppløsning i sanntid mote gir utfyllende dynamisk informasjon utover det som tilbys av standard endepunkt histologisk analyse, som ser utelukkende på "snap-shot" tverrsnitt av vev.
Etablering av denne intravital avbildningsteknikk i fluoriserende kimere mus, er vi i stand til å avbilde fire fluorescerende kanaler samtidig. Ved å innlemme fluorescensmerkede celler, for eksempel GFP + benmarg, er det mulig å spore skjebnen til disse cellene som studerer deres langsiktige migrasjon, integrasjon og differensiering innen vev. Ytterligere integrering av en sekundær reporter celle, for eksempel en mCherry glioma linje, tillater karakterization av celle: celle interaksjoner. Strukturelle endringer i vevet microenvironment kan bli markert gjennom tilførsel av intra-vitale fargestoffer og antistoffer, for eksempel CD31 merket antistoffer og Dextran molekyler.
Videre beskriver vi en kombinasjon av et icw avbildning modell med et lite dyr mikro-irradiator som gir stereotaktisk bestråling, noe som skaper en plattform hvor de dynamiske vevs-forandringer som oppstår i forbindelse med administrering av ioniserende bestråling kan vurderes.
Aktuelle begrensninger av vår modell omfatter penetrans av mikroskopet, som er begrenset til en dybde på opp til 900 mikrometer fra sub kortikale overflate, noe som begrenser imaging til den dorsale aksen av hjernen. Tilstedeværelsen av hodeskallen ben gjør icw en mer utfordrende teknisk fremgangsmåte, sammenlignet med de mer etablerte og utnyttes kammer modeller for tiden brukes til å studere mammary vev og fett pads 5-7. I tillegg ICW provIdes mange utfordringer når optimalisere bildebehandling.
Introduction
En bedre forståelse av de strukturelle og biologiske forandringer som oppstår i hjernen som reaksjon på forskjellige patologier, og terapeutiske intervensjoner er kritisk for å forbedre behandlingsstrategier. Imidlertid er en av de aktuelle utfordringer i å studere disse strukturelle og biologiske forandringer, særlig med hensyn på intrakranial patologier, er utilgjengeligheten til det vev og den manglende evne til å studere den tidsmessige utvikling og progresjon av dynamiske forandringer i et in vivo miljø. Den generasjonen av "vinduet"-teknologi har tidligere vist seg vellykket i å undersøke bløtvev endringer gjennom tumor utvikling 5-7. Utvikling av ICW modeller viser seg å være mer teknisk utfordrende, på grunn av nødvendigheten av å fjerne skalleben uten skade på egge-infeksjon i den underliggende cerebralt vev. Tidligere papirer har forsøkt å tynne skallen å visualisere vev 8-10 imidlertid å produsere høy oppløsning klar imaldre fullstendig fjerning av skallen benet er behov 11. Gjenta langsiktig imaging (30 dager +) har nylig blitt et mulig alternativ gjennom bildebehandling 1,11, tidligere har kortere tidsrammer blitt studert fem.
I løpet av det siste tiåret et viktig mål har vært å belyse opprinnelsen av neo-vaskulaturen følgende patologiske stimuli, spesielt i respons til tumordannelse og progresjon, for å tilveiebringe nye terapeutiske mål for behandling av tumorer. Mye kontrovers forblir rundt kilden til nye blodkar i hjernen under tumorutvikling eller etter stråling. Tradisjonelt vascularization har vært ansett å skje gjennom angiogenese, en prosess der nye skip dannes fra den spirende av pre-eksisterende fartøy 12. Nyere studier imidlertid antyde at det tidligere antatte embryonale prosess for vaskulogenese spiller muligens en mer betydelig rolle i dannelsen av patologiske vaskulatur. Vasculogenesis innebærer rekruttering av de voksne angioblast kolleger fra benmargen som igjen er så direkte involvert i dannelsen av nye fartøy endotel 12-14. Oppsamling av bevis indikerer at endoteliale forløperceller blir mobilisert fra benmargen til å initiere de novo fartøy dannelse i respons til onkogene mediatorer 15-17. Men disse studiene gir motstridende bevis for den direkte bidraget av disse avledet benmarg-celler (BMDCs) til fartøy-endotel ved prosentvis bidrag varierende med typen av patologiske stimulans og respons på behandling 18-21.
Derfor etablere reproduserbare eksperimentelle metoder som tillater høy oppløsning intravital bildebehandling for gjentatt langvarig studie av prosessen med BMDC integrering i tumor blodkar og i respons på behandlingen er uvurderlig. Standard histologiske teknikker ikke gir dynamisk inforsjon som kreves for å fastslå den langsiktige overlevelse, differensiering og integrering av cellene som gir opphav til neovaskulatur og kan derfor ikke demonstrere definitivt mekanismer for celle interaksjon.
Vi har vist ved hjelp av vår eksperimentelle tilnærming at det er varierende grad av BMDC rekruttering etter både intrakranielt ioniserende stråling og tumorvekst, en rekruttering som er imidlertid patologi stedsspesifikke og ikke en invasjon av hele intrakranielle vev 11,22. Vi har vist at rekruttering følger en tid følsom mønster demonstrert ved gjentatt avbildning av et enkelt dyr 11,22. På samme måte kan in vivo avbildning også gi uvurderlig innsikt i tumorcelle mimikk der fluorescently merket kreftceller kan avbildes og spores med en intra-vital CD31 antistoff for endotelceller å fremheve muligheten for svulst celle transdifferentiation til direkte danne sin egen endotelet.
For å demonstrere tilpasning av vår modell, samt celle-celle interaksjoner nevnt ovenfor, har vi vært i stand til å studere narkotika-celle interaksjoner. Vi har sett på narkotika-hemmere som AMD3100, en SDF-1-hemmer, og dens rolle i signalering nettverk involvert i BMDC rekruttering 11. Tilsvarende har vi genmodifisert ut U87 glioma xenografts celler til å uttrykke VEGFTrap, en VEGF-hemmer 25, i forbindelse gjennom en IRES til en GFP molekyl. Ved å bruke RFP + BM er vi i stand til å studere rollen VEGF har på rekruttering av BMDCs til blodkar. Nå nylig har vi brukt modellen til å studere narkotika kinetikk ser på mechanism bak tumor-opptegning narkotika 26 Fluorescein, på cellenivå. Gjennom bruk av en spesialbygd i huset små dyr irradiator vi har vært i stand til å integrere stereotaktisk levert stråling for å vurdere responsen fra både svulsten og BMDCs til behandling.
Gjennom bruk av våre nye intravital bildebehandling metoden forskerne skal få innsikt i de encellede sanntid endringer som oppstår i ulike sykdommer og systemer, hjelpe klarlegging av mange funksjonelle og biologiske funksjoner av vevsforandringer.
Protocol
ALL ANIMAL arbeidet har vært utført under en ANIMAL CARE OG BRUK Commitee GODKJENT PROTOKOLL og henrettet i samsvar med alle gjeldende retningslinjer, forskrifter og kontrollorganer.
For feilsøking referansen Tabell 2.
En. Bone Marrow tilberedning (valgfritt) Figur 1 (30 min prep, 5 min per mus)
All kirurgi bør utføres med streng aseptisk teknikk med autoklavert sterilt utstyr.
En donor mus vil gjeninnføre tre vert mus.
- Anaesthetize mottaker NODscid mus og posisjon, med bly for å beskytte hodet, inne i sentrum av den Gammacell 40 'Exaktor' irradiator.
- Strålebehandling NODscid mus med 2,5 Gy hele kroppen bestråling (TBI).
Kritisk trinn: Optimalisering av TBI kan være nødvendig på grunn av variasjon i dosen som kreves for tilstrekkelig vertsimmunrespons cell uttømming i ulike musestammer.
Pause punkt: Host mus kan bestråles på forhånd, men bør brukes innen 24 timer for å bestråle.
- Avlive donor mus i henhold til de institusjonelle Animal Care komiteens retningslinjer. Rengjør bakbena og fjern tibia og femur fra begge, stripping all overflødig vev fra skjelettet (Tall 1ai, 1aii).
KRITISK STEP: fibular bein er ikke levedyktig for bruk på grunn av svært trange lumen.
- Fjern endeplater fra begge ender av fire ekstraherte ben og skylle dem ut ved hjelp av en 22 G nål og 1 ml steril PBS før de er hvite av utseende (figur 1aiii). Referanse Tabell 2.
- Bland ekstraherte benmarg (BM) suspensjon godt og trekke 300 ul i tre 27 G tuberkulinprøving nåler. Utvunnet BM bør inneholde ca 2 x 10 7 celler oger nok for tre vert mus reconstitutions. Referanse Tabell 2.
- Injiser suspensjonen i den laterale nålevenen av tre tidligere bestrålte NODscid mus fra trinn 1.1 (Figur 1b). Referanse Tabell 2.
FORSIKTIG: For å sjekke sterilitet av BM injisert anbefaler vi plating de resterende BM og kultur for 24 timer for å se etter infeksjon. Primære dødsårsaken på dette punktet er infeksjon i de nylig rekonstituert mus.
2. Intrakranial Window Generation - Figur 2 (30 min per mus)
All kirurgi bør utføres med streng aseptisk teknikk med autoklavert sterilt utstyr og under en varmelampe for å holde dyr varm (Figur 2A).
- Anaesthetize mottaker NODscid mus med IACUC godkjent bedøvelse, Avertin IP-injeksjon på 0,5 mg / g og posisjon, med bly for å beskytte hodet, inne i sentrum av denGammacell 40 'Exaktor' irradiator. Fjern hår fra hodebunnen. I tillegg gjelder tåre gel for å hindre hornhinnen dehydrering.
- Ren hodebunn først med Betadine løsning og deretter med alkohol, og deretter lage et snitt fra midtpunktet av ørene til rett over øynene. Fjern hodebunnen 3 mm på hver side av den første innsnitt, utsette skallen og landemerkene i skallen overflaten (figur 2Bi).
- Heve periosteum ved å injisere 2% lidokain: adrenalin løsning og dissekere bort fra skallen overflate (figur 2Bii).
- Ved hjelp av 2,7 mm trephine drill, svekke en 2,7 mm sirkel av skallen over cortex av den høyre hjernehalvdelen mellom lambda og bregma. IKKE trenge beinet med drill (figur 2Biii). Reference Tabell 2.
KRITISK STEP: hvis drill går gjennom skallen hjernens overflate vil bli skadet som påvirker resultatet med ekstra trauma. I tillegg vil det oppstå overdreven blødning hindre et klart vindu fra å bli generert.
- Fjern svekket bein klaff med disseksjon pinsett og dental krok og bevisst, men kontrollert styrke (figur 2Biii).
- (Valgfritt) Ved å se på tumor patologi, injiserer valgt tumorcellelinjer (med fluorescerende reporter-genet) i sentrum av vinduet genereres i trinn 2.5.
- Last 10 ul 30 G Hamilton sprøyte med celle suspensjon og last nål inn en stereotaktisk ramme.
Kritisk trinn: lik celletallet må bli optimalisert for tumorceller i bruk og tidslinjen av vekst som kreves. For U87 kulturer bruker vi 2 x 10 5 celler i 10 mL per mus. - Laste musen på den digitale stereotaktisk ramme justere nålen til midtpunktet av vinduet generert.
- Lavere nål til den berører bare den kortikale overflaten og tilbakestille den digitale koordinater.
- Laveh nålen til 3,2 mm inn i kortikale vev og injiser på 3 mm dype.
- Trekke nålen sakte deretter fjerne mus fra rammen.
KRITISK STEP: Injiser løsningen over varigheten av 1 min og la nålen i posisjon etter injeksjon for å sikre redusert tilbake flyten.
KRITISK STEP: Hvis mindre blødninger er oppstått vanne med sterilt saltvann for 1-5 min å stoppe overfladisk blødning. Fortsett med etterfølgende trinn.
- Last 10 ul 30 G Hamilton sprøyte med celle suspensjon og last nål inn en stereotaktisk ramme.
- Dampen hjernens overflate med en dråpe av steril PBS for å holde hjernevevet vannes.
- Flyte en 3 mm dekkglass på hjernen overflaten for å forsegle fullt rundt 2,7 mm vinduet generert. Referanse Tabell 2.
- Tørr rundt skallen bein da gjelde vetbond til hele eksponert skallen til forsegle hodebunnen vev til skallen bein og dekkglass på plass. IKKE påfør et overskudd som det vil komme under glasset og redusere bildebehandling potensial.
- Mix frisk dental akryl pulver og løsning, omtrent 30% (w / v), og ventes over toppen av vetbond. For å sikre en tett forsegling overlappe akryl litt på glasset dekkglass kanten (Figur 2Biv). Reference Tabell 2.
FORSIKTIG: Tannlege akryl er ekstremt farlig, så vi anbefaler bruk av hansker og maske gjennom prosedyrene.
KRITISK STEP: Dental akryl må forbli smidig under støping for å sikre god tetting og redusere overflødig. Oppbygging av akryl på vinduet vil viske bilder.
- Tillat mus for å utvinne i en varm bur.
3. Stereotaktisk stråling (valgfritt) - Figur 3 (25 min per mus)
Variasjoner vil eksistere i de forskjellige bestrålingsapparater som benyttes og som sådan optimalisering vil være nødvendig. Vi brukte en spesialdesignet irradiator.
- Anaesthetize musbruker isofluran på 4% for induksjon etterfulgt av 1,5-2% gjennom hele prosedyren med 0,5-1 liter O 2 en min, og plasser den på tilpasset hodet restrainer inne i stereotactic irradiator (figur 3Ai).
- Skaff en 360 ° cone beam CT scan med X-ray tube kjører på 40 kVp og 0,05 mA gjennom en 2 mm aluminium filter. Bruk bildet for å lede bevegelsen av scenen, dirigere stråling isocentre til den høyre hjernehalvdelen at det sitter sentralt i Dorsal Ventral retning.
- Sett hemisfæriske collimator, 8 mm x 11 mm blokk.
KRITISK STEP: collimators kan utformes på mange forskjellige oppsett og så kan være forbedret for å inkludere og ekskludere ulike deler av hjernen. 8 mm x 11 mm definerer et hemisfærisk område av hjernen.
- Skaffe enkelt CT ortogonale bilder både fra toppen (AP) og bunn (PA) gjennom collimator å ytterligere styrke plassering av hjernen, Anatomical benstrukturer kan brukes til reproduserbarhet.
- Utveksling aluminium filter for en 0,93 mm kobber behandling filtrere og administrere halvparten av ønsket stråledosen med X-ray tube kjører på 225 kVp og 13 mA fra toppen i en AP retning.
- Tilbake gantry til nederste posisjon og administrere andre halvdel av stråledosen igjen med X-ray tube kjører på 225 kVp og 13 mA skjemaet nederst i en PA retning.
Kritisk trinn: Det er viktig å bestråle fra både toppen og bunnen for å redusere RT gradient gjennom hjernevevet, hjelpemidler det også med justeringen av isocentre til midten av hjernen.
4 In vivo Two Photon Laser Mikroskopi -. Figur 3 (1-3 timer per økt)
Variasjoner vil eksistere i de forskjellige brukte mikroskoper og som sådan optimalisering vil være nødvendig. Vi brukte en Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal mikroskop.
- Anaesthetize mus med IACUC godkjent bedøvelse, Avertin IP injeksjon på 0,5 mg / g og ren vindu ved hjelp av alkohol spray.
- (Valgfritt) Injiser merket vaskulær fargestoff 5-10 min før bildebehandling, inn i halen venen før bildebehandling. Alexa647-dekstran benyttes ved 0,35 ug / g eller APC-CD31 brukes ved 0,2 ug / g. Se tabell 2.
- (Valgfritt) Injiser Fluorescein via halen blodåre i en dose på 7,7 mg / kg, 5 min før bildebehandling, å avgrense tumor. Referanse Tabell 2.
- Setup-kanaler på konfokalmikroskop som bestemmes av fluorkrom brukt i det kimære mus genereres. Tabell 1 viser de kanaler som er beskrevet i denne modellen.
- Invertere musen på den bevegelige mikroskop scenen og stabilisere hodet i posisjon med formbar plastelina. (Figur 3Aii) Annonse Tabell 2.
- Slå på første kanalen laser og bruke til å plassere i sentrum av ICW.
- Bruk 5x objektiv og ta et bilde av hele vinduet skal brukes som et kart for ytterligere bilder med høyere oppløsning.
- Imaging bør utføres med 10X og 20X 'long range' objektiver for å få den beste bildekvaliteten.
KRITISK STEP: Kanaler og mål på 2PLM bør settes opp ved hjelp av konstruerte celler in vitro før avbildning av murine modeller for å sikre at de markere riktig fluorokrom.
| Fluorokrom | CFP | GFP / Fluorescein / FITC | mCherry / RFP / DsRed | APC / Alexa647 | SHG autofluorescens |
| Excitation laser | 458 nm | 488 nm | 543 nm | 633 nm | Chameleon laser 820 nm |
| Samling Filter | 480-520 nm | 500-550 nm | 565-615 nm | 650-710 nm | 390-465 nm |
Tabell 1. Fluorokrom oppsett. Veiledninger for brukeren å se eksitasjon laser og emisjon spektra samleren brukes for hver av de kanalene som er tilgjengelig i modellen.
Representative Results
Den valgfrie trinn for rekonstituering av BM NODscid av musene bør resultere i et 80% opptak av det fluorescerende 'donor' BM i 100% av NODscid "vert" mus, vil imidlertid optimalisering av TBI være nødvendig for å forsterke rekonstituering i andre non -immunocompromsed stammer. Hvis mus uten hell rekonstruert de vil bli syke og dø raskt etter inngrepet, kan svekket mus krever ekstra mat og vannkilder.
ICW gang ferdig skal se ut som vist i figur 2Biv. Det er ideelt å ha en åskam av akryl rundt glass dekkglass som dette gir styrke til sammenføyningen med skallen. Perfekt vinduer er reproduserbare og gir mulighet for gjentatt bildebehandling i opptil åtte uker etter deres generasjon (figur 2C). Bilder produsert gjennom disse optimale vinduene vil se ut som de sett i Figur 3BI. Feil i vinduet generasjon vil produsere bilder av fattigekvalitet for eksempel, vil luftbobler under vinduet hindre hele synsfelt avbildes, vil områdene er mørke som luften hindrer laser imaging (Figur 3Bii). Med overflødig lim og akryl på dekkglass vil det være en høy grad av bakgrunn fluorescens og områder av feltet blir utslettet som sees i figur 3Biii, på samme måte hvis det er skitt på vinduet små prikker av bakgrunnsfluorescens vil være synlig i feltet (Figur 3Biv).
Suksess med ICW bildebehandling er forhåndsbestemt av integriteten til kirurgisk teknikk, men kan selv optimale ICWs støter på problemer under bildebehandling økten. Som sådan eksisterer en rekke og grad av klarhet i de bilder generert som vist i figur 3.. Publikasjonen bildekvalitet portrettert i figur 3C oppstår når alt er optimal. Selv om det ikke er mulig for alle mus, er det mulig å forvente 80% av bildets genereres å se slik ut. En av de store mangler ved den nåværende mikroskopi oppsettet er bruk av inverterte lasere. Mus må være plassert på ryggen, og dette resulterer i mye stress og ubehag som kan føre til anstrengt pust under bildebehandling. Dette gir en 'foret' image som pusting forstyrrer snitt som oppstår under bildebehandling, der, blir hver piksel rad avbildet fire ganger og gjennomsnittet av de fire vises i det endelige bildet. Enhver bevegelse under gjennomsnitt, slik som forårsaket av tung pust, vil skape en gjenstand som vises som en linje på bildet, som vist i Figur 3D. Mus som er tilstrekkelig bedøvet under bildebehandling kan møte dette problemet også. The 'foret' effekt kan reduseres ved å begrense image snitt til på, men dette vil i sin tur redusere bildekvaliteten og kan ikke eliminere problemet. Alternativt mus kan flyttes eller prøves når pusting har normalisert. Bruken of oppreist 2PLM vil motvirke dette problemet som mus kan avbildes "i liggende stilling '. Et ytterligere problem med avbildning på en invertert 2PLM omfatter den begrensede tilgjengeligheten for posisjonering av icw når musen er på mikroskopet, og dette fører til "segmentert" bilder som de sett i figur 3E. Her laseren og dekkglass ikke er plassert vinkelrett på hverandre, og som sådan avbildning finner sted ved en vinkel. Dette resulterer i dannelsen av en "segmentert 'image hvor sidene av synsfeltet ikke er avbildet. Problemet er lett løses med reposisjonering av musen for å sikre dekkglass er helt vannrett en gang på hodet montere som sett i Figur 3Aii.
Modellen som presenteres her ble spesielt brukt til å undersøke hvilken rolle BMDCs i vascularization av svulstvev og demonstrerer evnen til å bruke tre forskjellige kanaler samtidig (Cherry, GFP, Far-rød - Alexa647 og APC) making CFP og SHG overflødig for denne historien. Vi var i stand til å avbilde mus lengderetningen i opptil åtte uker, studere rekruttering og integrering av BM celler i blodkar på en enkelt celle nivå, uten skadelige effekter forårsaket av vinduet. Denne modellen demonstrerer den enkle å samle dynamisk informasjon om kilde og dannelsen av blodkar og et samspill mellom forskjellige celletyper av interesse, som tidligere ble tapt ved sluttpunktet histologisk analyse.
| Trinn | Problem | Resonnement | Oppløsning |
| 1.4 | Bone knuse | Blunt verktøy | Samle benmarg danner en frisk mus ved hjelp skjerpet saks eller frisk skalpell blad, vil bein fragmenter hemme TV injeksjon |
| 1.5 | Lav utvinning (lav viscosity) | Bone gavler kuttet for distalt, dårlig innsamlingsmetode | Benet må kuttes så proksimalt som mulig, og oppsamlet med benet inne samling rør for å forhindre sprut Tid bør brukes til å trekke ut BM maksimalt og med forsiktighet Om nødvendig bassenget mer enn en mus i en ml |
| Høy Extraction (høy viskositet) | Lav samling buffer | Fortynne ut løsning med ekstra 0,1% BSA, delt til tre mottakerlandene mus opp til 500 mL per mus maksimal | |
| 1.6 | Bad Intravenøs injeksjon | Dårlig vasodilatasjon og fartøy synlighet | Forbedre utvidelse med varmelampe. Plasser musen i halevenen restrainer med innebygd lyskilde for å hjelpe tilgang |
| 1 | Mus Sick | Infeksjon | Ofre mus i henhold til institusjonens regler. Sikre haler rengjøres før injeksjon og sjekke sterilitetav utvunnet BM i kultur |
| Mus dør | Dårlig BM opptak | Sjekk% av fluorescerende BM opptak av død mus. Optimalisere TBI for stamme av mus som brukes Øk mengden av BM injeksjon (eksempel bruk en donor mus for to mottakere) | |
| 2.4 | Minor blødninger | Dura brutt under boring | Press med gel pads og og kontinuerlig sterilt saltvann vask |
| Store blødninger | Hjerneskadet etter boring | Ofre mus i henhold til institusjonens retningslinjer | |
| 2.8 | Luftbobler i henhold dekkglass | Dårlig kontakt med kortikale overflaten forhindrer riktig plassering | Fjern dekkglass og legge til ekstra PBS å flyte dekkglass på vinduet for å fjerne bobler |
| 2.10 | Glidning av dekkglass under liming | Acrylic massen er tung og legger press på dekkglass og flytter dekkglass ut av veien | Pinsett bør brukes til å holde dekkglass ned mens vetbond og akryl påføres |
| 4.2 | Bad Intravenøs injeksjon | Dårlig vasodilatasjon og fartøy synlighet | Forbedre utvidelse med varmelampe. Plasser musen i halevenen restrainer med innebygd lyskilde for å hjelpe tilgang |
| 4.4 Figur 3C | 'Foret "bilder | Anstrengt eller uregelmessig åndedrett | Fjern mus fra rammen og la den komme Øke nivået av bedøvelse administrert og justere posisjonen for at halsen ikke er altfor bøyd eller forlenget for å unngå å puste |
| Figur 3C | 'Segmentert' image | Brain er ikke parallell til målsettinger | Juster posisjonen til dekkglass for å sikre at det er flat |
| Fartøyet ikke visualisert | injeksjon ikke sett intravaskulært | Gjør om injeksjon i alternativ halevenen, varm hale for å sikre god vasodilation | |
| Høy bakgrunn | Dirty dekkglass, Luftbobler, akryl | Tørk dekkglass med fuktig 70% etanol klut, ikke suge som kan trenge henhold akryl og skade hjernevevet |
Tabell 2. Feilsøking. En retningslinje for korrigerende tiltak som kreves for problematiske områder av prosedyrene.
Schemata en. Eksperimentell flytskjema. Dette viser tidslinjen av hendelser gjennom eksperimentelle trinn 1-4. Musemodeller er oppsett over en uke, for åsikre BM rekonstruerer riktig, og ikke behandles med stoffet før dag 7 av svulsten for å sikre svulsten grafts. Klikk her for å se større figur .
Figur 1. BM tilberedning. (A) BM ekstraksjonsmetode jeg. Disseksjon av hind lem knokler. Ii. Dissekert femur og tibia fra bakbena, renset og klar for utvinning. Iii. Bones med endeplaten fjernes og skylles, viser den hvite utseende av de tomme ben (B). schemata demonstrerer hvor laterale vener for injeksjon blir posisjonert i halen.
Figur 2. ICW generasjon. (A) aseptisk oppsett anbefalt (B) jeg. Exposed skallen overflaten avslører landemerker som kreves for kirurgi, bør ICW være plassert på den høyre hjernehalvdelen like langt fra bregma og lamda. Ii. Periostieum løftet med lidokain løsning, klar for fjerning . III. Dental krok som kreves for fjerning av bein-fragment generert med drillen. IV. Endelig icw med dental akryl. (C) Tre eksempel vinduer demonstrerer reproduserbarheten av fremgangsmåten.
Figur 3. 2PLM forventede resultater. Alle bilder viser grønne BM, rød svulst, Blå (pseudo farget langt rødt) blodkar. (A) jeg. Demonstrerer hodet ramme som beholder isofluran flyt på innsiden av små dyr irradiator. Den 8 x 11 mm collimator kan også sees bevege seg rundt gjennom portalen. Ii. Mus i invertert plassert i hodet ramme nødvendig for bildebehandling, sikrer formbart plastercine alle vinduer kan innkvarteres. (B) demonstrative bilder av utfallet av problemene med vinduet generasjon fra i. en optimal vindu, ii. et vindu med luftbobler inni og under iii akryl søl over dekkglass og iv. skitt på vinduet selv. (C) Høydepunkter problemene som oppstår med bildebehandling etter vellykket generering av en ICW jeg. optimal bildebehandling ii . puste gjenstanderskape en "foret" image iii. dekkglass ikke vinkelrett på laser generere en 'segmentert' image. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Funksjonelle bruksområder og tilpasninger av modellen. (A) CFP post bildebehandling behandling der GFP bildet trekkes fra CFP bildet for å avsløre den sanne CFP image som kan overlappet de andre tre kanaler i hvitt. Grønn BM, Red svulst, Hvit CSCS, Blå (pseudo farget langt rødt) blodkar (B) demonstrasjon av kollagenfibre som kan avbildes med SHG. Grønn Dextran, red BM, Cyan Collagen (C) jeg. VEGFTrap celler i vitro demonstrere GFP signal produsert med VEGFtrap. ii. In vivo avbildning demonstrerer VEGFtrap celler tydelig og i tillegg fremhever den enkle bytter kanal for å demonstrere systemet du ser på. Grønn VEGFTRap + Tumor, Red BM, Blå (pseudo farget langt rød) vaskulatur. (D) demonstrerer innsamling av fluorescein i stroma av svulsten og ikke direkte i cellene, som vist ved mangelen på grønt signal overlegg med rød tumor. Grønn Fluorescein, Red svulst. Klikk her for å se større figur .
Discussion
De tre kanalene som er beskrevet i alle bildene så langt er utskiftbare for tre markører av interesse i andre modeller og blader forskere med en uvurderlig sett med verktøy for å se en rekke celletyper og interaksjoner. Planlegging er nødvendig for å sikre at alle markører og celletyper har nå integrert en reporter fluorescens molekyl i en distinkt kanal.
I tillegg til de vanlige tre kanaler som brukes her kunne vi også integrere en fjerde CFP kanal (figur 4A) og en SHG kollagen baserte kanal 7 (figur 4B). Dette utvider muligheten for å se på cellulære interaksjoner in vivo og i tillegg tillater brukeren å foreta befolkningen blanding for å studere spesifikke celle-celle interaksjoner og samtidig beholde to kanaler for andre markører. For eksempel har vi sett på tumorceller (RFP) og kreft stamceller (CFP) i forholdet 1:03 med en interesse i å sammenligne sin intratummuntlige interaksjoner (Figur 4A). Vi observerte at 7 dager etter implantasjon av blandet befolkning forholdet ble opprettholdt og begge celle populasjoner kan fortsatt bli sett.
CFP kanal gir tekniske problemer på grunn av overlapping med GFP kanal i både eksitasjon og emisjon spektra og som sådan krever innlegget bildebehandling behandling for å definere den sanne CFP + celler fra de som faktisk er GFP +. Post bildebehandling behandling kan utføres på to-foton mikroskop bygd i Zeiss LSM programvaren direkte der, er GFP bildet trekkes fra CFP bildet og gir den sanne CFP cellene blir etterlatt (Figur 4A). Forutsetningen for forholdet subtraksjon er avhengig like klare bilder og er på grunn av CFP laseren (458 nm) fluorescerende både CFP og GFP-celler mens GFP laseren (488 nm) er for høy til å fluorescere CFP celler. I tillegg til CFP har vi også kunnet bruke tidligere publiserte oppsett for å se på SHGnivåer og så avbilder kollagenfibre som utgjør basalmembran rundt blodkar, (figur 4B).
En annen tilpasning av denne modellen har benyttet seg av en tilpasset bygget små dyr irradiator som har evnen til å bruke stereotaktisk guidet stråling for å bestråle seksjoner av vev så liten som 2 mm i diameter. Ved å målrette vinduet med bestråling er det mulig å se på effekten stråling har på det underliggende vev. Vi har nylig publisert en studie ser på effekten strålingen har på normalt hjernevev med hensyn til rekruttering av BMDCs til blodkar, ser spesielt på deres rolle i innlegget stråling vevsforandringer. Vi fant at rekruttering av BMDCs var både tid og doseavhengig i normalt vev 11.
Det er mulig å studere mekanismene for levering og integrering av legemiddelselskap som gir stoffet er merket med et fluoriserende fargestoff. Undervår forskning har vi kunnet spore produksjonen av VEGFTrap, en antiangiogenisk medikament som blokkerer all VEGF signalering i det lokale området i produksjon 25. Ved å genetisk modifisere våre kreftceller å uttrykke VEGFtrap genet kombinert med en IRES til EGFP (figur 4CI) og bruk RFP 'donor' BM kunne vi avbilde EGFP: VEGFtrap produksjon, BMDC samhandling og blodkar samtidig (Figur 4Cii). Dette viste allsidigheten av modellen og kanaler tilgjengelig. Det er også mulig å se på kinetikken i stoffet på grunn av den løftet av enkelt-celle-oppløsning. Fluorescein (GFP +) brukes til å avgrense svulster under operasjonen for å sikre maksimal reseksjon oppnås 26. Ved å injisere intravenøst mens avbildning er det mulig å demonstrere at avgrensningen oppstår ikke gjennom det aktive opptak av Fluorescein inn i tumorcellene selv, men i stedet ved hjelp av innhenting av medikamentet inn i stromal område med time, sett av den manglende co-lokalisering 10 min etter injeksjonen av den Fluorescein (figur 4D).
Samlet strategien kombinerer nye og eksisterende teknikker for å oppnå en unik eksperimentelle plattform, hvilket er fordelaktig i studiet av dynamiske cellulære interaksjoner. Denne strategien har vist seg å være en uvurderlig metode for å undersøke høy oppløsning encellede dynamiske utviklingen av BMDC, tumor og normal hjerne vascularity i respons på behandlingen, intracranially. Intravital bildebehandling kan gi en bedre forståelse av molekylære regulatorer av BMDC rekruttering, migrasjon og differensiering i intrakranielt hjernesvulst blodkar samt mange andre dynamiske prosesser tilpasningsdyktige til andre forskningsfelt. Hemmende putative faktorer som regulerer BMDC i kombinasjon med andre terapeutiske strategier kan hjelpe identifiseringen av den nøyaktige timing av kombinasjonsbehandlinger. Videre kan denne strategien tilpasses mange fremtidige projects utnytte ikke bare in vivo intravital flekker fargestoffer, men også små molekylære hemmere og nanopartikler som er fluorescently merket slik at forskerne å spore distribusjon og vandringsmønster for mer målrettede behandlingsformer samt se lengderetningen på sine kinetikk.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Avansert optisk mikroskopi Facility på prinsesse Margaret sykehus, spesielt James Jonkman for deres hjelp i det første oppsettet av kanaler på 2Photon mikroskop. Forfatterne ønsker å takke den Spatio-Temporal målretting og Amplification of Radiation Response (STTARR) programmet og dets tilknyttede virkemiddelapparatet. Vi takker Dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael og Dr.Andras Nagy for å forsyne VEGFTrap plasmider og for sine manuskript korreksjoner og tilbakemeldinger. Fortsatt støtte og diskusjon fra personalet på BTRC har vært uvurderlig, og vi ønsker å minnes Dr.Abhijit Guha for hans faglige innspill. Arbeidet ble finansiert av CIHR og NIH tilskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI | |
References
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
