Summary
Vi beskriver en roman
Abstract
Vi har framgångsrikt integrerat tidigare fastställts Intracranial fönster (ICW) teknologi 1-4 med intravital 2-fotonen konfokalmikroskopi att utveckla en ny plattform som möjliggör direkta långsiktiga visualisering av förändringar vävnadsstruktur intrakranialt. Imaging vid en enda cell upplösning i realtid mode ger kompletterande dynamisk information utöver den som lämnas av standard slutpunkt histologisk analys, som ser enbart på "snap-shot" tvärsnitt av vävnad.
Etablera denna intravital bildteknik i fluorescerande chimära möss, kan vi avbilda fyra fluorescerande kanaler samtidigt. Genom att införliva fluorescensmärkta celler, såsom GFP + benmärg, är det möjligt att spåra ödet för dessa celler att studera deras långsiktiga migration, integration och differentiering inom vävnaden. Ytterligare integrering av en sekundär reporter cell, såsom en mCherry gliom tumörlinjen, möjliggör karakteterization av cell: cell interaktioner. Strukturella förändringar i vävnaden microenvironmenten kan belysas genom tillsats av intra-vitala färgämnen och antikroppar, t.ex. CD31 märkta antikroppar och dextranmolekyler.
Dessutom beskriver vi en kombination av vår ICW imaging modell med ett litet djur mikro-irradiator som ger stereotaktisk bestrålning, skapa en plattform, där de dynamiska vävnad förändringar som sker efter administrering av joniserande strålning kan bedömas.
Aktuella begränsningar av vår modell är penetrans av mikroskop, som är begränsad till ett djup av upp till 900 nm från sub kortikala ytan, begränsar avbildning till rygg axel hjärnan. Närvaron av skallbenet gör ICW en mer utmanande tekniskt förfarande, jämfört med de mer etablerade och utnyttjas kammare modeller har använts för att studera bröstvävnad och fettkuddarna 5-7. Dessutom ICW PROVIdeS många utmaningar när optimera avbildning.
Introduction
En bättre förståelse av de strukturella och biologiska förändringar som uppstår i hjärnan som svar på olika patologier, och terapeutiska insatser är avgörande för att förbättra behandlingsstrategier. Men en av de aktuella utmaningarna i att studera dessa strukturella och biologiska förändringar, särskilt när det gäller intrakraniella sjukdomar, är otillgänglighet av vävnaden och oförmågan att studera tidsutvecklingen och dynamisk utveckling av ändringar i en in vivo-miljö. Den generation av "fönster"-tekniken har tidigare visat sig vara framgångsrik i att undersöka mjukdelar förändringar genom tumörutveckling 5-7. Utveckling av ICW modeller visar sig vara mer tekniskt utmanande, på grund av nödvändigheten att avlägsna skallbenet utan att skada på anstiftan infektion i den underliggande cerebrala vävnaden. Tidigare artiklar har försökt att förtunna skallen att visualisera vävnad 8-10 dock att producera hög upplösning klar imåldrar blir fullt avlägsnande av skallbenet krävs 11. Upprepa långsiktig imaging (30 dagar +) har först nyligen blivit ett genomförbart alternativ genom avbildning 1,11, har tidigare kortare tidsramar studerats 5.
Under det senaste decenniet ett viktigt mål har varit att belysa ursprunget till neo-vaskulaturen följande patologiska stimuli, särskilt som svar på tumörbildning och progression, att tillhandahålla nya terapeutiska mål för behandling av tumörer. Mycket kontrovers kvarstår kring källan till nya kärlen i hjärnan under tumörutveckling eller efter strålning. Traditionellt vaskularisation har ansett att ske genom angiogenes, en process genom vilken nya fartyg bildas från groning av befintliga fartyg 12. Nyare studier tyder dock på att det tidigare antagits embryonala process av vaskulogenes kan spela en mer betydande roll i bildandet av patologiska kärlsystem. Vasculogenesis innebär rekryteringen av de vuxna angioblast motsvarigheter från benmärgen som i sin tur sedan direkt involverade i bildandet av nya fartyg endotel 12-14. Ackumulerande bevis tyder på att endothelial precursorceller mobiliseras från benmärgen att inleda de novo kärlbildning svar på onkogena medlare 15-17. Men dessa studier ger motstridiga bevis för direkta bidrag av dessa ben härledda benmärgsceller (BMDCs) till fartyget endotel med procentuella bidrag varierar med typ av patologiska stimulus och respons på behandlingen 18-21.
Därför, om inrättande reproducerbara experimentella metoder som möjliggör hög upplösning intravital avbildning för upprepad långsiktig studie av processen BMDC integration i tumörvaskulatur och som svar på terapi är ovärderlig. Standard histologiska tekniker misslyckas med att tillhandahålla den dynamiska infortion som krävs för att bestämma långsiktig överlevnad, differentiering och integrering av cellerna som ger upphov till neovaskulatur och kan därför inte uppvisa slutgiltigt mekanismerna för cellinteraktion.
Vi har visat att använda vår experimentella tillvägagångssätt att det finns en varierande grad av BMDC rekrytering efter både intrakraniell joniserande strålning och tumörtillväxt, en rekrytering som är emellertid patologi platsspecifik och inte en invasion av hela intrakraniell vävnaden 11,22. Vi har visat att rekryteringen följer en tid känslig mönster framgår av upprepad avbildning av ett enda djur 11,22. Likaså kan in vivo imaging också ge ovärderliga insikter i tumörceller härmning där fluorescerande taggade tumörceller kan avbildas och spåras med en intra-vital CD31 antikropp för endotelceller att belysa möjligheten av tumörceller transdifferentiering att direkt bilda sin egen endotel.
För att visa anpassningsförmåga vår modell, samt cell-cell interaktioner som nämns ovan, har vi kunnat studera drog-cell-interaktioner. Vi har tittat på narkotika hämmare som AMD3100, en SDF-1-hämmare, och dess roll för att signalera nätverk som deltar i BMDC rekrytering 11. Likaså har vi genetiskt engineered ut U87 gliom xenografter celler att uttrycka VEGFTrap, en VEGF-hämmare 25, i förening med en IRES till en GFP molekyl. Genom att använda RFP + BM har vi möjlighet att studera vilken roll VEGF har på rekryteringen av BMDCs till kärlsystemet. Nu senast har vi utnyttjat den modell för att studera drogen kinetik tittar på MEChanism bakom tumör-skissera drog fluorescein 26, på cellnivå. Genom att använda en specialbyggd i huset litet djur irradiator vi kunnat integrera stereotaktisk levererad strålning att bedöma svaret av både tumör och BMDCs till behandling.
Genom att använda våra nya intravital forskare avbildningsmetod kommer att få insikt i de encelliga realtid förändringar som sker i olika patologier och system, medhjälp klarlägga många funktionella och biologiska egenskaper vävnad förändringar.
Protocol
Alla animaliska arbete har utförts inom ramen för ett Djurvård och användning kommitté godkänt protokoll och exekveras i enlighet med alla relevanta riktlinjer, regler och tillsynsmyndigheter.
För felsökning referens Tabell 2.
Ett. Bone Marrow Beredning (tillval) Figur 1 (30 min prep, 5 min per mus)
All kirurgi bör utföras med strikt aseptisk teknik med autoklaveras steril utrustning.
En donator mus kommer rekonstruera tre värdmöss.
- Bedöva mottagare NODscid möss och ställning, med bly för att skydda huvudet, inne i centrum av Gammacell 40 'Exactor' bestrålare.
- Bestråla NODscid möss med 2,5 Gy helkroppsbestrålning (TBI).
Kritiskt steg: Optimering av TBI kan behövas på grund av variation i dos som krävs för tillräcklig värdimmunsystemet cell utarmning i olika musstammar.
Pause: värdmöss kan bestrålas i förväg men bör användas inom 24 timmar för bestrålning.
- Euthanize donatormöss enlighet med de institutionella djurskötsel utskottets riktlinjer. Rengör bakbenen och ta skenbenet och lårbenet från båda, strippa all överflödig vävnad från benen (figurerna 1ai, 1aii).
Kritiskt steg: fibular ben är inte lönsamt för användning på grund av mycket smala lumen.
- Avlägsna ändplattor från båda ändar av fyra extraherade ben och spola ut dem med hjälp av en 22 G nål och 1 ml steril PBS tills de är vita till utseendet (Figur 1aiii). Referens Tabell 2.
- Blanda den extraherade benmärg (BM) suspensionen väl och dra 300 ^ i tre 27 g tuberkulintest nålar. Extraherade BM bör innehålla ungefär 2 x 10 7 celler ochär tillräckligt för 3 värdmöss reconstitutions. Referens Tabell 2.
- Injicera suspensionen in i den laterala svansvenen hos tre tidigare bestrålade NODscid möss från steg 1.1 (fig 1b). Referens Tabell 2.
VIKTIGT: För att kontrollera sterilitet hos BM injicerade vi rekommenderar plätering resterande BM och kultur under 24 timmar för att kontrollera infektionen. Primära dödsorsaken vid denna punkt är infektion i de nyligen rekonstituerade mössen.
2. Intrakraniell Window Generation - Figur 2 (30 min per mus)
All kirurgi bör utföras med strikt aseptisk teknik med autoklaveras steril utrustning och under en värmelampa för att hålla djuren varma (Figur 2A).
- Bedöva mottagande NODscid möss med IACUC godkänd bedövningsmedel, Avertin IP-injektion på 0,5 mg / g och position, med bly för att skydda huvudet, inne i mitten avGammacell 40 'Exactor' irradiator. Avlägsna hår från hårbotten. Dessutom tillämpas tår gel för att förhindra hornhinnan uttorkning.
- Rengör hårbotten först med betadinlösning och sedan med alkohol, sedan göra ett snitt från mittpunkten av öronen till strax ovanför ögonen. Avlägsna hårbotten 3 mm på vardera sidan av det första snittet, exponera skallen och landmärken i skallen ytan (Figur 2BI).
- Höj benhinnan genom att injicera 2% lidokain: adrenalin-lösning och dissekera bort från skallen ytan (Figur 2Bii).
- Använda 2.7 mm trephine borr, försvaga en 2,7 mm cirkel av skallen över cortex av den högra hjärnhalvan mellan lambda och bregma. INTE penetrera benet med borr (figur 2Biii). Referens Tabell 2.
Kritiskt steg: Om borren går genom skallen hjärnans yta skadas påverkar resultatet med ytterligare trauma. Dessutom överdriven blödning uppstår förhindra en tydlig fönster från att genereras.
- Ta den försvagade benfliken med dissektion pincett och tandvård krok och avsiktlig men kontrollerad kraft (figur 2Biii).
- (Valfritt) Om du tittar på tumörpatologi, injicera utvalda tumörcellinjer (med fluorescerande reporter gen) i mitten av fönstret som genereras i steg 2.5.
- Fyll 10 l 30 G Hamilton spruta med cellsuspension och belastning nål i en stereotaktisk ram.
Kritiskt steg: Cellantalet kommer att behöva optimeras för tumörceller i användning och tidslinje som krävs tillväxt. För U87 kulturer använder vi 2 x 10 5 celler i 10 ^ per mus. - Ladda musen på den digitala stereotaktisk ram rikta nålen till mittpunkten av den genererade fönstret.
- Sänk nålen tills den rör bara den kortikala ytan och återställa digitala koordinater.
- LågER nålen till 3,2 mm i kortikal vävnad och injicera på 3 mm djup.
- Dra tillbaka nålen långsamt sedan bort musen från ramen.
Kritiskt steg: Injicera lösningen under hela 1 minut och låt nålen i läge efter injektion för att säkerställa minskad baksug.
Kritiskt steg: Om mindre blödning uppstår vattna med steril saltlösning i 1-5 minuter för att stoppa ytliga blödningar. Fortsätt med följande steg.
- Fyll 10 l 30 G Hamilton spruta med cellsuspension och belastning nål i en stereotaktisk ram.
- Fukta hjärnans yta med en droppe steril PBS för att hålla hjärnvävnaden bevattnas.
- Float en 3 mm täckglas på hjärnans yta att täta fullt runt 2,7 genererade mm fönster. Referens Tabell 2.
- Torr omgivande skallbenet sedan ansöka Vetbond på hela exponerade skallen att återförsluta hårbotten vävnad till skallbenet och täckglaset på plats. Gäller inte ett överskott eftersom det kommer att läcka in under glaset och minska avbildning potential.
- Mix färska dentala akryl pulver och lösning, ungefär 30% (w / v), och applicera över toppen av Vetbond. För att säkerställa en tät förslutning överlappa akryl något på glaset täckglas kanten (figur 2Biv). Referens Tabell 2.
VARNING: Dental akryl är extremt farligt så vi rekommenderar användning av handskar och mask under hela förfarandet.
Kritiskt steg: Dental akryl måste förbli smidig under gjutningen för att säkerställa en god tätning och minska överskottet. Bygg upp i akryl på fönstret kommer suddiga bilder.
- Tillåt möss att återhämta sig i en varm bur.
Tre. Stereotaktisk strålbehandling (tillval) - Figur 3 (25 min per mus)
Variationer kommer att finnas i de olika irradiators som används och som sådan optimering kommer att krävas. Vi använde en specialdesignad irradiator.
- Bedöva mössanvända isofluran vid 4% för induktion följt av 1,5-2% under hela förfarandet med 0,5-1 liter O 2 en min, och plats på anpassade huvudet restrainer inuti stereotaktisk irradiator (Figur 3AI).
- Skaffa en 360 ° cone beam CT med röntgenröret körs på 40 kVp och 0,05 mA genom en 2 mm aluminium filter. Använd bilden för att styra rörelsen av scenen, rikta strålningen isocentre till den högra hjärnhalvan säkerställer att det är centralt i ryggfena riktning.
- Sätt i hemisfäriska kollimatorn, 8 mm x 11 mm blocket.
Kritiskt steg: kollimatorer kan utformas för många olika uppställningar och så kan förbättras för att inkludera och exkludera olika delar av hjärnan. 8 mm x 11 mm definierar en hemisfärisk område av hjärnan.
- Erhålla enkelsträngat CT ortogonala bilder både från toppen (AP) och botten (PA) genom kollimatorn för att ytterligare förbättra placeringen av hjärnan, anatomical benstrukturer kan användas för reproducerbarhet.
- Exchange aluminium filter för en 0,93 mm koppar behandling filtrera och administrera hälften av den önskade stråldosen med röntgenröret körs vid 225 kVp och 13 mA från toppen i en AP-riktning.
- Återgå portal till bottenläget och administrera andra hälften av stråldosen igen med röntgenröret körs vid 225 kVp och 13 mA bildar botten i en PA riktning.
Kritiskt steg: Det är viktigt att bestråla från både toppen och botten för att minska RT gradient genom hjärnvävnaden, det också stöd med anpassningen av isocentre till mitten av hjärnan.
4 In vivo Två Photon lasermikroskopi -. Figur 3 (1-3 tim per session)
Variationer kommer att finnas i de olika mikroskop som används och som sådan optimering kommer att krävas. Vi använde en Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal Mikroskop.
- Bedöva möss med IACUC godkänd bedövningsmedel, Avertin IP injektion på 0,5 mg / g och rena fönster med alkohol spray.
- (Valfritt) Injicera taggade vaskulär färgämne 5-10 min före avbildning, i svansvenen före avbildning. Alexa647-dextran användes vid 0,35 ng / g eller APC-CD31 användes vid 0,2 ng / g. Se tabell 2.
- (Valfritt) Injicera Fluorescein via svansvenen vid en dos av 7,7 mg / kg, 5 min före avbildning, att avgränsa tumören. Referens Tabell 2.
- Setup kanaler på konfokalmikroskop som bestäms av fluorokromen som används i den genererade chimära musen. Tabell 1 visar de kanaler som beskrivs i den här modellen.
- Vänd musen på den rörliga mikroskop scenen och stabilisera huvudet i läge med formbar modellera. (Figur 3Aii) Referens Tabell 2.
- Slå på första kanalen laser och använda för att placera i mitten av ICW.
- Använd 5x lins och ta en bild av hela fönstret för att använda som en karta för ytterligare mer högupplösta bilder.
- Undersökningen bör utföras med 10X och 20X "lång räckvidd" linser för att få den bästa bildkvaliteten.
Kritiskt steg: Kanaler och mål på 2PLM bör inrättas med bearbetade celler in vitro före avbildning av musmodeller för att säkerställa att de markera korrekt fluorokromen.
| Fluorokrom | GFP | GFP / Fluorescein / FITC | mCherry / RFP / DsRed | APC / Alexa647 | SHG autofluorescens |
| Excitation laser | 458 nm | 488 nm | 543 nm | 633 nm | Chameleon laser 820 nm |
| Uppsamlingsfiltret | 480-520 nm | 500-550 nm | 565-615 nm | 650-710 nm | 390-465 nm |
Tabell 1. Fluorkrom inställningar. Guider för användaren att se den excitation laser och emissionsspektra samlare som används för var och en av de kanaler som finns i modellen.
Representative Results
Det valfria steget för beredning av den BM av NODscid möss bör resultera i en 80% upptag av fluorescerande "givare" BM i 100% av NODscid "värd" möss, kommer dock optimering av TBI krävas för att förbättra beredningen i andra icke -immunocompromsed stammar. Om möss misslyckat rekonstituerade de kommer att bli sjuka och dö snabbt efter proceduren, kan försvagade möss kräva ytterligare mat och vattenkällor.
ICW gång klar ska se ut som visas i figur 2Biv. Det är idealiskt att ha en ås av akryl omger glaset täckglas då detta ger styrka till koppling med skallen. Perfect fönster är reproducerbara och möjliggöra upprepad avbildning för upp till 8 veckor efter sin generation (figur 2C). Images produceras genom dessa optimala fönstren kommer se ut som de som ses i Figur 3BI. Brister i fönstret generation kommer att producera bilder av fattigakvalitet till exempel, kommer luftbubblor under fönstret förhindra hela synfält som avbildas, kommer områden är mörka eftersom luften förhindrar laseravbildning (Figur 3Bii). Med överflödigt lim och akryl på täckglas kommer det att finnas en hög nivå av bakgrund fluorescens och delar av området som utplånade som ses i figur 3Biii, Likaså om det finns smuts på fönstret små prickar av bakgrundsfluorescens kommer att vara synlig i fält (figur 3Biv).
Framgång för ICW avbildning är förutbestämt av integritet kirurgisk teknik, men kan även optimala ICWs stöter på problem under avbildning session. Som sådan finns det en rad och grad av klarhet i de bilder som genereras såsom visas i fig. 3. Publikationen bildkvalitet porträtteras i figur 3C uppstår när allt är optimalt. Även om det inte är möjligt för alla möss, är det möjligt att förvänta sig 80% av bildens genererade att se ut så här. En av de stora bristerna i den nuvarande mikroskopi inställning är att använda inverterade lasrar. Möss måste placeras på ryggen och detta resulterar i överdriven stress och obehag som kan leda till ansträngd andning under avbildning. Detta ger en "fodrade" bild som andningen stör medelvärdesbildningen som uppstår under avbildning, varvid, varje pixel rad avbildas fyra gånger och medelvärdet av fyra visas i den slutliga bilden. Varje förflyttning under utjämning, såsom den som orsakas av ansträngd andning, kommer att skapa en artefakt som visas som en linje på bilden, såsom visas i fig 3D. Möss som inte är tillräckligt bedövad under avbildning kan stöta på detta problem också. Den "fodrade" effekt kan minskas genom att begränsa bilden genomsnitt till den, men detta kommer i sin tur minskar bildkvaliteten och kan inte eliminera problemet. Alternativt möss kan flyttas eller retried när andningen har normaliserats. Användningen of En upprätt 2PLM skulle förneka detta problem som möss kunde avbildas "i liggande position". Ett ytterligare problem med avbildning på ett inverterat 2PLM innefattar den begränsade tillgängligheten för positionering av ICW när musen är på mikroskop, och detta leder till "segmenterade" bilder som de som ses i Figur 3E. Här lasern och täckglas inte står vinkelrätt mot varandra och som sådan avbildning inträffar vid en vinkel. Detta resulterar i alstringen av en "segmenterad" bild där sidorna av synfältet inte är avbildade. Problemet löses lätt med ompositionering av musen för att säkerställa täckglas är helt horisontell gång på huvudfästet såsom framgår av fig. 3Aii.
Den modell som presenteras här var specifikt används för att undersöka betydelsen av BMDCs i vaskularisering av tumörvävnad och visar förmåga att använda tre olika kanaler samtidigt (Cherry, GFP, Far-röd - Alexa647 och APC) making den gemensamma fiskeripolitiken och SHG överflödiga för just denna berättelse. Vi kunde avbilda möss längdriktningen för upp till 8 veckor, studera rekrytering och integrering av BM-celler i kärlsystemet på en enda cell nivå, utan några skadliga effekter orsakade av fönstret. Denna modell visar hur lätt samla dynamisk information om källan och bildning av blodkärl och samspelet mellan olika celltyper av intresse, tidigare förlorade genom slutpunkt histologisk analys.
| Steg | Problem | Resonemang | Lösning |
| 1,4 | Bone splittra | Blunt verktyg | Samla benmärg bildar en ny mus med vässade saxar eller färska skalpell blad, kommer benfragment hämma TV injektion |
| 1,5 | Låg extraktion (låg viscosity) | Bone ändskivorna klippa för distalt, dålig insamlingsmetoden | Bones bör klippas så proximalt som möjligt och samlas med benet inuti provröret för att förhindra stänk tillbaka Tid bör användas för att extrahera BM maximalt och med omsorg Om det behövs pool mer än en mus i 1 ml |
| Hög Extraction (hög viskositet) | Låg samling buffert | Späd ut lösningen med extra 0,1% BSA, dela till tre mottagare möss upp till 500 l per mus maximal | |
| 1,6 | Bad Intravenös injektion | Dålig vasodilatation och fartyg synlighet | Förbättra dilation med värmelampa. Placera musen i svansen ven restrainer med inbyggd ljuskälla för att underlätta tillgången |
| 1 | Möss Sjuka | Infektion | Offra möss enligt institutionens regler. Säkerställ svansar städas före injektion och kontrollera sterilitetextraherat BM i kultur |
| Möss dör | Dåligt BM upptag | Kontrollera% av fluorescerande BM upptag av död mus. Optimera TBI för stam av möss som används Öka mängden BM injektion (t.ex. användning en donator mus för två mottagare) | |
| 2,4 | Minor blödningen | Dura brutit under borrning | Trycket med gel pads och fortlöpande steril koksaltlösning tvätt |
| Större blödningar | Hjärnan skadas av borrning | Offra mus enligt institutionens riktlinjer | |
| 2,8 | Luftbubblor enligt täckglas | Dålig kontakt med kortikala ytan förhindrar korrekt placering | Ta bort täckglas och lägg extra PBS flyta täckglas på fönstret för att ta bort bubblor |
| 2,10 | Glidning av täckglas under limning | Acrylic massa är tung, ökat trycket på täckglas och flyttar täckglas ur vägen | Pincett bör användas för att hålla täckglaset ner medan Vetbond och akryl appliceras |
| 4,2 | Bad Intravenös injektion | Dålig vasodilatation och fartyg synlighet | Förbättra dilation med värmelampa. Placera musen i svansen ven restrainer med inbyggd ljuskälla för att underlätta tillgången |
| 4,4 Fig. 3C | "Fodrad" bilder | Ansträngd eller oregelbunden andning | Ta bort musen från ramen och tillåter att återvinna Öka nivån av narkosmedel administreras och justera positionen för att säkerställa halsen är inte alltför böjd eller utvidgas till att förhindra andning |
| Fig. 3C | "Segmenterad" image | Hjärnan är inte parallell med mål | Justera positionen av täckglas för att det är platt |
| Vessel visualiseras inte | injektion sett inte intravaskulärt | Gör om injektion i alternativa svansvenen, varm svans för att säkerställa god vasodilatation | |
| Hög bakgrund | Dirty täckglas, Luftbubblor Akryl | Torka täckglas med fuktig 70% etanol trasa, inte blöt inte som kan tränga in under akryl och skadar hjärnvävnaden |
Tabell 2. Felsökning. En riktlinje för korrigerande åtgärder som krävs för problematiska områden i förfarandena.
Schemata 1. Experimentell flödesschema. Detta visar tidslinjen för händelser genom experimentella steg 1-4. Musmodeller är inställda under en vecka, för attsäkerställa BM rekonstituerar ordentligt, och inte behandlas med läkemedel till dag 7 av tumören för att se tumören transplantat. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 1. BM Rekonstitution. (A) BM extraktionsprocedur i.. Dissektion av bakbenen ben. Ii. Dissekerade lårben och skenben från bakbenen, rengjorda och redo för extraktion. III. Bones med ändplatta bort och spolas igenom, visar den vita utseende av de tomma ben. (B) visar schemata där laterala vener för injektion är placerade i svansen.
Figur 2. ICW generation. (A) Aseptisk inställning rekommenderas (B) i. Exponerad skallen ytan avslöjar de landmärken som krävs för operation, ska ICW placeras på den högra hjärnhalvan lika långt från bregma och lamda. Ii. Periostieum lyfts med lidokain-lösning, färdig för avlägsnande . iii. Dental krok behövs för borttagande av benet fragment som alstrades med borr. iv. Färdig ICW med dental akryl. (C) Tre exempel fönster visar metodens reproducerbarhet.
Figur 3. 2PLM förväntade resultat. Samtliga bilder visar grönt BM, röd tumör, Blå (pseudo färgat långt rött) kärlsystemet. (A) i.. Demonstrerar huvudet ram som behåller isofluran flöde inuti litet djur bestrålare. Den 8 x 11 mm koUimator kan också ses flytta runt genom portalen. Ii. Mouse i inverterat läge i huvudet ram som krävs för avbildning, säkerställer formbar plastercine alla fönster kan rymmas. (B) demonstrativa bilder av resultaten av problemen med fönstret generationen från i.. ett optimalt fönster, ii. ett fönster med luftbubblor fastnar undertill, iii akryl spill över täckglaset och IV. smuts på fönstret själv. (C) betonar de problem som uppstår med avbildning efter framgångsrika generationen av en ICW i.. optimal avbildning ii . andning artefakterskapa en "fodrade" image III. täckglas inte vinkelräta mot lasern genererar en "segmenterad" bild. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Funktionella användningsområden och anpassningar av modellen. (A) GFP post bildbehandling där GFP bilden subtraheras från GFP bilden för att avslöja den sanna GFP bild som kan överlagras de andra tre kanalerna i vitt. Grön BM, Red tumör, vit CSCs, Blå (pseudo färgad långt rött) kärlsystemet (B) Demonstration av kollagen fibrer som kan avbildas med SHG. Grön dextran, röd BM, Cyan Collagen (C) i.. VEGFTrap celler i VITRo visa GFP alstras med VEGFtrap. ii. In vivo imaging demonstrerar VEGFtrap cellerna tydligt och dessutom belyser hur lätt byta kanal för att demonstrera systemet du tittar på. Grön VEGFTRap + Tumör, röd BM, Blå (pseudo färgad långt rött) kärlsystemet. (D) visar att insamlingen av fluorescein i stroma i tumören och inte i cellerna direkt, framgår av bristen på grön signal overlay med röda tumör. Grön fluorescein, Red tumör. Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
De tre kanaler som beskrivs i alla bilderna hittills är utbytbara för tre markörer av intresse i andra modeller och blad forskare med en ovärderlig uppsättning verktyg för att söka ett flertal celltyper och interaktioner. Planering krävs för att säkerställa att alla markörer och celltyper framgångsrikt har integrerat en molekyl reporter fluorescens i en tydlig kanal.
Förutom de vanliga tre kanaler som används här kunde vi också integrera en fjärde GFP-kanal (figur 4A) och en SHG baserad kollagen kanal 7 (Figur 4B). Detta förlänger möjligheten att titta på cellulära interaktioner in vivo och dessutom tillåter användaren att göra befolkningen blandning för att studera specifika cell-cell interaktioner samtidigt behålla två kanaler för andra markörer. Till exempel har vi tittat på tumörceller (RFP) och cancer stamceller (GFP) i ett förhållande av 01:03 med ett intresse att jämföra deras intratummuntliga interaktioner (Figur 4A). Vi konstaterade att 7 dagar efter implantation av den blandade befolkningen förhållandet bifölls och båda cellpopulationerna kan fortfarande ses.
Den gemensamma fiskeripolitiken kanal ger tekniska problem på grund av överlappningen med GFP-kanalen i både excitation och emission spektra och som sådan kräver inlägget bildbehandling för att definiera den sanna GFP + celler från dem som faktiskt GFP +. Post bildbehandling kan utföras på 2-photon mikroskop byggda i Zeiss LSM programvara direkt där, är GFP bilden subtraheras från den gemensamma fiskeripolitiken bilden resulterar i sann GFP cellerna kvar (Figur 4A). Utgångspunkten för förhållandet subtraktion är beroende av lika ljusa bilder och beror på att den gemensamma fiskeripolitiken laser (458 nm) fluorescerar både GFP och celler GFP medan GFP laser (488 nm) är för hög för att fluorescerar den gemensamma fiskeripolitikens cellerna. Förutom att den gemensamma fiskeripolitiken har vi också kunnat använda tidigare publicerade inställningar för att titta på SHGnivåer och så skildra de kollagenfibrer som utgör basalmembranet omger vaskulatur, (figur 4B).
En annan anpassning av denna modell har utnyttjat en specialbyggd litet djur irradiator som har förmågan att använda stereotaktisk strål att bestråla delar av vävnaden så små som 2 mm i diameter. Genom att rikta fönstret med bestrålning är det möjligt att titta på effekten strålningen har på den underliggande vävnaden. Vi har nyligen publicerat en studie som undersöker effekten strålningen har på normal hjärnvävnad med avseende på rekryteringen av BMDCs till kärlsystemet, tittar specifikt på sin roll efter förändringar strålning vävnad. Vi fann att rekryteringen av BMDCs var både tid och dosberoende i normal vävnad 11.
Det är möjligt att studera mekanismerna för leverans och integration av terapeutika som tillhandahåller läkemedlet är märkt med en fluorescerande markör. Undervår forskning har vi kunnat spåra produktionen av VEGFTrap, en anti-angiogen läkemedel som blockerar alla VEGF-signalering i det lokala området för produktion 25. Genom att genetiskt modifiera våra tumörceller att uttrycka VEGFtrap genen tillsammans med en IRES till EGFP (Figur 4Ci) och använder RFP "givare" BM vi kunde avbilda EGFP: VEGFtrap produktion, BMDC interaktion och kärlsystem samtidigt (Figur 4Cii). Detta visade mångsidighet av modellen och kanaler tillgängliga. Det är också tänkbart att titta på kinetiken hos läkemedlet på grund av löftet om encelliga upplösning. Fluorescein (GFP +) används för att avgränsa tumörer under kirurgi för att säkerställa maximal resektion uppnås 26. Genom att injicera intravenöst medan avbildning är det möjligt att visa att avgränsningen sker inte genom aktivt upptag av fluorescein i tumörcellerna själva, utan istället genom insamling av läkemedlet i stromal området med time, sett av bristen på co-lokalisering 10 min efter injektion av den Fluorescein (Figur 4D).
Övergripande vår strategi kombinerar nya och befintliga tekniker för att uppnå en unik experimentell plattform, vilket är fördelaktigt i studiet av dynamiska cellulära interaktioner. Denna strategi har visat sig vara en ovärderlig metod för att pröva högupplösta encelliga dynamisk utveckling BMDC, tumör och normal hjärna vaskularitet svar på terapi, intrakranialt. Intravital bildbehandling kan ge en bättre förståelse för de molekylära regulatorer av BMDC rekrytering, migration och differentiering i intrakraniell hjärntumör kärlsystemet liksom många andra dynamiska processer anpassas till andra forskningsområden. Hämmande förmodade faktorer som reglerar BMDC i kombination med andra terapeutiska strategier kan underlätta identifieringen av den exakta tidpunkten för kombinatoriska terapier. Dessutom kan denna strategi anpassas till många framtida projects utnyttjar inte bara in vivo intravital färgning färgämnen, men också små molekylära inhibitorer och nanopartiklar som fluorescerande är taggade låta forskare spåra distributionen och migrationsmönster av mer riktade terapier samt titta längdriktningen på deras kinetik.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Advanced optisk mikroskopi Facility vid Princess Margaret Hospital, i synnerhet James Jonkman för deras hjälp i den inledande installationen av kanaler på 2Photon mikroskop. Författarna vill tacka för den tid och rum Targeting och förstärkning av strålning svar (STTARR) programmet och dess närstående finansiärer. Vi tackar Dr Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael och Dr.Andras Nagy för att försörja de VEGFTrap plasmider och för sina handskrivna korrigeringar och feedbacken. Den fortsatta stöd och diskussion från personalen på BTRC har varit ovärderlig och vi vill Commemorate Dr.Abhijit Guha för hans vetenskapliga bidrag. Arbetet har finansierats av CIHR och NIH bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI | |
References
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
