Summary
Biz burada göstermek
Abstract
Periferik arter hastalığı olan hayvan modellerinde ön-klinik araştırma mikro teşvik etmek için tasarlanmış terapötik maddelerin etkinliğinin test edilmesinde bir rol oynar. Uygulama yoluna derinden bu ajanların 1,2 biyo ve etkinliğini etkiler, çünkü bu maddeler için dağıtım yöntemi seçimi önemlidir. Bu makalede, yerel bir kateterize ozmotik pompa kullanarak iskemik arka ayaklarında bir madde yönetmek nasıl gösterilmektedir. Bu pompa uzun bir süre boyunca sürekli olarak ayrılan sulu bir solüsyonunun bir şekilde sabit hacimli bir teslim edebilir. Ayrıca sol bacak içinde profunda femoris ve epigastrikan arterlerin kökeni proksimal femoral arter ligasyonu ile oluşturulan tek taraflı bacak iskemi bizim fare modeli sunuyoruz. Son olarak, Microfil, bir silikon radyoopak döküm maddesi ile infrarenal abdominal aorta ve bacak damar perfüzyon in vivo kanülasyon ve ligasyonu tarif. Microfil serpmek ve dolgu tüm vasküler yatak (arteriyel ve venöz), ve çıkış için büyük damar kablo bağlandı çünkü, ajan küçük numune mikro-CT 3 kullanımı ile gelecek ex vivo görüntüleme için damar muhafaza edilebilir olabilir .
Introduction
Periferik arter hastalığı (PAH) ve bacaklar 4 yetersiz kan akımı neden olan bir aterosklerotik hastalıktır. 8 ile 12 milyon Amerikalı etkiler ve mevcut tıbbi tedaviler sadece sınırlı rahatlama 5,6 sunuyoruz. Bacaklarda kan dolaşımını artırmak terapötik ajanlar sadece hastalığın ilerlemesini engellemek değil, aynı zamanda yaşam kalitesini artırmak olmaz. Genellikle yaşlı hastalarda görülen düşük böbrek ve karaciğer fonksiyon ilaç metabolizması azaltmak ve sistemik yönetimi ile yan etkileri artırabilir çünkü PAD insidansı 50 yaş üzerindeki kişilerde daha yüksektir, bu nedenle yerel farmakolojik tedavi daha arzu edilen bir tedavi yöntemidir.
Böylece, yerel olarak yönetilen ajanlar anjiyogenez ve mikrovasküler yeniden teşvik ederek bacak iskemi hafifletmek olmadığını incelemek için PAD bir fare modeli yarattı. Özellikle de, sürekli olarak terapötik maddeyi sunmak için bir kateter takılmıştır ozmotik pompa kullanıldığındafarelerin iskemik uyluk kas. Bizim dağıtım sistemi kullanarak, yerel ortamda ilacın optimum konsantrasyonu korumak başardık, bu yaklaşım, uygun ilaç biyoaktivitesi sağlar olası sistemik yan etkileri önler ve sistemik yönetimi ile ilgili sınırlı yerel uyuşturucu erişim dezavantajı üstesinden gelir. Ayrıca, yerel olarak yönetilen ajanlar revaskülarizasyon teşvik olmadığını değerlendirmek için, ileri döküm ve mikrovasküler değişiklikler ölçümü sağlayan yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanılır. Bununla birlikte, bu video makalede kullanılan metotlar kombinasyonu PAD hastalarda 7-9 farmakolojik revaskülarizasyon anlaşılmasına yardımcı olmak üzere ön-klinik çalışmalarda yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Astar Ozmotik Pompa
- Pompalar hazırlarken steril teknikler (örneğin eldiven, laminer akış kaputu) kullanın. Ambalajından pompa ve akış moderatör çıkarın. Boş pompa tartmak ve ağırlığı (mg) kaydedin.
- Küçük bir 1 cc şırınga ve künt uçlu 27G dolum tüpü kullanarak, hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için, yavaş yavaş pompa doldurun. Çözelti pompanın üst ulaştığında, dolgu dur.
- Aşırı çözüm silin ve dolu pompa tartın. En sulu çözeltiler için, mg olarak ağırlık ul hacmi ile aynıdır. Boş karşı dolu ağırlık farkı, belirtilen ortalama dolum hacminin% 90'dan fazla olmalıdır. Değilse, şırınga ve dolum ile tahliye pompası. , Teknik zorluk yaşarsanız lütfen http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html de pompa talimatlarının sorun giderme bölümüne bakın
- Akış moderat gelen beyaz flanş kırmak için forseps bir çift kullanınveya; tüp viraj veya ezmek için dikkatli olun. 3-4 mm hakkında kapsayan, moderatör ya da sonuna kadar bir P50 kateter takın. Kateter ve ekli moderatör girip kateterin distal kısmına takılı şırınga bırakmak için bir şırınga kullanın.
- Kateter pompa yüzeyi ile aynı hizaya gelene kadar pompa içine akış moderatör yerleştirin. Daha sonra, kateterin uzak ucundan şırınga çıkarın. Birinci ila 6 saat, en az (tercihen O / N), fare içine yerleştirilmeden önce pompası için bir 37 ° C inkübatör içinde bir steril% 0.9 tuzlu su çözeltisi içinde veya PBS pompa yerleştirin. Pompa doğum oranı model numarası (örneğin Model 1002 = 14 gün için 0.25 ul / saat). Göre değişir
2. Fare tek taraflı Hindlimb İskemi oluşturma
- 0.4 L / dk 'lık bir akış hızında% 100 O 2% 2-4 arasında izofluran grubu ile fareler anestezi ve depilato ile bacak ve arka bölgede (tercihen ameliyat öncesi gün) tüylerdenry krem.
- Ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler sterilize edin. Indüksiyon anestezi odasında fare yerleştirin. Bölüm 2.1 'de açıklanan aynı anestezi ayarları kullanın.
- Fare dışında uyaranlara olmayan duyarlı ve daha sonra izofluran sürekli bir akış (1.5-2.0%) sunan monte burun konisi ile işletim masaya yüzüstü pozisyonda yerleştirin kadar bekleyin.
- Kesi yerinde, anestezik önerilen doz (0.25% (<1 ml / kg) Bupivakain); enjekte% 70 etanol ardından povidon-iyot solüsyonu ile cilt tedavi. Arka (omurganın kenarındaki, scapulaların bölgede) bir 4-6 mm kesi yapmak. Ince forseps ile deri altı membran ayırın, sonra yatar pozisyonda fare açmak% 70 etanol takip ve medial uyluk doğru diz üstü mikro-cerrahi makas ile 0,8-1 cm kesi yapmak bir povidon-iyot solüsyonu ile cilt tedavi, femoral arter yolunu izleyerek.
- Yukarı tünelarkasındaki kesi medial uyluk küçük kılıf boru (6-Fransız) ile gövde yan.
- Yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin. PBS çözeltisi ile astarlanmış ozmotik pompa / kateter çıkarın ve uyluk için kılıfın tüp aracılığıyla, kateter kılavuz.
- Içeri pompa yerleştirin ve 6-0 prolen sütür (% 70 etanol ardından povidon-iyot solüsyonu ile cilt tedavi) ile arka kesi kapatın. Yatar pozisyonda fare geri yerlerde, uyluk kesiden maruz kateter bırakarak, kılıf boru çıkarın. Ameliyat bandı ile bacak elde edin.
- Damar ortaya çıkarmak için deri altı yağ dokusu ayırın. Daha iyi damar görselleştirmek için, kesi açmak için bir retraktörü kullanın.
- Vasküler paket erişmek için ince sivri forseps kullanarak hafifçe Pierce membranöz femoral kılıf. Incelemek ve kasık yakın femoral ven ve sinir femoral arter ayırmak, neden özen eskiaşır kanama.
- Iki 8-0 prolen sütür bitişik femoral arter femur bifurkasyon (profunda femoris ve epigastrikan arterlerin kökeni) proksimalinde 2-3 mm kesmek için.
- Uygun uzunlukta kateter kesin ve maddenin hedeflenen teslim sağlamak için yüzeysel fasya bir 6-0 prolen sütür ile güvence, uyluğun anterolateral bölgeye ucu yerleştirin. 6-0 çalışan sütür ile bacak kesi kapatın. Analjezik son bir deri altı enjeksiyonu (buprenorfin, 0.1 mg / kg) yönetmek,% 70 etanol ile izlenen bir povidon-iyot çözeltisi ile cilt tedavi ve kafesine geri fare. Kurtarma sırasında bir ısıtma lambası kullanın.
- Bir 30 dakika geri kazanım süresinden sonra, bacak iskemisi oluşturulması teyit etmek için lazer Doppler görüntüleme için fare hazırlamak.
- Günde iki kez ameliyat sonrası 5 gün için hayvan izleyin. Hayvanın hareketliliği ağrı analiz etmek görülecektir, kafeste atık bir indic olarak görev yapacakyeme ator. Hayvan ağrı veya rahatsızlık yaşanıyor Ayrıca, monitör dönemde belirlemek ve günde iki kez Buprenorfin (0.1mg/kg) bir deri altı enjeksiyon vermek.
3. Görüntüleme Numune Hazırlama
- Bölüm 2.1 'de belirtildiği gibi fare anestezisi. Yatar pozisyonda ameliyat masasına üzerine fare aktarın. Subkutan damar pıhtılaşma önlemek için heparin 1000 IU enjekte edilir. Fare roket ucu konisi takılı ise, göğüs boşluğu ve alt karın ortaya çıkarmak için yeterince büyük bir kesi yapmak. Infrarenal abdominal aort (IAA) ortaya çıkarmak için hayvanın sol tarafına karın içi organların hareket ettirin. Alt kava damardan aort dikkatle ayırın.
- Kateter yerleştirme sırasında kanamayı azaltmak için proksimal IAA Arter. Daha sonra, IAA küçük bir kesi yapmak. IAA içine ½ G künt bir iğne (bir P10 kateter bağlı) bir 27 takın ve 6-0 sütür ile sabitleyin.
- Dolgu ikiHeparinize tuzlu su ve% 10 nötr ile 20cc şırınga (NBF) tamponlu formalin. Bir kontrast radyoopak silikon kauçuk bileşik ile bir 5cc şırınga doldurun. PD-seyreltici: 1:1.25:0.5 çalışma oranlarında PD-sertleştirici madde PD-bileşiğinin üç maddeler karıştırın. Ajan polimerize önce karışımı (Microfil) sadece 20 dakikalık bir çalışma süresi olduğundan, damar içine enjeksiyon hemen önce kadar MV-sertleştirici eklemek için tavsiye edilir.
- Sağ atrium bir kesim yapmak ve ötenazi ikna etmek ve aşırı sıvı drenajı sağlamak için izofluran aşırı dozda yönetmek. Iğne ucu için tuzlu dolu şırınga takın ve 5 dakika boyunca damar temizlemek için başlar. Tüm kan damarlarının dışarı kızarmış olduğundan emin olun, izofluran kapatın ve yıkama başladıktan sonra roket ucu konisi çıkarın. Daha sonra, yukarıda ayrıntılı olarak kateter (3.2) ve ilave 5 dakika boyunca basıncı serpmek için formalin şırınga takın. Son olarak, kontrast, son şırınga serpmek5 dakika boyunca yavaş yavaş fare içine bir madde.
- İsteğe bağlı: Fotoğraf bir kamera ile damar Microfil sadece arter yapısı perfüze emin olmak için.
- 4% 10 NBF ve mağaza ° CO / kontrast madde polimerizasyon N dolu bir kap içinde fare yerleştirin. 24 saat sonra, diseksiyon araçlarını kullanarak gövde alt yarısı (alt abdominal aort ligasyonu distalinde) üzerindeki deri kaldırmak% 10 NBF yenilemek ve oda sıcaklığında 4 gün daha kaba geri fare yerleştirin.
- Kontralateral ve iskemik arka ayakların ayır ve kemik dekalsifikasyon kolaylaştırmak için, 48 saat boyunca bir formik asit solüsyonu (Cal-Ex II) 'de örnek yerleştirin. Daha sonra, 1 saat ve 10% NBF dönmek için akan suyun altında örneklerin yıkayın ve Faxitron (x-ray sistemi kemik dekalsifiye sağlamak için kullanılan) ve mikro-BT görüntüleme ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Animasyon protokol ayrıntılı ozmotik pompa ekleme ve bacak iskemi cerrahi göstermektedir. Şekil 1 iskemi teyit hindlimb perfüzyon lazer Doppler görüntüleri gösterir. Microfil vasküler Döküm işleminden sonra, damar ağının bir 3D mikro CT görüntüsünde Microfil (Şekil 2A) etkin gemiler doldurabileceği gösterir, ancak bu süreksizlik (örneğin, hava kabarcıkları, eksikliği çeşitli usule faktörlere bağlı olarak (Şekil 2B) oluşabilir Microfil basınç, viskozite).
Animasyon Legend
- Yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin ve geri omurga kenarındaki bir kesi yapmak.
- Küçük arka kesi Açığa.
- Yatar pozisyonda fare yerleştirin ve medial uyluk de diz üstünde küçük bir kesi yapmak.
- Cilt ayırın, damar ortaya, ve mous yan gövde yukarı kılıf boru takınArka kesi e.
- Ozmotik pompa alın ve kılıf boru içine kateter yerleştirin.
- Yatar pozisyonda fare yerleştirin ve uyluk kesi için boru ile kateter aşağı yol.
- Yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin ve sırtında pompa yerleştirin ve kesi kapatın.
- Yatar pozisyonda fare yerleştirin ve kılıf boru çıkarın.
- Bir retraktör ile cilt geri çekin ve arterden ven ayırmak için mikrocerrahi araçlarını kullanın. Sütür ile femoral çatallanma üzerinde femoral arter Arter çift.
- Uyluğun yüzeysel doku için kateter elde edin.
- Sütür ile bacak kesi kapatın.
Şekil 1. Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme ile bacak iskemi Onay. Temsilcisi Doppler görüntüleri show fare bacak femoral arter cerrahi ligasyon önce ve sonra kan akımında. Iskemi (oklar bakınız) sol bacak yılında kuruldu.
Şekil 2. Microfil ile bacak damar 3D Mikro-CT görüntü. Vasküler döküm bacak (A) boyunca damarları ve arterler bir ağ ortaya koymaktadır. Microfil süreksizlik da (B), ayrıntılı bir damar ağının görselleştirme devre dışı (oklar bakınız) oluşabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bacak iskemisi, bir fare modelinde ozmotik ilaç / maddenin dağıtımı için bir yöntem sunulmaktadır. Buna ek olarak, biz damar ağının analizi için 3 boyutlu bir yeniden üretmek için Microfil kullanmış olduğu bir döküm tekniği açıklar.
Iskemi ya da şiddeti seviyesi arteriyel bağlanma / eksizyonu yapılır yere göre değişir. Biz profunda femoris ve epigastrikan arterlerin kökeni proksimal femoral arter bir çift ligasyonu oluşturulan, bu yaklaşımın distal bacak bir daha ciddi iskemi üretebilir. Ameliyat sonrası hayvanlar izlemek ve analjezik yerel yönetim tarafından ağrı kesici sağlamak için emin olun. Ayrıca, Microfil her zaman tamamen bacak damar serpmek olmayabilir. Bu nedenle, tüm kan heparinlenmiş salin perfüzyon sonrasında damar üzerinden durulanır sağlamak için önemlidir. Microfil eksik perfüzyon nedenleri bir eksikliği içerirpplied basınç veya Microfil uygun olmayan viskozite, her ikisi de Microfil bacak en uzak bölgelere ulaşmasını sağlamak için yeterli olabilir ve böylece tüm damar doldurur gerekir. Özellikle hayvan uygulama için seyreltici oranları: Bu sorunları çözmek için, bileşik ile 100 mmHg ve deneme tutarlı basınç uygulayın.
Arteriogenesis (önceden var olan teminat arter büyüme) incelemek için, ideal bir yaklaşım kollateral damarlar kan akışını yönlendirmek için derin femoral dal kökeni hemen distal femoral arter Arter etmektir. Ancak, bu işlem için yanıt fare suşları arasında yaygın olarak değişir, ve iskemi ölçüde (örneğin, C57BL / 6) bazı fare suşları yetersiz olabilir. Daha az şiddetli iskemik modeli, C57BL / 6 gibi ağır vaskülarize fare suşları tedavi edici etkilerini araştırmak için zaman uzun bir pencere sağlamayabilir. Bu sorunları önlemek için, bacak iskemi b oluşturulany iyi yerel uyuşturucu serbest etkilerini göstermek için daha ciddi bir iskemi oluşturulan proksimal femoral arter, bağlanarak, ancak bu yaklaşım proksimal derin dal kollateral damarlarda arteriogenesis analizi engeller. Bu nedenle, terapötik etkileri ilacın / madde serbest anatomik bölgeye (ön-yan uyluk) ile tutarlı olan distal iskemik bölgenin, esas olarak çizilir. Yerel kanama inflamasyon ve arteriogenesis ve anjiyogenez hem etkileyen ödem, yol açabilir, çünkü ameliyat sırasında, bu kırılgan femoral ven kesmemeye önemlidir. Biz streç, gerginlik ya da arter rüptürü önlemek için uygun bir düğüm kravat ile femoral arter Arter 8-0 prolen sütür kullanmanızı öneririz. Buna ek olarak, Microfil hızla enjeksiyon için teknik zorluklar yaratır, çünkü polimerize 3 maddeleri (bileşik, seyreltici ve sertleştirici madde) karıştırılarak (20 dakika içinde) hemen kullanılmalıdır. Daha önce sta gibiTed, Microfil her zaman başarılı küçük damar serpmek değil, doğru teknikleri uygulama ve kullanımı bu sınırlama üstesinden yardımcı olabilir.
Pompa dolgu hacmi ortalama dolgu hacmi% 90 üzerinde olmalıdır, değilse, ekstra hava pompası içinde sıkışıp alabilirsiniz. Ek teknik bilgiler yer almaktadır www.alzet.com . Buna ek olarak, Microfil maddesi, belirli bir uygulama için tercih edilen bir viskozitede olmalıdır, bileşiğe seyreltici oranında modifiye edilmesi gerekebilir böylece.
Bacak iskemi modeli son derece tekrarlanabilir ve PAD 10,11 için geçerlidir. Bu modeli terapötik maddeler arasında kararlı dağıtım bilgilendirici sonuçlar 2 elde etmek için gereklidir. Sonuç olarak, biz morfolojik yapıları görselleştirmek için kullanılan 3D görüntüleme tekniği fare damar incelenmesi için mükemmel bir araçtır ve studyi için güçlü bir sistem sağlarng vasküler patolojiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim. Tüm hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kuralları uyarınca yapılmıştır ve Houston Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Acknowledgments
Yazarlar editoryal yardım için, mikro-CT cerrahi yardım için görüntüleme, Edward TH Yeh, MD, ve Rebecca Bartow, Doktora ile yaptığı teknik yardım için MD Anderson Küçük Hayvan Görüntüleme Tesisi Keith Michel teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Amerikan Kalp Birliği tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
- Epstein, S. E., Fuchs, S., Zhou, Y. F., Baffour, R., Kornowski, R. Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic principles, early results and potential hazards. Cardiovasc. Res. 49, 532-542 (2001).
- Esaki, J., Marui, A., Tabata, Y., Komeda, M. Controlled release systems of angiogenic growth factors for cardiovascular diseases. Expert Opin. Drug Deliv. 4, 635-649 (2007).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, 1267-1279 (2002).
- Golomb, B. A., Dang, T. T., Criqui, M. H. Peripheral arterial disease: morbidity and mortality implications. Circulation. 114, 688-699 (2006).
- Hiatt, W. R. Pharmacologic therapy for peripheral arterial disease and claudication. J. Vasc. Surg. 36, 1283-1291 (2002).
- Hirsch, A. T., et al. Peripheral arterial disease detection, awareness, and treatment in primary care. JAMA. 286, 1317-1324 (2001).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9, 713-725 (2003).
- Hirsch, A. T., et al. ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (lower extremity, renal, mesenteric, and abdominal aortic): a collaborative report from the American Associations for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (writing committee to develop guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease)--summary of recommendations. J. Vasc. Interv. Radiol. 17, 1383-1397 (2006).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Losordo, D. W., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109, 2487-2491 (2004).
- Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. J. Appl. Physiol. 97, 773-780 (2004).
