Summary
Vi visar här den
Abstract
Preklinisk forskning i djurmodeller av perifer arteriell sjukdom spelar en viktig roll i att testa effektiviteten av terapeutiska medel som syftar till att stimulera mikrocirkulationen. Valet av leveranssätt för dessa medel är viktigt eftersom administreringsväg djupt påverkar bioaktiviteten och effekten av dessa medel 1,2. I den här artikeln visar vi hur lokalt för att administrera ett ämne i ischemiska bakben med hjälp av en kateter osmotisk pump. Denna pump kan avge en bestämd volym vattenlösning kontinuerligt under en tilldelad tidsperiod. Vi presenterar också vår musmodell av ensidiga bakdelen ischemi inducerad av ligering av den gemensamma femoral artären proximalt ursprung Profunda femoris och epigastrica artärer i vänster bakben. Slutligen beskriver vi in vivo kanylering och ligering av den infrarenala bukaortan och perfusion av bakben vaskulaturen med Microfil, en silikon radiopakt gjutning agent. Microfil kan BEGJUTA och fylla hela kärlbädden (arteriella och venösa), och eftersom vi har ligerades den större vaskulära ledning för exit, kan medlet bli kvar i kärlsystemet för framtida ex vivo imaging med hjälp av litet exemplar mikro-CT 3 .
Introduction
Perifer arteriell sjukdom (PAD) är en aterosklerotisk sjukdom som orsakar otillräcklig blodtillförsel i benen 4. Det påverkar 8-12.000.000 amerikaner, och aktuella medicinska behandlingar erbjuder endast begränsad lättnad 5,6. Nya terapeutiska medel som förbättrar blodcirkulationen i benen skulle inte bara begränsa sjukdomsförloppet men också öka livskvaliteten. Incidensen av PAD är högre hos personer äldre än 50 år, är så lokal farmakologisk terapi en mer önskvärd behandlingmodalitet eftersom nedsatt njur-och leverfunktion ses ofta hos äldre patienter kan minska läkemedelsmetabolism och öka biverkningarna med systemisk administrering.
Därför skapade vi en musmodell av PAD för att undersöka om lokalt administrerade agenter lindra bakdelen ischemi genom att främja angiogenes och mikrovaskulära ombyggnad. Specifikt använde vi en kateter osmotisk pump för att kontinuerligt leverera det terapeutiska medlet tillischemisk lårmuskeln av möss. Med vår leveranssystem, kunde vi behålla optimala koncentrationer av läkemedlet i den lokala miljön, detta tillvägagångssätt möjliggör lämplig drog bioactivity, undviker eventuella systemiska biverkningar, och övervinner nackdelen med begränsade lokala apotek tillgång förknippas med systemisk administrering. Dessutom, för att bedöma om lokalt administrerade agenter främja revaskularisering, använde vi oss av avancerad gjutning och högupplösta avbildningstekniker som möjliggör kvantifiering av förändringar i mikrocirkulation. Sammantaget är det en kombination av metoder som används i denna video artikeln användbar i prekliniska studier för att underlätta förståelsen farmakologiskt inducerad revaskularisering i PAD patienter 7-9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Priming den osmotiska pumpen
- Använd sterila tekniker (t.ex. handskar, laminärt flöde huva) vid upprättandet av pumparna. Ta bort pumpen och flödesmoderator ur förpackningen. Väg den tomma pumpen och notera vikten (mg).
- Fyll pumpen långsamt, för att undvika att skapa luftbubblor, med hjälp av en liten 1 ml spruta och trubbig spets 27G påfyllningsröret. När lösningen når toppen av pumpen, sluta fylla.
- Torka bort överflödig lösning och väg fylld pump. För de flesta vattenhaltiga lösningar, är vikten i mg densamma som volymen i il. Skillnaden i tomma kontra fyllda vikt bör vara mer än 90% av den specificerade genomsnittliga fyllvolymen. Om inte, evakuera pumpen med sprutan och fylla på. Om du upplever tekniska problem hänvisas till avsnittet Felsökning i pumpens anvisningarna på http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html
- Använd en pincett för att bryta den vita flänsen från flödet moderateller, vara noga med att inte böja eller krossa röret. Bifoga en P50 kateter till vardera änden av moderator, som omfattar cirka 3-4 mm. Använd en spruta för att fylla katetern och bifogade moderator och lämna sprutan fäst vid den distala delen av katetern.
- Sätt i flödesmoderator in i pumpen tills katetern är i jämnhöjd med pumpens yta. Ta sedan bort sprutan från den distala änden av katetern. Placera pumpen i en steril 0,9% koksaltlösning eller PBS-lösning i en 37 ° C inkubator i minst 6 h (företrädesvis O / N) för att prima pumpen innan implantera det i musen. Pumpens varierar med modellnummer (dvs. modell 1002 = 0,25 l / h under 14 dagar).
2. Skapa Ensidig bakdelen Ischemi i musen
- Söva möss med isofluran set mellan 2-4% i 100% O 2 vid en flödeshastighet på 0,4 L / min och ta bort hår (helst dagen före operation) på bakbenen och ryggen med en depilatory grädde.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg för kirurgi. Placera musen i induktion anestesi kammaren. Använd samma anestesi inställningar som beskrivs i avsnitt 2.1.
- Vänta tills musen är inte mottaglig för yttre stimuli och sedan placera den i liggande position på operationsbordet med en monterad noskon som ger ett kontinuerligt flöde av isofluran (1,5-2,0%).
- Injicera den rekommenderade dosen av bedövningsmedel (Bupivacaine, 0,25% (<1 ml / kg)) vid snittet platsen, behandla huden med en povidon-jodlösning, följt av 70% etanol. Gör ett 4-6 mm snitt på baksidan (vid sidan av ryggraden, i skulderbladen region). Separera den subkutana membranet med fin pincett, vrid sedan musen till ryggläge behandla huden med en povidon-jodlösning, följt av 70% etanol och gör 0,8-1 cm snitt med mikro-kirurgisk sax ovanför knät mot den mediala låret, Efter vägen för den femorala artären.
- Tunnel uppsidan av bålen med liten mantel slang (6-franska) från den mediala lår till snitt på baksidan.
- Placera musen i liggande ställning. Avlägsna den primade osmotisk pump / katetern från PBS-lösning och styra katetern, genom slidan slangen, till låret.
- Placera pumpen inuti ryggen och stänga den bakre snitt med 6-0 Prolene sutur (behandla huden med en povidon-jodlösning, följt av 70% etanol). Placera musen tillbaka i ryggläge, ta bort manteln slangen och lämnar katetem exponeras genom incisionen på låret. Säkra benet med kirurgisk tejp.
- Separera den subkutana fettvävnaden att avslöja kärlsystemet. För att bättre visualisera kärlsystemet, använd ett upprullningsdon att öppna snittet.
- Pierce membranösa femorala manteln försiktigt med hjälp finspetsig pincett för att komma åt den vaskulära bunten. Dissekera och separera femoralartären från lårvenen och nerv nära ljumsken, se till att inte orsaka exalltför stor blödning.
- Placera två 8-0 prolene intilliggande suturer att avbryta femoralartären 2-3 mm proximalt till den femorala bifurkation (ursprung profunda femoris och epigastrica artärer).
- Skär katetern till lämplig längd och placera spetsen på den anterolaterala området av låret, säkra den med en 6-0 Prolene sutur på ytliga fascia att säkerställa målinriktad leverans av ämnet. Stäng benet snitt med en 6-0 kör sutur. Administrera en slutlig subkutan injektion av smärtstillande (Buprenorfin, 0,1 mg / kg), behandla huden med en povidon-jodlösning, följt av 70% etanol och återgå musen till buren. Använd en värmelampa under återhämtning.
- Efter en 30-minuters återhämtningsperiod, förbereda musen för laser Doppler imaging att bekräfta skapandet av bakdelen ischemi.
- Övervaka djuret två gånger dagligen i fem dagar efter operationen. Rörlighet av djuret kommer att observeras att analysera smärta, avfall i buren kommer att fungera som en indictören av att äta. Även under bildskärmen perioden avgöra om djuret upplever smärta eller obehag och ge en subkutan injektion av buprenorfin (0.1mg/kg) två gånger dagligen.
Tre. Imaging Provberedning
- Bedöva musen som anges i avsnitt 2.1. Överför musen på operationsbordet i ryggläge. Injicera 1,000 IE heparin subkutant för att förhindra koagulering i kärlsystemet. Även musen är ansluten till noskonen, gör ett snitt tillräckligt stor för att exponera brösthålan och nedre delen av magen. Flytta bukorganen till vänster sida av djuret för att exponera den infrarenala bukaortan (lAA). Separera försiktigt aorta från inferior cava venen.
- Ligera proximala IAA att minska blödning under kateterinläggning. Sedan gör ett litet snitt på IAA. Sätt en 27 ½ G trubbig nål (fäst vid en P10 kateter) in i IAA och fäst den med en 6-0 sutur.
- Fyll två20cc sprutor med hepariniserad koksaltlösning och 10% neutral buffrad formalin (NBF). Fyll en 5cc spruta med en kontrast röntgentätt silikongummiförening. Blanda de tre ingredienserna i MV-förening: MV-spädningsvätska: MV-härdare i arbets förhållanden av 1:1.25:0.5. Sedan blandningen (Microfil) endast har en arbetstid på 20 minuter innan medlet polymeriserar, är det inte rekommenderat att lägga till MV-härdare tills precis innan injektion i kärlsystemet.
- Skär ett snitt i det högra förmaket och administrera en överdos av isofluran för att inducera eutanasi och för att möjliggöra dränering av överflödig vätska. Fäst saltlösning fyllda sprutan till nålspetsen och börja att spola vaskulaturen under 5 min. Kontrollera att allt blod spolas ut ur kärlen, stäng av isofluran och koppla bort noskonen när spolningen börjar. Därefter fästs den formalin-fyllda sprutan till katetern detalj ovan (3.2) och tryck BEGJUTA under ytterligare 5 min. Slutligen, BEGJUTA sista sprutan, med kontrastenagent, långsamt i musen under 5 min.
- Valfritt: Fotografera Microfil i kärlsystemet med en kamera för att säkerställa att endast den arteriella strukturen perfunderas.
- Placera musen i en behållare fylld med 10% NBF och förvara vid 4 ° CO / N för kontrastmedel polymerisation. Efter 24 timmar, ta bort huden på nedre halvan av bålen (distal till lägre bukaorta lige) med hjälp av dissektion verktyg, uppdatera 10% NBF, och placera musen tillbaka in i behållaren för ytterligare 4 dagar vid RT.
- Dissekera den kontralaterala och ischemisk bakben, och placera proverna i en myrsyralösning (Cal-Ex II) i 48 timmar för att underlätta urkalkning av benet. Sedan skölja proverna under rinnande vatten i 1 timme och återgå till 10% NBF och fortsätt med Faxitron (x-ray-system som används för att säkerställa benet urkalkade) och mikro-CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Animationen visar osmotisk pump insättning och bakdelen ischemi operation beskrivs i protokollet. Figur 1 visar laser Doppler bilder av perfusion av bakbenen, bekräftar ischemi. Efter vaskulär gjutning med Microfil, visar en 3D mikro-CT-bild av den vaskulära nätverk som Microfil kan fylla fartygen effektivt (Figur 2A) men att diskontinuiteter kan förekomma (figur 2B) på grund av olika processuella faktorer (t.ex., luftbubblor, brist på tryck, viskositet Microfil).
Animation Legend
- Placera musen i liggande position och göra ett snitt på dess baksida vid sidan av ryggraden.
- Exponera den lilla ryggen snitt.
- Placera musen i liggande ställning och gör ett litet snitt ovanför knät på den mediala låret.
- Separera huden, exponera kärlsystemet, och sätt i manteln slangen upp sidan torso mouse till baksidan snittet.
- Ta den osmotiska pumpen och in katetern i manteln slangen.
- Placera musen i ryggläge och styra katetern ned genom slangen till snittet i låret.
- Placera musen i liggande position och placera pumpen på dess baksida och stänga snittet.
- Placera musen i ryggläge och avlägsna höljet slangen.
- Dra tillbaka huden med upprullare och använda mikrokirurgiska verktyg för att separera venen från artären. Dubbelklicka ligate femoralartären ovanför femorala bifurkation med sutur.
- Säkra katetern till ytlig vävnad av låret.
- Stäng benet snitt med sutur.
Figur 1. Bekräftelse av bakdelen ischemi via laser Doppler perfusion imager. Företrädaren Doppler bilder show blodet perfusion före och efter kirurgiska ligatur av femoral artären i musen bakben. Ischemi skapades i vänster bakben (se pilar).
Figur 2. 3D Micro-CT-bild i bakdelen vaskulatur. Vascular gjutning med Microfil avslöjar ett nätverk av vener och artärer hela bakbenet (A). Diskontinuitet av Microfil kan också uppstå (B), vilket kopplar ur visualisering av en detaljerad vaskulära nätverket (se pilar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en metod för osmotisk läkemedel / ämne leverans i en musmodell av bakdelen ischemi. Dessutom beskriver vi en gjutning teknik där vi har använt Microfil att producera en 3D-rekonstruktion för analys av det vaskulära nätverket.
Nivån eller svårighetsgraden av ischemi varierar beroende på var den arteriella lige / excision görs. Vi skapade en dubbel lige i gemensamma femoralartären proximalt om ursprung profunda femoris och epigastrica artärer, denna metod kan ge en mer allvarlig ischemi i distala bakbenen. Var noga med att följa djuren efter operation och ge smärtlindring genom lokal administrering av analgetika. Dessutom kan Microfil inte alltid BEGJUTA lem kärlsystemet helt. Således är det viktigt att säkerställa att allt blod sköljs ut ur vaskulaturen efter perfusion av hepariniserad saltlösning. Orsaker till ofullständiga perfusion av Microfil inkluderar avsaknaden av enpplied tryck eller felaktig viskositet Microfil, måste båda vara tillräckliga för att säkerställa Microfil når de mest distala regionerna i bakbenet och därmed fyller hela kärlsystemet. För att lösa dessa problem, tillämpa konstant tryck på 100 mmHg och experimentera med föreningen: utspädande nyckeltal för det speciella djuret ansökan.
Att studera arteriogenes (pre-existerande säkerheter artär tillväxt), är den idealiska metoden att ligate femoralartären omedelbart distalt om ursprung djupa femorala grenen att omdirigera blodflödet till säkerheter fartyg. Emellertid varierar svaret på denna procedur mycket mellan musstammar, och omfattningen av ischemi kan vara otillräcklig i vissa musstammar (t.ex., C57BL / 6). En mindre allvarlig ischemisk modell får inte ge en förlängd fönster av tid att undersöka terapeutiska effekter i kraftigt vaskulariserade musstammar såsom C57BL / 6. För att undvika dessa problem, skapade vi bakben ischemi By ligera den proximala femorala artären, vilket skapade en mer allvarlig ischemi att bättre tydliggöra de lokala effekterna läkemedelsfrisättningsegenskaper, men utesluter detta tillvägagångssätt analys av arteriogenes i proximala djupa kärl gren säkerheter. Sålunda är de terapeutiska effekterna drogs främst från den distala ischemiska området, vilket är förenligt med den anatomiska läge (framsidan av låret) där läkemedlet / ämnet avges. Under operation, är det viktigt att inte skada den bräckliga lårvenen eftersom lokala blödningar kan leda till inflammation och ödem, vilket påverkar både arteriogenes och angiogenes. Vi rekommenderar att du använder 8-0 prolene suturer att ligate lårbensartären med en lämplig knut slips för att undvika stretch, stam, eller bristning av artären. Dessutom måste Microfil användas omedelbart (inom 20 min) efter blandning av de tre ingredienserna (förening, utspädningsmedel, och härdare) därför att den snabbt polymeriserar, vilket skapar tekniska svårigheter för injektion. Som tidigare staTed, inte Microfil inte alltid framgångsrikt BEGJUTA mindre kärlsystemet, men praxis och användning av rätt teknik kan bidra till att övervinna denna begränsning.
Pumpen fyllvolymen måste vara över 90% av den genomsnittliga fyllningsvolymen, om inte, får extra luft fastna inne i pumpen. Ytterligare teknisk information finns på www.alzet.com . Dessutom måste den Microfil medlet vara vid den föredragna viskositeten för en speciell tillämpning, så att förhållandet av utspädningsmedel som föreningen kan behöva modifieras.
Den bakdelen ischemi modellen är mycket reproducerbar och är tillämplig PAD 10,11. Den stabila tillförsel av terapeutiska medel i denna modell är nödvändig för att erhålla informativa resultat 2. Sammanfattningsvis är det 3D bildteknik vi använde för att visualisera morfologiska strukturer ett utmärkt verktyg för att undersöka musen kärlsystemet och ger ett kraftfullt system för studying vaskulära sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Alla djurförsök har utförts i enlighet med de riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Texas Health Science Center i Houston.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Keith Michel av MD Anderson Small Animal Imaging Facility för hans tekniskt bistånd med mikro-CT, Edward TH Yeh, MD, för kirurgisk hjälp, och Rebecca Bartow, PhD, för redaktionell hjälp. Detta arbete stöddes delvis av American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
- Epstein, S. E., Fuchs, S., Zhou, Y. F., Baffour, R., Kornowski, R. Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic principles, early results and potential hazards. Cardiovasc. Res. 49, 532-542 (2001).
- Esaki, J., Marui, A., Tabata, Y., Komeda, M. Controlled release systems of angiogenic growth factors for cardiovascular diseases. Expert Opin. Drug Deliv. 4, 635-649 (2007).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, 1267-1279 (2002).
- Golomb, B. A., Dang, T. T., Criqui, M. H. Peripheral arterial disease: morbidity and mortality implications. Circulation. 114, 688-699 (2006).
- Hiatt, W. R. Pharmacologic therapy for peripheral arterial disease and claudication. J. Vasc. Surg. 36, 1283-1291 (2002).
- Hirsch, A. T., et al. Peripheral arterial disease detection, awareness, and treatment in primary care. JAMA. 286, 1317-1324 (2001).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9, 713-725 (2003).
- Hirsch, A. T., et al. ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (lower extremity, renal, mesenteric, and abdominal aortic): a collaborative report from the American Associations for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (writing committee to develop guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease)--summary of recommendations. J. Vasc. Interv. Radiol. 17, 1383-1397 (2006).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Losordo, D. W., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109, 2487-2491 (2004).
- Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. J. Appl. Physiol. 97, 773-780 (2004).
