Summary
Vi rapporterer en effektiv og enkel metode til at isolere embryoner i de tidlige stadier af udvikling fra
Abstract
I blomstrende planter, udvikler fosteret inden for en nærende væv - endosperm - omgivet af de maternelle frø hinderne (eller frøskal). Som en konsekvens heraf er isolation af plante embryoner i de tidlige faser (1 celle til kugleformede etape) teknisk udfordrende på grund af deres relative utilgængelighed. Effektiv manuel dissektion på tidlige stadier er stærkt svækket af den lille størrelse af unge Arabidopsis frø og klæbeevne af foster til det omgivende væv. Her beskriver vi en metode, der giver en effektiv isolering af unge Arabidopsis embryoner, hvilket gav op til 40 embryoner i 1 time til 4 timer, afhængigt af den efterfølgende anvendelse. Fostre, der frigives i isolation buffer med lidt knusning 250-750 frø med en plastik pistil i en Eppendorf rør. Et glas microcapillary tilknytning til enten en standard laboratoriepipette (via en gummislange) eller en hydraulisk styret microinjector bruges til at indsamle embryoner fra dråber stedd på en multi-godt slide på en inverteret lysmikroskop. De nødvendige tekniske færdigheder er enkel og let omsættelige, og den grundlæggende opsætning ikke kræver dyrt udstyr. Embryoner indsamlet er egnet til en lang række efterfølgende anvendelser, såsom RT-PCR, RNA-sekventering, methylering af DNA analyser, fluorescens in situ hybridisering (FISH), immunfarvning, og reportergenassays.
Introduction
Embryo af blomstrende planter er omgivet af endosperm, en nærende væv afledt fra et andet befrugtning begivenhed. Både foster og endosperm er omgivet af flere cellelag i frøkappe. Kollektivt disse væv danner et frø, der udvikler inde i frugten. Således er vævs-og celle-specifikke analyser af Arabidopsis embryoner stærkt forringet grundet deres utilgængelighed. Ikke desto mindre, embryoer på det sene-kugleformede eller senere faser er forholdsvis godt modtagelig for manuel dissektion ved hjælp af fine wolfram nåle under stereomikroskop eller ved et let tryk på frøet ved hjælp af pincet til at udtrække dem. Sådanne teknikker succes blev anvendt til transcriptome eller epigenome profilering analyser, f.eks microarray hybridisering, bisulfit sekventering eller RNA-sekventering (fx 1-3). I modsætning hertil er fortsat undersøgelser af embryoner på zygote til tidlig kugleformede stadie teknisk udfordrende. Til dato har kun få undersøgelser reported transkriptom analyser på unge embryoer ved hjælp af enten laser-capture mikrodissektion (LCM) af embryonale væv fra faste frø afsnit 4 eller manuel udvinding af individuelle embryoer fra inden frø ved hjælp af fine værktøjer 5.. Men LCM udstyr ikke almindeligt tilgængelige og manuel embryo udsugning på tidlige stadier er tidskrævende og kræver gode dissektion færdigheder, som er ikke er let omsættelige. Ud over at genom-dækkende analyser findes på stedet genekspressionsanalyse også svært at udføre på unge, hel-mount embryoner fra Arabidopsis. Til en vis grad kan unge embryoer frigives mikroskopobjektglas ved let tryk på frøene og anvendes til reportergenassays eller protein detektion ved immunfarvning (se for eksempel 6,7). Denne teknik er imidlertid ikke tillader high-throughput embryo isolation, hvilket hindrer kvantitative analyser.
Derfor har vi udviklet en effektiv og hurtig protokolfor tidlig embryo isoleret fra Arabidopsis frø, der er enkel at sætte op, let at overføre, og egnet til en bred vifte af downstream-applikationer. Det grundlæggende princip er at forsigtigt knuse frø - dissekeret fra unge siliques i et Eppendorf-rør ved hjælp af en plastik pistil i en egnet isolation buffer. Frøet ekstrakt anbringes i dråber på en multi-brønd sliden og screenet for tilstedeværelsen af frigivne embryoner på det ønskede tidspunkt ved hjælp af en inverteret mikroskop. Embryonerne opsamles ved hjælp af et glas microcapillary knyttet til en microinjector eller en standard laboratorium pipette. For molekylære applikationer anvendes embryoner vaskes to gange ved gentagne udsætning i dråber af nye isolation buffer, før du overfører dem til destinationen buffer i et minimalt volumen. Til cytologiske applikationer (reporter assays, immunfarvning, FISH), kan vasketrin udelades.
Fremgangsmåden giver flere fordele: (i) det giver 25-40 embryoner i ~ 45 min til cytologisk apppublikationer eller i 3-4 hr til molekylær ansøgninger (inklusive vasketrinene), (ii) den giver mulighed isolering af specifikke fosterstadiet, (iii), er det nemt overføres til andre personer og laboratorier på grund af sin simple setup, (iv) kræver overkommelig udstyr til den grundlæggende opsætning, der er modtagelig for opgraderinger, og (v) det blev med held brugt til forskellige downstream-applikationer såsom RNA-sekventering 8, gen-specifikke DNA-metyleringsanalyse 9 reporter assays (10 og Raissig et al., i prep.) og FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux upubliceret se figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proceduren er sammenfattet i rutediagrammet i figur 1 viste. Den microcapillaries og instrumentopstilling er vist i figur 2 og figur 3, og de typiske trin i embryo isolation er vist i fig. 4.
1.. Materiale og buffer Forberedelse
1,1 Silikonebeklædning af glas microcapillaries
- Placer microcapillaries i et 15 ml Falcon-rør med ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) og vend adskillige gange.
- Fjern opløsningen, placere Falcon-rør indeholdende kapillærer i en aluminiumsfolie og bage dem i 3 timer ved 60 ° C. Opbevares ved stuetemperatur.
1.2 Opnå ~ 50-100 um diameter mikrokapillær tips
- Træk 1 mm diameter glaskapillarer enten manuelt over en bunsenbrænder eller ved anvendelse af et kommercielt aftrækker (lodret filament aftrækker eller mikropipette aftrækker).
- Brug en diamant-spids pen eller kniv til at skære spidsen af trak kapillær at skabe den ønskede åbning. Vælg den bedste-formede kapillærer under et stereo mikroskop. Åbningen skal være 50-100 um (figur 2).
1.3 Slide forberedelse
- Siliconize rene dias ved at dække alle brøndene med Sigmacote (~ 1 ml / slide) i 5 min, fjerne. Bages 3 timer i alufolie. Opbevares ved stuetemperatur.
- Vask multi-brønds glas mikroskopiske objektglas i 10 minutter i 10% SDS, 2 x 2 min i nuklease-frit vand (autoklaveret DEPC-ddH2O), 2 min i 70% ethanol, 2 minutter i 100% ethanol, air- tørre. Alle trin er udført i autoklaveres Coplin-skåle. Slides kan genbruges flere gange, giver en grundig rengøring mellem hver brug.
- Lige før embryo isolation spredning ~ 0,5 pi 10 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) med en pipette over hele overfladen af hver brønd og lufttørre.
1.4 Mikroskop og kapillær setup
<ol>1.5 Buffere
Tabel 1 viser de isolation og destination buffere afhængigt af de efterfølgende programmer.
- Forbered ~ 1 ml isolation buffer per prøve frisk før brug, og holde det på is.
- Forbered destination buffer i en 0,5 ml Eppendorf lav-bindende rør på is (molekylære applikationer) eller på et objektglas (cytologiske applikationer) i et fugtigt kammer.
2.. Seed Dissektion og Embryo Extraction
2.1 Synkronisering af Seed Development
- Svække blomster og holde dem 2 dage i vækstkammeret samtidig undgå kontakt af de eksponerede støvveje med andre blomster, så bestøve dem (f.eks 11).
- Test udviklingstrin under dine vækstbetingelser ved mikroskopisk undersøgelse af ryddet frø. Med vores vækstbetingelser (16 timers lys ved 21 ° C, 8 timer mørke ved 18 ° C og 70% fugtighed) frø indsamlet 2,5 dage efter bestøvning (DAP) gav hovedsagelig 2-4 celle embryoer og frø indsamles 3,5-4 DAP gav kugleformede embryoner.
2.2 Seed Dissektion og Brud
- Fjern filtreeeds 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) under et stereomikroskop med en pincet og insulin nåle.
- Fordyb frøene i 20 pi isolation buffer i en 2 ml rundbundet Eppendorf-rør anbragt på is.
- Forsigtigt knuse frøene med en plastik pistil (forrensede med 10% SDS, skylles med DEPC-ddH2O og vasket med 70% ethanol) for at frigive embryoner indtil frø ekstrakt er uklar. Den kraft til at anvende, er at blive bestemt af hver enkelt bruger ved retssagen.
- Skyl pistil med 300 ul isolation buffer til at vaske pistil og fortynde prøven.
- Spin-down ekstraktet ved 5000 xg i 5 sek. Forsigtigt resuspenderes pelleterede ekstrakt ved pipettering op og ned 2-3 gange.
- Filtrer ekstraktet med en 30 um nylon mesh (monteret på røradaptorer, fx fra PartecCelltricks). Skyl masken med yderligere 200 pi isolation buffer.
3.. Embryo Isolation
3.1 Slide forberedelse
- <li> Placer en ren, BSA-belagt og silikoniseret multi-godt slide på scenen af omvendt mikroskop, resuspenderes filtrerede frø ekstrakt ved pipettering forsigtigt op og ned og afpipetteres 2 dråber 40-50 ul frø ekstrakt i 1 eller 2 brønde . Screening kun 1 eller 2 dråber på et tidspunkt forhindrer fordampning af prøven.
- Sted 50 ul af frisk isolation puffer (1. vask dråbe) i en brønd i en anden slide fremstillet som før. Hold dette dias i en overdækket, fugtigt kammer for at forhindre fordampning.
3.2 Screen, rengøre, samle
- Screene dråber af frø ekstrakt for embryoner på det ønskede tidspunkt med det 10x forstørrelse mål. Hvis det er nødvendigt, bekræfter scenen med 20x forstørrelse. De embryoer sædvanligvis synke til bunden af slæden.
- Manuelt fjerne snavs omkring embryo med en wolfram nål, en insulin nål eller lignende udstyr.
- Flyt glaskapillar nær foster ved hjælp af mikromanipulator, take op embryoet med så lidt opløsning som muligt.
- Saml flere embryoner (f.eks hele én dråbe), og frigive dem i 1. vask dråbe (molekylær ansøgning) eller destination buffer (cytologiske applikationer). Hver indsamler runde bør holdes inden for 5-10 min og embryoner skal indsamles på en minimal volumen (den samlede mængde af alle indsamling runder skal være <5 ul).
- Gentag screening og indsamling, indtil den ønskede mængde af embryoner er indsamlet i 1. vask dråbe (centralt, hvis det er muligt, for at lette erindring).
- Huske alle embryoner på én gang fra vask drop (hvis rester er overført, fjerne dem med en nål, før erindring).
- Slip embryoner i en 2 nd vask dråbe 50 pi. Gentag 3.2.6.
- Slip embryoner destinationen buffer. Overførslen må kun omfatte en kontakt, og ikke nedsænkning af den kapillære spids.
- Udskift microcapilLary til den næste prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores embryo isolation procedure (fig. 1) muliggør isolering af op til 40 embryoner i 4 timer, hvis Vaskene udføres, fx til molekylære anvendelser, eller i mindre end en time, hvis vaskninger udelades, fx til cytologiske applikationer. Figur 2 viser høj og lav kvalitet microcapillary tips og Figur 3 viser opsætningen af embryo isolation maskinen. Figur 4 viser processen med embryo isolation på inverteret mikroskop.
Vi har med held anvendt vores procedure for forskellige applikationer udgivet i flere nylige artikler. Metoden blev oprindeligt udviklet til at analysere forældrenes bidrag til den tidlige embryonale transkriptomet. Hybrid embryoner genereres gennem krydsninger mellem to forskellige Arabidopsis tiltrædelser (Landsberg erecta (L is) og Columbia (Col-0)) blev isoleret ved 2-4 cell scenen. Totalt RNA blev ekstraheret, cDNAbiblioteker blev fremstillet ved hjælp af lineær forstærkning og sekventeret på en solid platform. De allel-specifikke transcriptomes blev genereret baseret på SNP analyse 8.. Til at styre vores embryonale cDNA biblioteker før sekventering vi forstærket embryo-specifikke transskriptioner WUSCHEL-homeobox 2, 8 og 9 (WOX2, WOX8, WOX9) og ACTIN 11 (13,14, figur 5A).
Desuden blev denne metode anvendt til at isolere unge embryoer analysere de embryonale DNA-methylering mønstre på bestemte loci i genomet. Embryoer blev isoleret og vasket med 1x TE-puffer. Små bisulfit sekventering blev udført som beskrevet 9,15.
Ligeledes har embryo isolation vist sig meget nyttige i reportergenassays med lav embryonale udtryk, og hvor moderens frøskal forvirrer afsløring eller er maskeret af reporter ekspression i væv, der omgiver fosteret (endosperm, frøskal). Embryoner carr ying reporter transgen er farves (ß-glucuronidase, GUS) eller direkte analyseret (grøn eller rød fluorescerende protein, GFP, RFP) efter isolering. Et eksempel er givet i Figur 5B embryoner udtrykker et GUS-reportergen under kontrol af MEDEA promotoren (p MEA) 10.. Den relativt lethed, hvormed mange embryoner kan isoleres også mulighed for kvantitative analyser (f.eks antal embryoner farvet i forskellige genetiske baggrunde, Raissig, Grossniklaus et al. Under udarbejdelse).
Endelig vi med succes anvendt Fluorescent in situ hybridisering (FISH) og immunfarvning teknikker til at studere den nukleare arkitektur i isolerede embryoner indlejret i acrylamid pads på dias. Et eksempel på FISH hjælp sonder mod de centromerfusioner gentager og nucleolar organisere regioner er vist i figur 5C.
1 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/>
Figur 1. Flow diagram af embryo isolation procedure Protokollen er opdelt i tre dele: 1 - Materiale forberedelse, 2 - Seed dissektion, 3 - Embryo isolation..
Figur 2. Mikrokapillær tips. A. Høj kvalitet mikrokapillær tips med en glat åbning på omkring 100 pm. B. lav kvalitet mikrokapillær tips med større åbning og uregelmæssig kontur (dem tips er acceptable for cytologiske anvendelser). Scale bar: 2 mm.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
Figur 3. Opsætning af embryonet isolation mikroskop. A. og B. Screening udføres på objektglas under et inverteret mikroskop. Embryonerne opsamles ved hjælp af et glas microcapillary fast på en mikromanipulator for præcist at kontrollere sin stilling (se figur 4), og forbindes til enten en microinjector (A) eller standard laboratoriepipette (B). A. Glasset microcapillary er knyttet til styret en hydraulisk microinjector (f.eks Eppendorf Cell Tram Vario) for en præcis styring under embryonindsamling B. glas mikrokapillær er fastgjort til en standard P-200 pipette via et gummi flex rør. Embryonindsamlingsteam og frigivelse styres ved at dreje kalibrering rattet af pipetten. Cut-end pipettespidser bruges som stik og kryds er forseglet med parafilm. Den microcapillary er fast på mikromanipulator via polystyrenblokke, Falcon rør og tape.
Figur 4.. Embryo isolation proces. A. En 2-4 cell embryo (pil) blev identificeret i frø ekstrakt (screening dråbe), og er omgivet af vragrester (frøkappe fragmenter). B. Den omgivende vragrester blev fjernet manuelt ved hjælp af en nål. C. Den glaskapillar blev flyttet lige ved siden af embryo (pil). D. embryo blev opsamlet, og er nu inden de kapillære (pil). E. Adskillige embryoner i den sidste dråbe efter vask. Scale = 50 um.
F igur 5.. Downstream anvendelser af embryo isolation A. genekspressionsanalyse:. PCR-amplifikation af WOX9, WOX2, WOX8 og ACTIN11 13,14 om cDNA biblioteker (genereres som beskrevet 8) 2-4 celle embryoer vasket 1x gange (1. vognbane) og genomisk . DNA (2nd lane) B. Reporter assay: En 8-cellet embryo isoleret fra planter, der bærer ap MEA :: GUS konstruktion blev farvet på et dias i en standard GUS farvningsopløsning (gengivet fra Raissig et al 2011 efter tilladelse fra. Plant Cell, ASPB ophavsret). C. Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH): en 8-celle embryon blev hybridiseret med prober mod centromere gentagelser (rød), og 45S rDNA gentagelser (grøn), før indirekte immunodetektion 16. Den tofarvede FISK billeder blev overlejret med DAPI kontrastfarvning og DIC billeder (DM6000B epifluorescensmikroskop, Leica, Tyskland).
| Ansøgning | Isolation buffer | Destination buffer |
| RNA ekstraktion (fx til forstærkning og transcriptomics) | 1x First-Strand buffer (Invitrogen), 1 mM DTT, 4% RNAseOUT | RNA-ekstraktion buffer |
| DNA-ekstraktion (f.eks bisulfit sekventering) | 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | DNA-ekstraktion buffer eller 1x TE-buffer |
| GFP reporter analyse | 1 M Glycin i 0,5 x MS 1 | 1 M Glycin i 0,5 x MS |
| GUS reporter analyse | farvningsbuffer 2 uden X-Gluc (substrat) | farvningsbuffer med X-Gluc (substrat) |
| FISK & Immunfarvning | 100 mM phosphatpufret saltvand (PBS) | aktiveret Acryl: Bisacryl mix (33:3) på en Superfrost Plus slide-polymerisere i 30 min |
Tabel 1. Isolation og destination buffere til forskellige efterfølgende anvendelser. De buffere kan tilpasses specifikke eksperimentelle krav. 1 Murashig & Skoog medium. 2 fx Jefferson et al. EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi udviklede et foster isolation protokol, der er hurtig, effektiv og kan nemt overføres til andre laboratorier.
Den beskrevne udstyr består her af et omvendt mikroskop, en mikromanipulator, glas microcapillaries, en lodret filament aftrækker og en microinjector (figur 3A). Opsætningen ligner den, der er beskrevet for enkelt dyr celleisolering for transcriptomics analyser 17. Vi har også med succes arbejdet med en mere grundlæggende setup, hvor glas microcapillaries blev manuelt strækkes over en flamme (og skæres med en diamant-bladet), og betjenes via en standard laboratorium pipette (Pipetman P-200) i stedet for en microinjector (figur 3B). I dette tilfælde microcapillary var knyttet til pipetten via en gummislange. 10 pi filterspidser blev brugt til at lave de kryds, som blev pakket med parafilm at gøre dem lufttæt. Den kapillære - indehaves af pipettespids - blev fastsat på MICRomanipulator arm ved hjælp polystyrenblokke og tape (figur 3B). Denne grundlæggende opsætning vist sig at være effektiv og pålidelig 8.. Alligevel, en af de største problemer var opretholdelse af luft-tight junctions mellem mikrokapillær og pipetten, især ved udskiftning af kapillarrøret. Verificering og justere trykket i kapillarrøret - for at sikre et finjusteret embryonindsamlingsteam i et minimalt volumen - kan være tidskrævende at bruge denne grundlæggende opsætning. Den forbedrede setup med en hydraulisk styret mikromanipulator og et lodret filament aftrækker er en betydelig forbedring og sparer tid.
De færdigheder, der kræves for en vellykket anvendelse af denne metode er let omsættelige. Fem brugere i vores laboratorium med succes lært metoden i en forholdsvis kort tid. Nogle forenklinger af protokollen er mulige afhængigt af brugerens lethed i manipulation. For eksempel er det muligt at springe trin 2.2.5 og 2.2.6, mensdissekere kun 5 siliques (i stedet for 15) og rengøring af embryo omgivelser grundigt for affald med en wolfram nål (denne procedure blev anvendt i 8). Synkronisering af frø udvikling gennem kastrering og forsinket bestøvning er fakultative men anbefales at øge antallet af embryoer på samme udviklingstrin, navnlig i de tidlige faser. Desuden kan embryo isolation fremskyndes hvis vasketrin er udeladt, fx til cytologiske applikationer. Endvidere slide siliconisering (trin 1.3.2) er ikke nødvendig for brugere, der arbejder hurtigt, er sådan, at embryoner, der klæber til glasoverfladen over tid ikke et problem.
Hvorvidt filtrering eller manuel rengøring er anvendt, er det ekstremt vigtigt at undgå overførsel af væv rester, der skaber potentiel forurening for downstream-RNA eller DNA applikationer. Dette spørgsmål blev rejst for nylig i en transkriptom profilering studie ved hjælp af en anden metode til embryo isolation18.. I modsætning til størstedelen embryo isolation protokollen beskrevet her, dissekeret forfatterne Arabidopsis embryoner manuelt inde fra de enkelte frø med fine nåle, en langvarig procedure, der kræver fremragende dissektion færdigheder. Denne procedure tilsyneladende kræves 2 eller flere vaske at undgå fremførsel af mulige kontaminerende celler fra omgivende frøvæv, en situation, der opstår, når du bruger denne metode betragtning af den lille størrelse af embryonerne, vanskelighederne med at få adgang dem med dissektion nåle og klæbeevne af omgivende celler. Derimod giver vores procedure (i) fortynding af embryonerne-ekstruderet fra frøene ved knusning-og omgivende snavs i et stort volumen (500 ul) før embryonindsamling (ii) den visuelle udvælgelse af embryoner blottet for klæbemiddel, kontaminerende vragrester, og (iii) fortynding af mulige RNA forurening-siver ud fra bristede celler-by vasketrinene. Mens det er muligt at anvende kun én vasketrinnet, hvisembryoner synes meget ren og opsamles i mindre end 5 ul 8, et andet vasketrin anbefales, især for første gang brugere, der kan indsamle embryoner i flere runder (dvs. med additiv volumen). Embryoner bør indsamles i så lidt opløsning som muligt, så den maksimale fortynding af potentielle kontaminanter i hvert vasketrin. Hver indsamler runde skal holdes kort (inden for 5-10 min) for at opnå maksimal genvinding efter frigørelse til vask dråbe (længere tilstedeværelse i kapillarrøret tendens til at reducere inddrivelse sats). Desuden bør overførsel af de indsamlede embryoner i udvinding medium (efter vask trin) kun involverer en kontakt med åbningen af microcapillary spids og ikke nedsænkning af spidsen, da dette kan lige så godt overføre vragrester stikning på microcapillary væggen over åbningen. Endelig skal kapillærrøret ændres mellem hver ny frø ekstrakt.
Vores protokol giver mulighed for flere downstream programmer ved blot at bruge en passende isolation buffer, der bevarer molekylær integritet RNA, DNA, kromatin, enzym eller fluorescerende reporter. Vi har med held isolerede embryoner i RNA-beskyttende isolation buffer for RNA-ekstraktion og transcriptomics analyser 8, 1x TE-buffer til DNA methylering analyser 9, 100 mM phosphatbufret saltvand (PBS) for fisk og immunfarvning (Jaenisch, Grossniklaus og Baroux, upubliceret, figur 5C), og farvning løsning uden substrat for GUS reporter assays (19, figur 5B). Ansøgningen mest følsomme over for isolation forhold / embryo kvalitet er helt sikkert RNA ekstraktion og opformering. Mængden af udvundet RNA fra isolerede embryoer var temmelig lav. Fra ~ 30 embryoer på 2-4 celle stadiet (altså 60-120 celler i alt) vi anslået et beløb på ~ 1 ng af total RNA både er baseret på Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) og qubit (Invitrogen) målinger. Following RNA ekstraktion blev RNA kvalitet kontrolleret på en Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies). Den lave mængde RNA ekstraheret er ikke altid tilstrækkelig til at fremstille en pålidelig profil. Således skal yderligere tests ske på amplificerede materiale (cDNA) (f.eks PCR påvisning lavt udtrykt embryo-specifikke gener og / eller en Bioanalyzer profil).
Endelig er evnen til at isolere embryoner visuelle kriterier i vores protokol er et stort aktiv. Embryoner fra samme silique (Arabidopsis frugt) ikke udvikler synkront. Således ikke arbejder på hele silique ekstrakter (fx til RT-PCR-analyser eller kvantitative reporter assays) ikke tillade en perfekt korrelation med en given udviklingsstadiet. Isolere embryoner på et bestemt udviklingstrin løser dette problem. Desuden præsenterer et lignende problem, når man arbejder med heterozygote mutanter, hvor siliques indeholder forskellige embryo genotyper. Isolering af embryoner er baseret på visuelle kriterier for distinguish fx vildtype fra mutant embryo fænotyper giver korrelerende downstream analyser med genotype. Vi har gjort dette med succes til at analysere DNA methylering på bestemte loci i forskellige genotyper 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Tal Nawy og Martin Bayer for deres råd om embryo isolation. MTR, VG, UG og CB udtænkt embryo isolation udstyr. MTR, VG og CB udviklet embryo isolation protokollen. MTR, VG og CB etablerede protokollen, isolerede embryoner og genererede embryo cDNA, VG udført PCR, MTR GUS-farvning, JJ fisken eksperimenter. MTR, VG, CG og UG skrev manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af University of Zürich, et stipendium af Roche Research Foundation (til MTR) og tilskud fra den schweiziske National Foundation (til UG og CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
