Summary
تصف هذه الورقة طريقة جديدة للعدوى عن طريق الفم من الفئران باستخدام
Abstract
المستوحدة L. هي اختياري مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا التي تسبب الالتهابات المنقولة عن طريق الأغذية في البشر. القليل جدا هو المعروف عن المرحلة الهضمي من الليستريات نظرا لعدم وجود نموذج حيواني صغير الذي يحاكي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر. تصف هذه الورقة نموذج الفأر رواية لنقل الشفوي L. المستوحدة. باستخدام هذا النموذج، الفئران التي غذيت L. المستوحدة الملوثة الخبز يكون مرحلة منفصلة من عدوى الجهاز الهضمي، تليها بدرجات متفاوتة من انتشار النظامية في سلالات الفئران عرضة (BALB / ج / عن طريق / J) أو مقاومة (C57BL / 6). خلال مراحل لاحقة من عدوى، لوحظ نشرها على المرارة والدماغ. نموذج تنتقل عن طريق الأغذية من الليستريات هو تكرار للغاية، لا يتطلب مهارات متخصصة، ويمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من العزلات البكتيرية وسلالات الفئران المختبرية. على هذا النحو، هو نموذج مثالي لدراسة كل الاستراتيجيات الفوعة المستخدمة من قبل L. المستوحدة
Introduction
المستوحدة الليستيريا هي اختياري مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا التي تسبب الالتهابات المنقولة عن طريق الأغذية في البشر. البكتيريا المقاومة لكثير من العمليات المستخدمة لحماية امدادات الغذاء لدينا، مثل التجفيف والتمليح، أو ترتبط 1،2 التبريد والالتهابات عادة إلى معالجة، "جاهزة للأكل" الأطعمة التي لا يتم تسخينها قبل الاستهلاك . في عدة حالات سابقة، مصدر L. تم تحديد المواد الغذائية المستوحدة الملوثة، وتم رصد مجموعة محدودة من الأفراد المعرضين بشكل وثيق 3-6. في هذه الأمثلة، وأمراض السريرية في الأفراد الأصحاء تراوحت بين خفيفة، التهاب المعدة والأمعاء محدودة ذاتيا إلى الالتهابات المعوية والجهازية أكثر حدة التي تتطلب العلاج في المستشفيات. L. وقد ارتبطت الالتهابات المستوحدة في مأمن الأفراد للخطر، بما في ذلك حديثي الولادة وكبار السن، مع معدل وفيات مرتفع (25-30٪)، وحتى مع العلاج بالمضادات الحيوية
النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من الليستريات هو عن طريق الوريد (IV) تلقيح الفئران. النموذج الرابع هو تكرار للغاية، وكانت مفيدة للغاية لدراسة استجابات كل من السذاجة والذاكرة خلية T خلال العدوى 9،10. العيب من النموذج الرابع هو أنه يتجاوز تماما المرحلة المعوية العدوى. بعد انتقال تنقلها الأغذية، الغشاء المخاطي الأمعاء يوفر الحاجز الذي يفترض أن يؤدي إلى إبطاء ويحد من عدد من البكتيريا التي يمكن أن تنشر باستمرار إلى الأنسجة الطرفية. في المقابل، فإن اللقاح بأكملها يمكن العثور عليها في الطحال والكبد في غضون دقائق من الإدارة الرابع، وهذا بلعة كبيرة من الكائنات الحية قد تطغى الفطرية د المناعيefenses في هذه الأنسجة. يستخدم العدوى عن طريق الفم من الفئران عن طريق التغذية الأنبوبية أقل شيوعا، وذلك لأن الجرعات الكبيرة (10 -10 9 11 كفو) عادة ما تكون مطلوبة لتحقيق الاستعمار المعوية 10. أيضا، المعدة (IG) التلقيح بإبرة التغذية لا تولد الفترة استنساخه من عدوى الجهاز الهضمي قبل انتشار النظامية. وأفادت بعض المختبرات التي L. المستوحدة وصول إلى الطحال والكبد في غضون 4-12 ساعة بعد العدوى (HPI)، في حين أظهر البعض الآخر لا انتشار النظامية حتى 48 HPI 11-15. قد يكون هذا الاختلاف مختبر إلى مختبر نتيجة للطبيعة الغازية من IG التلقيح، والذي يمكن أن يؤدي إلى صدمة طفيفة على بطانة المريء، وتعزيز غزو مجرى الدم مباشرة من البكتيريا.
وضعنا مؤخرا نموذج الفأر الرواية الشفوية من L. عدوى المستوحدة الذي يحاكي عن كثب جميع مراحل المرض الإنسان 16. تحدث العدوى عندما يبتلع قطعة من الفئران تابعaminated الغذائي، وهي عملية غير مؤلمة، و لا يتطلب مهارات متخصصة من قبل المحققين المختبر. لفترة من الوقت منفصلة (36-48 ساعة)، L. المستوحدة استعمار بتكاثر فقط الجهاز الهضمي، مما يسمح التحقيق في الآليات المستخدمة من قبل الممرضة الليستيريا لنقل من عبر الغشاء المخاطي للأمعاء ونشرها إلى الأنسجة الطرفية. الأهم من ذلك أن نموذج يمكن استخدامه لدراسة الاختلافات في المضيف المقاومة الفطرية للإصابة. في دراسة سابقة، أظهرت لنا أن BALB / ج / عن طريق / J الفئران كانت عرضة للغذاء الحامل بالعدوى المنقولة، مع النسخ المتماثل الأسي من L. المستوحدة التي تحدث في الأمعاء والطحال، والكبد، والمرارة 16. في المقابل، كانت C57BL / 6 الفئران المقاومة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية، مع فقط الاستعمار عابرة من L. المستوحدة التي تحدث في كل من هذه الأنسجة. ميزة إضافية من طراز تنتقل عن طريق الأغذية الذي يحاكي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر هي أن نشر الطبيعيلوقعت في الدماغ خلال مراحل لاحقة من عدوى (5-7 نقطة في البوصة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد آجار وسائل الإعلام الانتقائي (BHI / L + G) لمنع مجهريات البقعة المعوية
- تزن من 26 ز الدماغ القلب تسريب آجار (Difco)، 7.5 غرام و 5.0 غرام LiCl الجلايسين والمكان في قارورة 1 لتر. إضافة 500 مل من الماء منزوع الأيونات.
- الحرارة على محرك مغناطيسي حتى يغلي أجار، التحريك المستمر. خذ قارورة قبالة الحرارة، والسماح للفقاعات تسوية لفترة وجيزة، ثم يعود ليغلي مرة أخرى.
- . الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية تحت 16-19 رطل على دورة السائل ملاحظة: ترك شريط ضجة في قارورة.
- تتوازن وسائل الإعلام إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي أو السماح لتبرد في RT. لا تسمح للحصول على حل أكثر برودة من 55 درجة مئوية أو سوف تشكل بلورات في أجار. بلورات لا تمنع L. نمو المستوحدة أو تؤثر على خصائص مختارة من وسائل الإعلام. ومع ذلك، فإن البلورات تكون مماثلة في مظهر إلى مستعمرات صغيرة، وسوف تجعل من الصعب الاعتماد كفو البكتيرية.
- مزيج بلطفأجار لمدة 1 دقيقة باستخدام محرك مغناطيسي. تجنب تشكيل فقاعات الهواء. صب أجار في أطباق بتري (~ 25 مل / لوحة).
ملاحظة: هذه الوسائط لا يدعم نمو جميع L. سلالات المستوحدة. على سبيل المثال، L. المستوحدة EGDE تنمو جيدا في هذا أجار، مع المستعمرات مرئية في غضون 36-48 ساعة، ولكن 10403s لا تنمو على هذه الوسائط.
2. إعداد اللقاح
- قطع الخبز الأبيض شرائح (كروجر) في الصغيرة (2-3 ملم) مكعبات باستخدام مقص العقيمة أورا شفرة مشرط معقم. لا تستخدم القشور. تخزين القطع الفردية في أنابيب microcentrifuge في -20 درجة مئوية حتى اليوم من العدوى.
- باستخدام مشرط معقم، وقطع (0.5-1 سم) قطع صغيرة من الزبدة المملحة (كروجر) ووضع كل منها في أنبوب microcentrifuge العقيمة. سوف تحتوي على كل أنبوب زبدة الكافي لإعداد 50 - 60 قطعة الخبز. المحل في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- تنمو L. المستوحدة في BHI مرق اهتزاز عند 30 &دغ]؛ C حتى يصل إلى ثقافة OD 600 من ~ 0.8-1.0. إعداد 500 ميكرولتر مأخوذة في أنابيب microcentrifuge، مع الحرص على دوامة العينة في كثير من الأحيان لذلك كل من أنابيب تحتوي على نفس العدد من البكتيريا. المحل في -80 درجة مئوية.
- لعيار ال مأخوذة البكتيرية، ذوبان الجليد أنبوب على الجليد، ثم إضافة 500 ميكرولتر إلى 9.5 مل مرق بهي. احتضان لمدة 1.5 ساعة الدائمة في 30 ° C. لوحة التخفيفات المسلسل علي بهي أجار. نتوقع من عيار ~ 1-5 × 10 8 كفو / مل ملاحظة: إذا تم إعداد مأخوذة متجانسة، يمكن أن نتوقع كل من أنابيب لانتاج هذا عيار عندما أعدت بطريقة مشابهة مع الفرق من 2-4 أضعاف.
- لتصيب الفئران، وإعداد قسامة من L. المستوحدة كما هو موضح في الخطوة 2.4. حوالي 20 دقيقة قبل L. ثقافة المستوحدة مستعدة، ذوبان الجليد على قطعة خبز في RT. تذوب قسامة من الزبدة في 55 ° C وقبل الدافئة حجم صغير من برنامج تلفزيوني في 55 درجة مئوية. تحضير قطعة الخبز بما فيه الكفاية حتى لا يكون هناك واحد على الأقل في الماوسللإصابة وقطعة واحدة على الأقل إضافية لتحديد عيار من اللقاح الفعلي.
- استنادا إلى عيار محدد سلفا من قسامة البكتيرية، وحساب إجمالي حجم L. ثقافة المستوحدة اللازمة لإعداد قائح عن العدد المطلوب من قطعة خبز. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في XG 14،000 لمدة 10 دقيقة نضح كل مرق بهي و resuspend البكتيريا في حجم صغير من برنامج تلفزيوني قبل حرارة (2 ميكرولتر / خبز قطعة).
- دوامة الزبدة المذابة، إضافة إلى البكتيريا (باستخدام الحجم الكلي يساوي 3 ميكرولتر / قطعة الخبز) وتخلط جيدا ملاحظة: لا تحاول أن تعد أكثر من 10-15 قطعة الخبز في وقت واحد أو الزبدة سوف يصلب.
- العمل بسرعة، ماصة 5 ميكرولتر من تعليق البكتيرية على قطعة خبز واحدة في أنبوب microcentrifuge. الحل يجب أن يكون استوعبت تماما من قطعة خبز.
- لتحديد عيار الفعلية من اللقاح، إضافة 1 مل العقيمة PBS إلى واحدة من PIEC الخبزES. دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة. تحضير التخفيفات التسلسلي ولوحة كلا بهي بهي و/ L + G أجار.
- الإجراء البديل لارتفاع عيار (> 10 9 كفو) قائح. إذا كان بيليه الجرثومي هو كبير جدا، ويمكن أن يكون من الصعب وقف في مثل هذا الحجم الصغير، والمادية الناجمة هو لزج جدا، مثل عجينة، وبعض من اللقاح قد التمسك جانبي أنبوب microcentrifuge. في هذه الحالة، فمن الأفضل لتطعيم الخبز في العقيمة 60 ملم صحن الثقافة، وتقديم الطبق بأكمله (بدون غطاء) لالماوس (انظر أدناه). أي اللقاح الزائدة التي لم يتم استيعابها من قبل الخبز ثم يمكن أن تؤكل مباشرة عن طريق الماوس. بشكل عام، يستغرق وقتا أطول للفئران أن تأكل كل من الخبز ولعق الطبق نظيفة من بروتوكول قياسي هو موضح أدناه، لذلك هذا هو فقط الأسلوب المفضل عند التعامل مع عالية جدا قائح عيار.
3. إصابة الفئران
- شراء الإناث BALB / ج / عن طريق / J (الأوراق المالية # 0010026) وC57BL/6/J (الأوراق المالية# 000644) من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME) واستخدامها في 6-9 أسابيع من العمر.
- سريع الفئران يوم واحد (24 ساعة) قبل العدوى عن طريق إزالة المواد الغذائية ووضع الفئران في (1 بوصة) أرضيات سلك أثار (# 3 عيون؛ الينتاون) لمنع أكل البراز. ترك الفراش بما فيه الكفاية فقط في القفص لاستيعاب البول، ولكن ليس بما يكفي لرفع البراز يراق. السماح بالوصول غير المقيد إلى المياه.
- تصيب الفئران في بداية دورة الظلام، والعمل في غطاء تدفق الصفحي تجهيزه مع لمبة الضوء الأحمر. نقل ماوس واحدة إلى (لا الفراش) قفص فارغ. باستخدام ملقط معقم، ونقل قطعة الخبز الملوثة إلى الجزء السفلي من القفص فارغ. عادة، سوف الماوس تلتقط قطعة الخبز وتستهلك كليا في غضون 2-10 دقيقة. إذا كان الماوس لا يأكل الخبز على الفور، والعودة إلى القفص الرف وترك الماوس دون عائق لمدة 20-30 دقيقة. فإن الغالبية العظمى من الحيوانات تأكل الخبز ضمن هذا الإطار الزمني، ومع ذلك، يمكن ترك الفئران دون عائق، دون الوصول إلى OTلها الطعام أو الماء لمدة تصل إلى 2 ساعة.
- بعد الإصابة، والعودة الماوس لقفص الأصلي وتجديد تشاو الماوس. مواصلة لإيواء الفئران على الأرضيات الأسلاك التي أثيرت طوال مدة التجربة.
4. رصد مستوى البكتيريا في البراز السقيفة
- التسمية وقبل تزن microcentrifuge أنابيب لاستخدامها لجمع البراز.
- العمل بسرعة بعد استرداد قفص من الفئران، ضع الماوس في كل 500 مل دورق البلاستيك. عادة الفئران وطرد 1-4 الكريات البراز في غضون 5 دقائق.
- استخدام ملقط معقم لنقل البراز إلى أنابيب المسمى بشكل مناسب.
- تزن كل أنبوب وحساب وزن البراز عن طريق طرح وزن أنبوب فارغ. أوزان نموذجية لالكريات برازي تتراوح 10-30 ملغ.
- إضافة PBS إلى كل أنبوب (200 ملغ μl/30 البراز) واستخدام المسواك العقيمة إلى الهريس الكريات برازي.
- دوامة كل أنبوب لمدة 30 ثانية، ثم إعداد التخفيفات التسلسلي ولوحة على BHI / L+ G أجار. حساب عدد المستعمرات وحساب كفو / ملغ البراز.
5. معالجة الأنسجة المعوية المصابة
- الموت ببطء الفئران، والحصاد جو معقم و مطهر للمعدة والأمعاء من كل الماوس بوصفه الأنسجة واحد وجمع في أطباق بتري فارغ 100 ملم.
- فصل الأمعاء الدقيقة، الأعور، والقولون والمكان في 60 ملم أطباق منفصلة تخزينها على الجليد. الامعاء الصغيرة يمكن زيادة مقسوما على طول الى ثلاث قطع متساوية تقارب الاثني عشر، الصائم، واللفائفي لتسهيل إزالة محتويات اللمعية. ويمكن بعد ذلك ثلثي الأنسجة تتم معالجتها إما معا (لكفو في الامعاء الصغيرة كله) أو بشكل منفصل. الأنسجة الرطب مع ~ 0.5 مل العقيمة PBS للحفاظ على مرونة ومنع الدموع أثناء المناولة.
- ملء حقنة مل 10 مع 8 مل العقيمة PBS وإرفاق ز 25 إبرة. استخدام ملقط معقم لاخراج محتويات اللمعية في دورق النفايات (أو العقيمة 50 مل أنبوب إذا جمع البكتيريا اللمعية). فلوسح 4 مل PBS من خلال واحدة من نهاية الأنسجة، واستخدام الملقط لاخراج محتويات، ثم الوجه الأنسجة مرارا وتكرار على الطرف الآخر.
- لتحديد عدد الليستيريا في محتويات اللمعية، أجهزة الطرد المركزي في الإحمرار المجمعة لمدة 20 دقيقة في XG 12،000، تعليق بيليه في 0،5-1،0 مل من الماء المعقم.
- لتحديد العدد الإجمالي للكمية الخلايا المرتبطة الليستيريا، فتح كل الأنسجة غسلها عن طريق قطع طوليا مع شفرة مشرط معقم، ثم قم بإجراء عدة تخفيضات الوحشي لشريحة النسيج إلى أجزاء أصغر ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لضمان أن الأنسجة المعوية لا يلتف حول شفرة الخالط. نقل القطع المعوية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 2 مل من الماء المعقم.
- تعقيم الخالط الأنسجة (فيشر بوورجن 1000) عن طريق وضع مسبار في الايثانول 70٪ في الطاقة بنسبة 60٪ لمدة 30 ثانية. انتظر الإيثانول في الهواء الجاف، أو عملية في الماء المعقم لمدة 10 ثانية. التجانس كل TIssue لمدة 1 دقيقة. تكرار العلاج مع الماء المعقم بين كل عينة، واستخدام الايثانول 70٪ بين المجموعات عينة.
- تحضير التخفيفات المتسلسلة من كل عينة في الماء المعقم وعلى لوحة بهي / L + G أجار.
6. تجهيز المصابة الغدد الليمفاوية المساريقي
- العقد الليمفاوية الحصاد جو معقم و مطهر، مكان في العقيمة 60 ملم طبق على الجليد، واستخدام ملقط معقم لإزالة جميع الدهون المرفقة. تتوقع أن تجد 3-6 العقد في الماوس.
- إعداد شاشات شبكة سلكية عن طريق خفض 1.5-2 بوصة قطع مربعة من الفولاذ المقاوم للصدأ # 80 شبكة. جعل قطع صغير في كل زاوية، وأضعاف أسفل الجوانب الأربعة، وخلق سرير المثارة. تراجع في الايثانول 95٪ ثم اللهب لتعقيم، ومكان في طبق بتري 60 مم تحتوي على 0.75 مل ماء معقم. بعد كل استخدام، وشاشات يمكن إعادة تدويرها عن طريق نقع في الايثانول 70٪ لمدة 20 دقيقة، الغسل مع فرشاة لإزالة الأنسجة جزءا لا يتجزأ، يغلي لمدة 20-30 دقيقة في 2N هيدروكسيد الصوديوم، ثم شطف بشكل مكثف بالماء.
- استخدام الغطاسمن العقيمة 3 مل حقنة لالهريس العقد من خلال شاشة شبكة. ومن المؤكد أن دفع إلى أسفل على الشاشة لأسفل الطبق بحيث يجعل الاتصال مع الماء في طبق.
- يمر الماء المعقم 0.75 مل من خلال الشاشة ومن ثم ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لشطف الشاشة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentrifuge.
- دوامة كل عينة بقوة لمدة 30 ثانية لليز الخلايا. تحضير التخفيفات التسلسلي ولوحة على أي بهي / L + G أجار.
7. تجهيز الطحال المصاب، الأكباد، وقربة غال
- فهم الطحال مع ملقط معقم وتحرير بجعل اثنين من التخفيضات، واحد في كل نهاية. مكان في أنبوب مل 15 مل تحتوي على 2.5 الماء المعقم. (ملاحظة: أنابيب مع قيعان الجولة قد تكون أسهل للاستخدام مع الخالط.)
- تحديد موقع المرارة (الصفراء كيس مملوءة بسائل صغيرة تعلق على الكبد) وقص بعناية مع مقص العقيمة لفصل من الكبد دون انفجار. TRANSFإيه إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 1 مل ماء معقم.
- جو معقم و مطهر إزالة الكبد، مع التأكد من إزالة كافة فصوص، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 2.5 مل من الماء المعقم.
- التجانس الطحال والكبد كما هو موضح أعلاه لمدة 30 ثانية على السلطة 60٪. قربة Forgall، استخدم مقص العقيمة بتمزيق في أنبوب microcentrifuge، ثم دوامة بقوة لمدة 30 ثانية.
- تحضير التخفيفات التسلسلي ولوحة كل عينة على أي بهي بهي أو / L + G أجار.
8. تجهيز الأمخاخ المصابة
- العمل من الجانب الخلفي من الماوس، وقطع الجلد والأنسجة فوق الرقبة، وعبر كلتا الأذنين في زاوية 45 درجة. استخدام ملقط معقم لتقشر رفرف على شكل U من الجلد عن طريق سحب نحو الأنف وفضح الجمجمة وعظام الوجه.
- لشل حركة الجمجمة من خلال عقد سلسلة من التلال عظمي بين العينين مع ملقط، واستخدام مقص لجعل التخفيضات الضحلة عبر الحواف الجانبية للجمجمة. كنالحرص على خفض فقط العظام وليس أنسجة المخ. المقبل، وقطع الحافة العظمية بين العينين. استخدام ملقط لعقد الجزء العلوي من الجمجمة وسحب إلى الوراء (نحو الرقبة) لفضح الدماغ.
- رفع بلطف الدماغ من حفرته باستخدام ملقط معقم ووضعه في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على 1.5 مل ماء معقم.
- التجانس لمدة 20 ثانية على السلطة 60٪ كما هو موضح أعلاه. تحضير التخفيفات التسلسلي ولوحة على أي بهي بهي أو / L + G أجار.
9. الإجراءات التكميلية: التقطير من الأنسجة المعوية
9.1 عزل البكتيريا في كسر مخاط
- لكل الأنسجة المعوية، وإعداد 3 أنابيب تحتوي على 3 مل من 6 ملم N-أسيتيل (NAC؛ سيجما # A-9165).
- وضع احمرار وقطع طولي الأنسجة في الأنبوب الأول لمدة 1-2 دقائق، يحوم بقوة كل 20-30 ثانية. باستخدام ملقط معقم، والتقاط الأنسجة والضغط بلطف ضد الجانب من الأنبوب لإزالة الزائدة LIQUمعرف.
- كرر الخطوة 9.1.2 مرتين أكثر باستخدام أنابيب NAC المتبقية. إزالة الأنسجة المعوية ويوضع جانبا لمزيد من المعالجة.
- بركة NAC يغسل (ما مجموعه 9 مل)، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 12،000 ز س.
- resuspend الكرية في الماء المعقم، دوامة لمدة 30 ثانية، وإعداد التخفيفات التسلسلي ولوحة على BHI / L + G.
9.2 عزل البكتيريا في الخلية (EC) جزء طلائي
- قطع كل الأنسجة الى قطع صغيرة مع مقص العقيمة ومكان في أنبوب مل 50 تحتوي على 5 مل من RPMI (إينفيتروجن # 21870) تستكمل مع 5٪ FBS (RP-5)، 5 ملي EDTA، و1 ملم DTT. احتضان اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- نقل القطع المعوية إلى أنبوب الطازجة التي تحتوي على 5 مل RP5/EDTA/DTT واحتضان اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حفظ وسائل الإعلام من الأنبوب الأول وتوضع جانبا عند 37 درجة مئوية. كرر هذه العملية مرة أخرى ليصبح المجموع ثلاث حضانات 20 دقيقة في RP5/EDTA/DTT. إذا الشروع في الصفيحة المخصوصة ISOالخطوة الشكان، ونقل القطع المتبقية في الأمعاء الفارغة 50 مل أنبوب.
- الجمع بين يغسل RP5/EDTA/DTT الثلاثة (إجمالي حجم 15 مل)، وأجهزة الطرد المركزي على سرعة منخفضة (1،200 x ج) لخلايا بيليه.
- لتحديد البكتيريا خارج الخلية، وجمع طاف وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 12،000 ز س. Resuspend وبيليه في 0،5-1،0 مل من الماء المعقم والتخفيفات لوحة المسلسل علي بهي / L + G أجار.
- تعداد البكتيريا داخل الخلايا، resuspend الكرية EC في 5 مل من RP-5 التي تحتوي على 25 ميكروغرام / مل جنتاميسين. احتضان تعليق خلية واحدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 7٪ CO 2 لقتل أي L. خارج الخلية المتبقية المستوحدة. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني أو تعليق في 0.5 مل من الماء المعقم، ودوامة لمدة 30 ثانية إلى ليز الخلايا. تحضير التخفيفات التسلسلي في المياه وعلى لوحة بهي / L + G.
ملاحظة: فإن الخلايا التي تم جمعها في هذه المرحلة تحتوي أيضا على خلايا من البقع باير الكامنة لل. إذا رغبت في ذلك، هو باير مرئيةيمكن إزالة البقع من الأنسجة المعوية قبل التنظيف والقطع طوليا.
9.3 عزل البكتيريا في الصفيحة المخصوصة (LP) الكسر
- شطف الزائدة DTT / EDTA من القطع المعوية عن طريق إضافة 25 مل العقيمة PBS في أنبوب. هزة بقوة، ونقل إلى أنبوب جديد وكرر مرتين.
- نقل القطع المعوية إلى أنبوب مل 50 يحتوي على 4 مل من محلول الهضم تتكون من RP-5 تستكمل مع 1 ملغ / مل كولاجيناز النوع الرابع و 40 ميكروغرام / مل الدناز أولا احتضان اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- نقل القطع غير مهضوم في أنبوب الطازجة التي تحتوي على 4 مل من محلول الهضم وأكرر مرة أو مرتين حتى يتم هضمها تماما قطعة نسيج. حفظ كل الحلول الهضم، والتي تحتوي على خلايا LP المحررة، في 37 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في الحلول الهضم مجمعة على سرعة منخفضة (1،200 x ج) لخلايا بيليه. معالجة وطاف بيليه الخلية بشكل منفصل كما أن described أعلاه لتعداد البكتيريا خارج الخلية وبين الخلايا، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سوف L. المستوحدة المستعمرات تكون مرئية على BHI / L + G لوحات بعد 36-48 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية. المستعمرات لديها، على شكل قبة مظهر أبيض دسم ناعمة (الشكل 1A). وأن النمو يتأثر سلبا بالنسبة للغالبية من مجهريات البقعة المعوية، ولكن من الشائع أن نرى بعض المستعمرات التي ليست L. المستوحدة، ولا سيما عندما الطلاء الأمعاء الدقيقة أو القولون مباشرة دون تخفيف كبير (الشكل 1B). ويمكن التأكد من المستعمرات المشتبه بواسطة الطلاء على ChromAgar TM لوحات الليستيريا. L. تظهر المستوحدة كما المستعمرات الزرقاء محاطة بهالة بيضاء على هذه اللوحات (الشكل 1C). الحد من الكشف عن L. المستوحدة في كل الأنسجة تعتمد على حجم المياه المستخدمة لتجانس الأنسجة. وحدات التخزين عينة المبينة في الجدول 1 تمثل الحد الأدنى من حجم اللازمة لمعالجة فعالة كل الأنسجة. الخليط من الطحال، زجميع المثانة والمخ والأنسجة المعوية أو مجزأة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام وإعادة المطلية إذا لزم الأمر. القولون، الأمعاء الدقيقة أو الخليط الكبد يمكن أن تمنع بعض L. نمو المستوحدة ما لم يتم تخفيف عينة كاف (1D الشكل)، وهذه الخليط لا تسفر عن التهم كفو مماثلة إذا إعادة مطلي بعد تخزين عند 4 درجات مئوية.
نحن سابقا أظهر أن BALB / ج / عن طريق / J الفئران (BALB) كانت كبيرة أكثر عرضة للغذاء الحامل بالعدوى المنقولة من C57BL / 6 (B6) الفئران 16. لقيحة من 10 7 كفو غير كافية لإثبات العدوى المعوية في الفئران BALB، لكن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 10 8 كفو لاستعمار القناة الهضمية من B6 الفئران (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل 2، فإن الحمل البكتيري في الأمعاء والطحال والكبد والمرارة تكون متناسبة مع جرعة التحدي نظرا للفئران. وتشير الدراسات الأولية إلى أن 5 × 10 9 كفو هووLD تقريبي 50 لBALB / ج / عن طريق / J الفئران باستخدام هذا النموذج 16.
الشكل 1. نمو مستعمرة ممثل على لوحات أجار انتقائية. A) L. المستوحدة المستعمرات بعد نمو الموارد البشرية 48 على BHI / L + G أجار. B) BHI / L + G أجار يمنع نمو معظم مجهريات البقعة المعوية، ولكن يمكن ملاحظة بعض المستعمرات غير الليستيريا (السهم) في التخفيفات المنخفضة. لوحة آغار المعروضة هنا يحتوي على 100 ميكرولتر من 10 -1 التخفيف على نصف من لوحة، و 50 ميكرولتر كل من 10 و 10 -2 -3 التخفيفات من جناسة القولون. C) L. يمكن تأكيد المستوحدة المستعمرات التي كتبها النمو على أجار CHROM لوحات الليستيريا. L. المستوحدة تظهر زرقاء مع هالة بيضاء تحيط المستعمرة. D) ليس من غير المألوف لياليEE على تثبيط L. نمو المستوحدة، مما أدى إلى المستعمرات من أحجام مختلفة، في أدنى التخفيف من إما المعوية أو الخليط الكبد لوحات على BHI / L + G أجار.
الشكل 2. أصيب الاستجابة للجرعة من العدوى المنقولة عن طريق الأغذية في BALB / ج / عن طريق / J وC57BL / 6 الفئران. أنثى BALB / ج / عن طريق / J (BALB) وC57BL / 6 (B6) الفئران مع 10 9 (ن = 7)، 10 8 (ن = 8)، 10 7 (ن = 6) و 10 6 (ن = 4) ل م InlA م وعدد كفو في كل الأنسجة تم تحديد 5 نقطة في البوصة. يعني القيم + / - SD ترد. وقد تم تحليل البيانات المجمعة من تجربتين مختلفة. الخطوط المتقطعة تشير إلى الحد من الكشف في كل من الهيئتين.
| الأنسجة | حجم العينة (مل) من | الحد من الكشف (كفو) |
| الأمعاء الدقيقة | 2.0 | 50 |
| المعي الاعور | 2.0 | 50 |
| القولون | 2.0 | 50 |
| الغدد الليمفاوية المساريقي | 1.5 | 15 |
| طحال | 2.5 | 50 |
| كبد | 2.5 | 50 |
| الحويصلة الصفراوية | 0.5 | 10 |
| دماغ | 1.5 | 15 |
الجدول 1. الحد من الكشف عن L. المستوحدة في الخليط الأنسجة. (أ) متوسط حجم العينة الكلية التي تتكون من الماء المعقم بالإضافة إلى النسيج المتجانس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفئران الفطرية ليست تقبلا موحد لتغذية في جميع الأوقات من اليوم، وسوف استعدادها لنأكل الخبز الملوثة تعتمد على حد سواء على نوع السلالة والعمر من الفئران 17. في تجربتنا، 6-9 أسبوع من العمر B6 الفئران هي تقبلا للتغذية في أي وقت من اليوم، ولكن سوف الفئران BALB لا يأكل باستمرار قطعة الخبز إلا إذا تم تقديمه خلال دورتهن الظلام. دورة ضوء غرفة تستخدم لإيواء الحيوانات ويمكن تغيير ذلك مرحلة مظلمة يتزامن مع يوم عمل عادي لموظفي المختبر. ومع ذلك، ينبغي أن تعطى الفئران أسبوعين على الأقل حتى يتأقلم لدورة ضوء تغير قبل العدوى. خلال العدوى، ينبغي أن تستخدم فقط المصابيح الحمراء إما في الغرفة نفسها أو في تدفق الصفحي هود.
في تطوير هذا النموذج، تم اختيار الخبز كمصدر للغذاء لنقل L. المستوحدة الى حد كبير لان الخبز هو ماصة. وبالتالي، كان من السهل لتشبع قطع صغيرة مع اله اللقاح البكتيري والتأكد من أن كل فأر تناولها جرعة واحدة. ومع ذلك، يمكن بسهولة أن تتكيف هذا النموذج لاستخدام مصادر غذائية أخرى. في الواقع، هذا هو النموذج الماوس فقط التي يمكن استخدامها لاختبار مباشرة تأثير التركيبة الغذائية أو ظروف التخزين على العدوى البكتيرية. L. يمكن المستوحدة تتكيف بسهولة إلى النمو في الملح عالية، وانخفاض الرقم الهيدروجيني، أو درجات الحرارة الباردة 1،2،18، ولكن من غير المعروف ما إذا كانت هذه الشروط النمو يغير من قدرة البكتيريا على إنشاء عدوى معوية.
هناك حاجة إلى ما يقرب من 10 دقيقة لحصاد كل من الأجهزة المصابة من ماوس واحدة. المرارة هي تمزق بسهولة، لذلك فمن الأفضل لإزالته أولا. الغدد الليمفاوية المساريقي هي أسهل على الفور عندما لم بالانزعاج الأمعاء، ولذلك يجب إزالة المقبل. يمكن حصاده الأمعاء والأنسجة عن طريق قطع واحد فقط تحت المعدة وفقط فوق المرفق، ومن ثم فصلها إلى العفج، الصائم، ileuم، الأعور، والقولون قبيل التنظيف والمجانسة. عادة يتم إزالة الطحال والكبد المقبل، ويتم حصاد الدماغ بعد استخراج الأعضاء البشرية من التجويف البريتوني، بقدر ما هو ضروري لتحويل الماوس فوق للوصول إلى الجمجمة. عند العمل مع الفئران متعددة، يجب أن يتم تخزين جميع الأنسجة على الجليد حتى معالجتها. بالنسبة لمعظم الأنسجة، وقد استخدم واحد لوحة آغار لتحديد العدد الإجمالي للكفو موجودة في الأنسجة. تم تقسيم اللوحة إلى الثلثين، وكان مطلي على عينة 50-100 ميكرولتر من التخفيفات ثلاثة منفصلة من جناسة الأنسجة في كل ثالث.
سوف الأساليب المذكورة هنا تحديد العدد الإجمالي للL. المستوحدة في كل الأنسجة الماوس، وليس مجرد الكائنات الحية داخل الخلايا. نمط الحياة داخل الخلايا الفريدة من L. ويعتقد المستوحدة أن يكون عاملا محددا رئيسيا الفوعة خلال العدوى 18،19. ومع ذلك، L. المستوحدة هي اختيارية، لا تلزم، ومسببات الأمراض داخل الخلايا، وذره توجد تقارير نهائية نشرت تشير إلى النسبة المئوية للالليستيريا الموجودة فعلا داخل الخلايا في الجسم الحي. معظم الدراسات السابقة باستخدام L. عن طريق الفم اعتمد عدوى المستوحدة على العلاج جنتاميسين من أنسجة القناة الهضمية لتمنع نمو مجهريات البقعة المعوية. ما قبل المعالجة مع الجنتاميسين لديه القدرة على القضاء على L. خارج الخلية المستوحدة، مما يسمح للانتعاش من البكتيريا داخل الخلايا فقط، على الرغم من أنه ليس من الواضح ما هي قادرة على اختراق الأنسجة المعوية كامل في المختبر مدى الجنتاميسين. البروتوكول الإضافي الموصوفة هنا يسمح لتحديد كل من البكتيريا خارج الخلية وبين الخلايا في طبقة المخاط، ظهارة، ومقصورة المخصوصة الصفيحة من أنسجة الأمعاء المصابة. في هذا الإجراء، يتم استخدام الجنتاميسين لعلاج تعليق خلية واحدة، وضمان أن كل البكتيريا تعافى كانوا داخل الخلايا داخل الأنسجة.
ثلاث غسلات مع NAC عادة إعادةانتقلت غالبية المخاط من الأنسجة المعوية، كما أن يغسل المجمعة لا يحتوي على أية خلايا حقيقية النواة (قابلة للحياة أو ميتا)، على النحو الذي يحدده التريبان الأزرق تلطيخ. لم يغسل إضافية لم تسفر المخاط مرئية على النحو الذي يحدده الفرق-كويك تلطيخ الاستعدادات الشريحة cytospin. ويمكن أيضا أن أكدت الخلوية من المفوضية الأوروبية والكسور باستخدام LP-كويك الفرق أو تلطيخ بالغيمزا. يجب أن تتكون الكسر EC من الخلايا الظهارية في المقام الأول، والتي يمكن بسهولة أن تميز من عدد قليل من الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري موجودة في ظهارة الأمعاء. الكسر LP هو أكثر تنوعا، تحتوي على خليط من الخلايا وحيدات النوى التي تغير التركيبة بعد الإصابة عندما حيدات التهابات التسلل إلى الأنسجة.
نموذج تنتقل عن طريق الأغذية من الليستريات يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من L. المستوحدة العزلات، بما في ذلك تكييفها الماوس InlA م، معربا عن سلالة 15 صفها هنا، وايلد EGDE نوع، وحذف متحولة درعيvatives من هذه السلالات 16. في دراسة سابقة، ونحن أظهرت أن مستوى الأمعاء الاستعمار لم تتفاوت تفاوتا كبيرا بين هذه السلالات، ومع ذلك، لم العزلات التي لم تعبر عن يجند تقارب عالية للالفئران E-كادهيرين لديها عيب طفيف في نشر إلى الغدد الليمفاوية المساريقي و الطحال 16. وبالمثل، فإن أي سلالة يمكن استخدام الماوس للعدوى، مما يجعل هذا النظام نموذجا جذابا لدراسة كل المرضية البكتيرية والاستجابات للإصابة المضيف. وأخيرا، على الرغم من أننا لم تختبر بعد هذا مباشرة، فإننا نقترح أن الإجراءات الأساسية المستخدمة هنا يجب أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع إلى غيرها من المواد الغذائية يغيب مسببات الأمراض البكتيرية مثل السالمونيلا، يرسينيا، القولونية، العطيفة والأنواع الليمونية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. أجريت جميع التجارب وصفها هنا في الامتثال مع مكتب مختبر رعاية الحيوان (OLAW) مع موافقة ICAUC في جامعة كنتاكي.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (AI079442 AI091918 و) منحت لSEFD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
