Summary
Dette dokumentet beskriver en ny fremgangsmåte for oral infeksjon av mus ved anvendelse av
Abstract
L. monocytogenes er fakultative intracellulære bakterier som forårsaker matbårne infeksjoner hos mennesker. Svært lite er kjent om gastrointestinal fase av listeriose på grunn av mangel på et lite dyr modell som etterligner sykdom hos mennesker. Dette notatet beskriver en roman musemodell for muntlig overføring av L. monocytogenes. Ved hjelp av denne modellen, mus matet L. monocytogenes-forurenset brød har en diskret fase av gastrointestinal infeksjon, etterfulgt av varierende grad av systemisk spredning hos følsomme (BALB / c / Av / J) eller resistente (C57BL / 6) musestammer. I løpet av de senere stadier av infeksjonen, er formidling til galleblæren og hjerne observert. Den matbårne modell av listeriosis og reproduserbar, krever ikke spesielle ferdigheter, og kan brukes sammen med et bredt spekter av bakterielle isolater og laboratorie musestammer. Som sådan, er det den ideelle modellen til å studere både virulens strategier som brukes av L. monocytogenes
Introduction
Listeria monocytogenes er fakultative intracellulære bakterier som forårsaker matbårne infeksjoner hos mennesker. Bakteriene er resistente mot mange av de prosessene som brukes til å beskytte vår matforsyning, som tørking, salting, eller kjøling 1,2 og infeksjoner er vanligvis knyttet til bearbeidet, "ready-to-eat" mat som ikke er oppvarmet før konsum . I flere tidligere utbrudd, kilden til L. monocytogenes-forurenset mat ble identifisert, og begrenset gruppe av eksponerte individer ble overvåkes nøye 3-6. I disse eksemplene, klinisk sykdom hos ellers friske individer varierte fra en mild, selvbegrensende gastroenteritt til mer alvorlige tarm og systemiske infeksjoner som krevde sykehusinnleggelse. L. monocytogenes infeksjoner i svekket immunforsvar individer, inkludert både nyfødte og eldre, har vært forbundet med høy dødelighet (25-30%), selv med antibiotikabehandling
Den mest brukte modell av listeriosis er intravenøs (iv) inokulering av mus. Den iv modellen er svært reproduserbare, og har vært svært nyttig for å studere både naive og hukommelse T celle responser under infeksjonen 9,10. Ulempen med iv modellen er at den helt omgår intestinal fase av infeksjonen. Etter matbårne overføring, gir tarmslimhinnene en barriere som formodentlig bremser og begrenser antallet bakterier som kan kontinuerlig formidler til perifert vev. I motsetning, kan hele podestoff bli funnet i milten og leveren innen minutter IV-administrering, og denne store bolus av organismer kan overvelde medfødt immun defenses i disse vev. Oral infeksjon av mus ved gavage er mindre vanlig brukt, fordi store doser (10 9 -10 11 CFU) er vanligvis nødvendig for å oppnå kolonisering intestinal 10.. Også gjør magesekken (ig) inokulering med en fôring nålen ikke generere en reproduserbar periode med gastrointestinal infeksjon før systemisk spredning. Noen laboratorier har rapportert at L. monocytogenes nå milt og lever innen 4-12 timer etter infeksjon (HPI), mens andre viste ingen systemisk spredning inntil 48 HPI 11-15. Denne lab-til-lab variasjon kan være en konsekvens av invasiv art ig inokulasjon, noe som kan føre til mindre traume til slimhinnen i spiserøret, og fremme direkte blodet invasjon av bakterier.
Vi har nylig utviklet en ny musemodell av oral L. monocytogenes infeksjon som etterligner alle faser av menneskelig sykdom 16. Infeksjon oppstår når musene får i stykker av contaminerte mat, er en prosess som er ikke-traumatisk, og krever ikke spesielle ferdigheter ved laboratorie undersøkere. For en diskret tid (36-48 timer), L. monocytogenes reproduserbart kolonisere kun mage-tarmkanalen, noe som tillater undersøkelse av de mekanismene som brukes ved patogene Listeria å translocate over tarmslimhinnene og spre til perifere vev. Viktigere, kan modellen brukes til å studere forskjeller i verten medfødt motstand mot infeksjon. I en tidligere studie viste vi at BALB / c / Av / J mus var svært utsatt for matbårne listeriose, med eksponentiell replikering av L. monocytogenes som forekommer i tarmen, milt, lever, galleblære og 16.. I kontrast var C57BL / 6 mus resistente overfor matbårne infeksjon, med bare forbigående kolonisering av L. monocytogenes som forekommer i hvert av disse vev. En ekstra funksjon i matbårne modell som etterligner menneskelig sykdom er at naturlig formidlingtil hjernen skjedde under de senere stadier av infeksjonen (5-7 dpi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av selektiv agar Media (BHI / L + G) for å hemme tarmfloraen
- Vei opp 26 g hjerne hjerte infusjon Agar (Difco), 7,5 g LiCl og 5,0 g glycin og plasser i en 1 liters kolbe. Tilsett 500 ml med avionisert vann.
- Varme på en magnetrører inntil agar koker, kontinuerlig omrøring. Ta flasken av varmen, la boblene bosette kort stund, og deretter bringe tilbake til en byll igjen.
- . Autoklav i 30 minutter ved 121 ° C under 16-19 psi på en væske syklus Merk: La rørestav i kolben.
- Ekvilibrere mediet til 55 ° C i et vannbad eller lar avkjøle ved romtemperatur. Ikke la løsningen for å få kaldere enn 55 ° C eller krystaller vil danne i agar. Krystallene ikke hemme L. monocytogenes vekst eller påvirke de selektive egenskaper av mediet. Imidlertid vil krystallene være ligner på små kolonier, og vil gjøre det vanskelig å telle bakteriell CFU.
- Blandagar i 1 min ved hjelp av en magnetisk rører. Unngå dannelse av luftbobler. Hell agar i petriskåler (~ 25 ml / plate).
Merk: Dette mediet har ikke støtte veksten av alle L. monocytogenes. For eksempel, L. monocytogenes egde vokser godt på denne agar, med kolonier synlige innen 36-48 timer, men 10403s ikke vokser på dette mediet.
2. Fremstilling av inokulum
- Skjær skiver hvitt brød (Kroger) i små (2-3 mm) kuber med steril saks ora steril skalpell blad. Ikke bruk skorper. Oppbevar enkelte brikker i mikrosentrifugerør ved -20 ° C til den dagen av infeksjonen.
- Ved hjelp av en steril skalpell, skjære små (0,5-1 cm) biter av saltet smør (Kroger) og plasser hver i et sterilt mikrosentrifugerør. Hvert rør vil inneholde nok smør til å forberede 50-60 brød stykker. Oppbevares ved -20 ° C inntil nødvendig.
- Grow L. monocytogenes i BHI kjøttkraft risting ved 30 &grader, C til kulturen når en OD 600 av ~ 0,8-1,0. Forbered 500 mL alikvoter mikrosentrifugerørene, ta vare å vortex prøven ofte slik at alle rørene inneholder samme antall bakterier. Oppbevares ved -80 ° C.
- Å titer de bakterielle alikvoter, tine et rør på is, og deretter legge 500 mL til 9,5 ml BHI kjøttkraft. Inkuber i 1,5 time stående ved 30 ° C. Plate seriefortynning på BHI agar. Forvente en titer på 1-5 x 10 ~ 8 CFU / ml. Merk: Hvis homogene alikvoter er fremstilt, kan forvente hvert av rørene for å gi denne titer når de er fremstilt på en lignende måte med en varians på 2 til 4 ganger.
- For å infisere mus, forberede en delmengde av L. monocytogenes som beskrevet i trinn 2.4. Ca 20 min før L. monocytogenes kultur er klar, tine brød stykker på RT. Smelt en delmengde av smør ved 55 ° C og forvarme et lite volum av PBS ved 55 ° C. Forbered nok brød stykker slik at det er minst én per muså være infisert og minst en ekstra del for bestemmelse av titeren av selve inokulum.
- Basert på den forutbestemte titer av den bakterielle alikvot, beregner det totale volumet av L. monocytogenes kultur for å forberede inokulater for det nødvendige antall brød stykker. Pelletere bakteriene ved sentrifugering ved 14,000 xg i 10 min Aspirer alle BHI-buljong og resuspender bakterier i et lite volum av forvarmet PBS (2 mL / brød stykke).
- Vortex smeltet smør, legg til bakterier (ved hjelp av et totalt volum lik 3 mL / brød stykke) og bland godt. Merk: Ikke forsøk å forberede mer enn 10-15 brød stykker på en gang eller smør stivner.
- Arbeider raskt, pipette 5 pl av det bakterielle suspensjon på et enkelt stykke brød i et mikrosentrifugerør. Oppløsningen bør være fullstendig absorbert av brød stykke.
- For å bestemme den faktiske titer av inokulum, tilsett 1 ml steril PBS til en av brødet pieces. Vortex kraftig i 1 min. Forbered seriefortynning og plate både BHI og BHI / L + G agar.
- Alternativ prosedyre for høy titer (> 10 9 CFU) inokula. Ved den bakterielle pellet er for stor, kan det være vanskelig å suspendere i et så lite volum, og det resulterende materiale er meget viskøs, som en pasta, og noen av inokulum kan feste seg til sidene av mikrosentrifugerør. I dette tilfelle er det bedre å inokulere brødet i et sterilt 60 mm kultur tallerken, og for å gi hele fatet (uten lokk) til mus (se nedenfor). Eventuelle overskytende podestoff som ikke er absorbert av brødet kan deretter spises direkte av musen. Generelt tar det lengre tid for musene å spise alt av brød og slikke tallerken ren enn standard protokoll beskrevet nedenfor, så dette er bare den foretrukne metoden når du arbeider med svært høy titer inokulater.
3. Infeksjon i Mus
- Kjøp kvinnelige BALB / c / Av / J (stock # 0010026) og C57BL/6/J (lager000644 #) fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og bruke på 6-9 ukers alder.
- Fast musene en dag (24 timer) før infeksjon ved å fjerne mat og plassere musene på løftet (1 tomme) ledningen gulv (# 3 mesh, Allentown) for å hindre koprofagi. La bare nok sengetøy i buret for å absorbere urin, men ikke nok til å heve kaster avføring. Tillate ubegrenset tilgang til vann.
- Infisere mus ved utbruddet av den mørke syklusen, som arbeider i en laminær hette utstyrt med en rød lyspære. Overføre en enkelt mus til en tom (uten sengetøy) buret. Ved hjelp av en steril pinsett, overføre den forurensede brød brikken til bunnen av det tomme bur. Vanligvis vil musen plukke opp brødet stykke og fordøye det helt innenfor 2-10 min. Hvis musen ikke spise brød med en gang, tilbake i buret til rack og la musen urørt i 20-30 min. De fleste av dyrene vil spise brød innenfor dette tidsrommet, kan imidlertid musene stå uforstyrret, uten tilgang til othennes mat eller vann i opptil to timer.
- Etter infeksjon, returnere musen til sin opprinnelige bur og fylle mus chow. Fortsett å huse musene på ledning hevet gulv for varigheten av eksperimentet.
4. Overvåking av nivå av bakterier Shed i Avføring
- Etikett-og pre-veie mikrosentrifuge-rør som skal brukes for oppsamling av avføring.
- Arbeider raskt etter å hente et bur av mus, plassere hver mus i en 500 ml plast beger. Vanligvis musene vil utvise 1-4 avføring pellets innen 5 min.
- Bruk en steril pinsett til å overføre avføringen til riktig merket rør.
- Veie hvert rør og beregne vekten av avføringen ved å subtrahere vekten av den tomme rør. Typiske vekter for fekal pellets varierer 10-30 mg.
- Legg PBS til hvert rør (200 μl/30 mg avføring) og bruke en steril tannpirker til mos fecal pellets.
- Vortex hvert rør i 30 sekunder, deretter forberede seriefortynning og plate på BHI / L+ G agar. Telle antall kolonier og beregne CFU / mg avføring.
5. Behandling av infiserte Intestinal Vev
- Avlive mus, aseptisk høste magen og tarmene fra hver mus som en enkelt vev og samle inn tomme 100 mm petriskåler.
- Separer tynntarmen, blindtarmen, og tykktarm og plasser i separate 60 mm retter som er lagret på is. Tynntarmen kan videre deles av lengden i tre like deler tilnærmet tolvfingertarmen, jejunum og ileum å lette fjerning av luminal innholdet. De vev tredjedeler deretter kan behandles enten sammen (for CFU pr hele tynntarmen) eller separat. Våte vev med ~ 0,5 ml steril PBS for å holde bøyelig og forhindre tårer under håndtering.
- Fyll en 10 ml sprøyte med 8 ml steril PBS og legge ved en 25 g nål. Bruk steril tang å presse ut de luminal innholdet i en avfall beger (eller en steril 50 ml tube hvis samle luminal bakterier). FlusH 4 ml PBS gjennom en ende av vev, bruker tang for å presse ut innholdet, og deretter vende vev og gjenta i den andre enden.
- For å kvantifisere antallet av Listeria i luminal innholdet, sentrifuger oppsamlede spylinger i 20 min ved 12 000 xg, suspendere pelleten i 0,5 til 1,0 ml sterilt vann.
- For å kvantifisere det totale antall celle-assosiert mengde Listeria, åpner alle de vaskede vev ved å skjære i lengderetningen med steril skalpell blad, og deretter foreta flere laterale kutt for å skjære vevet i mindre fragmenter. Merk: Dette trinnet er nødvendig for å sikre at tarmvevet brytes ikke rundt homogenisatoren bladet. Overfør intestinal brikkene til en 15 ml sentrifugerør inneholder 2 ml sterilt vann.
- Steriliser en vevshomogenisator (Fisher PowerGen 1000) ved å plassere sonden i 70% etanol ved 60% kraft i 30 sek. Vent i etanol for å lufttørke, eller en prosess i sterilt vann i 10 sek. Homogenisere hver tissue i 1 min. Gjenta behandling med sterilt vann mellom hver prøve, og bruke 70% etanol mellom prøven grupper.
- Forbered serielle fortynninger av hver prøve i sterilt vann og plate på BHI / L + G agar.
6. Behandling av infiserte Mesenteric lymfeknuter
- Harvest lymfeknuter aseptisk, legg i en steril 60 mm rett på isen, og bruk steril pinsett til å fjerne all vedlagte fett. Forvente å finne 3-6 noder per mus.
- Forbered netting skjermer ved å kutte 1,5-2 tommers firkantede biter av rustfritt stål # 80 mesh. Lage et lite snitt i hvert hjørne, og fell ned de fire sidene, og skaper en hevet seng. Dypp i 95% etanol og deretter flammen å sterilisere, og plasser i en 60 mm petriskål som inneholder 0,75 ml sterilt vann. Etter hver bruk, kan skjermene resirkuleres ved bløtlegging i 70% etanol i 20 min, skrubbe med en børste for å fjerne innebygde vev, koking i 20-30 min i 2N NaOH, og deretter skylle grundig med vann.
- Bruk stempeletfra en steril 3 ml sprøyte til mos nodene gjennom mesh sikt. Sørg for å presse ned på skjermen til bunnen av fatet så det kommer i kontakt med vann i fatet.
- Pass 0,75 ml sterilt vann gjennom skjermen og deretter pipette opp og ned flere ganger for å rense skjermen. Overfør cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør.
- Vortex hver prøve kraftig i 30 sek for å lysere cellene. Forbered seriefortynning og plate på hver BHI / L + G agar.
7. Behandling av infiserte milt, lever, og Gall blærer
- Ta tak milt med steril tang og frigjøre ved å lage to stykker, en i hver ende. Plasser i en 15 ml tube inneholder 2,5 ml sterilt vann. (Merk: rør med rund bunn kan være lettere å bruke med homogenisatoren.)
- Finn galleblæren (en liten gul væskefylt sac festet til leveren) og klipp forsiktig med steril saks å løsne fra leveren uten sprengning. Transfeh til en mikrosentrifuge rør som inneholder 1 ml sterilt vann.
- Aseptisk fjerne leveren, og pass på å fjerne alle lapper, og overføre til en 15 ml sentrifugerør inneholder 2,5 ml sterilt vann.
- Homogeniser miltene og lever som beskrevet ovenfor i 30 sekunder på 60% effekt. Forgall blærer, bruk steril saks til å rive fra hverandre i mikrosentrifugerør, og deretter vortex kraftig i 30 sek.
- Forbered seriefortynning og plate hver prøve på enten BHI eller BHI / L + G agar.
8. Behandling av infiserte Brains
- Arbeid fra baksiden av musen, kutt i huden og vevet over nakken, og over begge ører i 45 ° vinkel. Bruk en steril pinsett til å skrelle av U-formet klaff av huden ved å trekke mot nesen og avsløre skallen og ansikts bein.
- Immobilisere skallen ved å holde den benete ryggen mellom øynene med en tang, og bruke saks for å lage grunt kutt over den laterale kanten av skallen. Væreforsiktig for å skjære kun benet og ikke hjernevevet. Deretter skjærer den benete ryggen mellom øynene. Bruk en tang for å holde toppen av skallen og trekker bakover (i retning av halsen) for å eksponere i hjernen.
- Løft forsiktig hjernen fra hulrommet sin ved hjelp av en steril pinsett og plasseres i en 15 ml sentrifugerør inneholder 1,5 ml sterilt vann.
- Homogeniser i 20 sekunder på 60% kraft som beskrevet ovenfor. Forbered seriefortynning og plate på hver BHI eller BHI / L + G agar.
9. Supplerende Fremgangsmåte: fraksjonering av Intestinal Vev
9.1 Isolering av bakterier i slim Fraksjon
- For hver intestinal vev, forberede tre rør som inneholder 3 ml 6 mM N-acetylcystein (NAC, Sigma # A-9165).
- Plasser rød og langsgående kutt vev i første rør i 1-2 min, kraft virvlende hvert 20-30 sek. Ved hjelp av sterile pinsetter, løft av vev og forsiktig klemme mot siden av røret for å fjerne overskudd av løsning foid.
- Gjenta trinn 9.1.2 to ganger mer å bruke de resterende NAC rør. Fjern tarmvevet, og satt til side for ytterligere prosessering.
- Pool NAC vasker (totalt 9 ml), og sentrifuger i 20 min ved 12.000 x g..
- Resuspender pellet i sterilt vann, vortex i 30 sek, forberede seriefortynning og plate på BHI / L + G.
9.2 Isolering av bakterier i epitelcelle (EF) Fraksjon
- Skjær hver vevet i små biter med steril saks og plasser i en 50 ml tube inneholder 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) supplert med 5% FBS (RP-5), 5 mM EDTA, og 1 mM DTT. Inkuber rysting ved 37 ° C i 20 min.
- Overfør intestinal bitene til et nytt rør som inneholder 5 ml RP5/EDTA/DTT og ruge risting ved 37 ° C i 20 min. Redd media fra første røret og satt ved 37 ° C. Gjenta denne prosessen en gang til for totalt tre 20 min inkubasjoner i RP5/EDTA/DTT. Hvis du går videre til lamina propria isoningen steg, overføre de resterende intestinal brikker i tomt 50 ml tube.
- Kombiner de tre RP5/EDTA/DTT vask (totalt volum på 15 ml) og sentrifuger ved lav hastighet (1.200 x g) for å pelletere cellene.
- For å kvantifisere ekstracellulære bakterier, samle supernatanten og sentrifuger i 20 min ved 12.000 x g.. Resuspender pelleten i 0,5 til 1,0 ml sterilt vann og plate seriefortynning på BHI / L + G agar.
- Å nummerere intracellulære bakterier, resuspender pelleten EC i 5 ml RP-5 inneholdende 25 ug / ml gentamicin. Inkuber enkel cellesuspensjon i 30 min ved 37 ° C pluss 7% CO2 for å drepe eventuelle gjenværende ekstracellulære L. monocytogenes. Vask cellene to ganger i PBS, suspendere i 0,5 ml sterilt vann, og virvle i 30 sek for å lysere cellene. Forbered seriefortynning i vann og plate på BHI / L + G.
Merk: Cellene som samles på dette stadiet vil også inneholde celler fra den underliggende Peyer sin Patches. Dersom det er ønskelig, er det synlige PeyerPatcher kan bli fjernet fra intestinal vev før spyling og kutte lengderetningen.
9.3 Isolering av bakterier i lamina propria (LP) Fraksjon
- Skyll det overskytende DTT / EDTA fra intestinal stykker ved å tilsette 25 ml steril PBS til røret. Rist kraftig, overføre til et nytt rør og gjenta to ganger.
- Overfør intestinal stykker til et 50 ml rør inneholdende 4 ml fordøyelse oppløsning bestående av RP-5 supplert med 1 mg / ml type IV kollagenase og 40 ug / ml DNAse I. Inkuber rysting ved 37 ° C i 40 min.
- Overfør ufordøyd brikker i et nytt rør som inneholder 4 ml fordøyelsen løsning og gjenta en gang eller to før vevet bitene er helt fordøyd. Lagre hver av fordøyelsen løsninger, som inneholder frigitte LP-celler ved 37 ° C.
- Sentrifuger sammenslåtte fordøyelsen løsninger på lavt turtall (1200 xg) til pellet cellene. Behandle supernatanten og cellen pellet separat som descrIBED ovenfor for å nummerere ekstracellulære og intracellulære bakterier, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L. monocytogenes kolonier vil være synlig på BHI / L + G plater etter 36-48 timers inkubasjon ved 37 ° C. Koloniene har en glatt, kuppelformet kremaktig hvitt utseende (figur 1A). Veksten vil være hemmet for flertallet av tarmfloraen, men det er vanlig å se noen kolonier som ikke L. monocytogenes, særlig ved plating tynntarmen eller kolon direkte uten vesentlig fortynning (figur 1B). Mistenker kolonier kan bekreftes ved platekledning på CHROMagar TM Listeria plater. L. monocytogenes vises som blå kolonier omgitt av en hvit halogen på disse platene (figur 1C). Deteksjonsgrensen for L. monocytogenes i hvert vev er avhengig av volumet av vannet som brukes til å homogenisere vevet. De prøvemengder er vist i tabell 1 representerer den minimalt volum behov for effektivt å behandle hvert vev. Homogenates av milt, galle blære, hjerne, eller fraksjonerte tarmvevet kan lagres ved 4 ° C i 1-2 dager og re-platet om nødvendig. Tykktarm, tynntarm eller leveren homogenates kan hemme noen L. monocytogenes vekst dersom prøven er fortynnet tilstrekkelig (fig. 1D), og disse homogenater ikke gir lignende CFU-teller hvis re-belagt etter lagring ved 4 ° C.
Vi har tidligere vist at BALB / c / Av / J (BALB) mus var betydelig mer utsatt for matbårne listeriose enn C57BL / 6 (B6) mus 16. Et inokulum av 10 CFU 7 er tilstrekkelig til å etablere tarminfeksjon i BALB mus, men minst 10 8 CFU er nødvendig for å kolonisere i mage-tarmkanalen av B6-mus (figur 2). Som vist i figur 2, vil den bakterielle belastningen i tarmen, milt, lever og galleblære være proporsjonal med dosen var gitt til musene. Foreløpige studier tyder på at 5 x 10 9 CFU erden omtrentlige LD 50 for BALB / c / Av / J mus ved hjelp av denne modellen 16.
Figur 1. Representant kolonivekst på selektive agarplater. A) L. monocytogenes kolonier etter 48 timers vekst på BHI / L + G agar. B) BHI / L + G agar hemmer veksten av de fleste tarmfloraen, men noen ikke-Listeria kolonier (pil) kan observeres ved lave fortynninger. Den agarplate vist her inneholder 100 pl av en 10 -1 fortynning på halvparten av platen, og 50 ul hver av de 10 -2 og -3 10 fortynninger av en kolon homogenat. C) L. monocytogenes kolonier kan bekreftes ved vekst på krom agar Listeria plater. L. monocytogenes vises blå med en hvit glorie rundt kolonien. D) Det er ikke uvanlig å see en hemming av L. monocytogenes vekst, noe som resulterer i kolonier av varierende størrelse i den laveste fortynning av enten tarm eller lever-homogenater platene på BHI / L + G agar.
Figur 2. Dose respons av matbårne infeksjoner i BALB / c / Av / J og C57BL / 6 mus. Kvinne BALB / c / Av / J (BALB) og C57BL / 6 (B6) mus ble smittet med 10 9 (n = 7), 10 8 (n = 8), 10 7 (n = 6) og 10 6 (n = 4) Lm INLA m og antallet av CFU i hvert vev ble bestemt 5 ppt. Middelverdier + / - SD vises. Samlede data fra to ulike eksperimenter ble analysert. Stiplede linjene indikerer deteksjonsgrensen i hvert organ.
| Vev | Sample volum (ml) en | Deteksjonsgrensen (CFU) |
| Tynntarmen | 2.0 | 50 |
| Cecum | 2.0 | 50 |
| Colon | 2.0 | 50 |
| Mesenteric lymfeknuter | 1.5 | 15 |
| Spleen | 2,5 | 50 |
| Liver | 2,5 | 50 |
| Galleblæren | 0.5 | 10 |
| Brain | 1.5 | 15 |
Tabell 1. Deteksjonsgrensen for L. monocytogenes i vev homogenates. en Gjennomsnittlig total prøve volum består av sterilt vann pluss homogenisert vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innavlede mus er ikke jevnt mottakelig for fôring til alle tider av døgnet, og deres vilje til å spise forurenset brød vil avhenge både av belastningen type og alder av musene 17. Vår erfaring er 6-9 uker gamle B6 mus er mottakelige for fôring når som helst på dagen, men BALB mus vil ikke konsekvent spise brød stykke med mindre det blir tilbudt i løpet av sin mørke syklus. Den lyssyklus av rommet før huset dyr kan bli endret slik det mørke fase faller sammen med den normale arbeidsdag for laboratoriepersonell. Imidlertid bør musene gis minst to uker for å akklimatisere seg til den endrede lys syklus før infeksjon. Under infeksjon, bør det bare røde lamper brukes i enten selve rommet eller i laminær strømningshette.
I utviklingen av denne modellen, brød ble valgt som matkilde å overføre L. monocytogenes i stor grad fordi brød er absorberende. Dermed var det lett å mette små biter med the bakteriell inoculum og sørge for at hver mus inntatt samme dose. Imidlertid kan denne modellen lett tilpasses til å bruke andre matkilder. Faktisk er dette den eneste mus modell som kan brukes til å direkte teste effekten av mat sammensetning eller lagringsforhold på bakteriell smitte. L. monocytogenes kan lett tilpasse seg veksten i høy salt, lav pH, eller kalde temperaturer 1,2,18, men det er ikke kjent om disse vekstvilkår endre bakteriens evne til å etablere tarminfeksjon.
Omtrent 10 minutter er nødvendig for å høste alle de infiserte organer fra en enkelt mus. Galleblæren er lett sprukket, så det er best å fjerne det først. Mesenteric lymfeknuter er lettest å få øye på når tarmen ikke har blitt forstyrret, så de bør fjernes neste. Tarmen kan høstes som en enkelt vev ved å kutte like under og like over magen appendix, og deretter separert i duodenum, jejunum, ileum, cecum og tykktarm like før spyling og homogenisering. Milten og leveren blir typisk fjernet ved siden av, og hjernen blir høstet etter henting organer fra bukhulen, som det er nødvendig å slå av markøren over for å få tilgang til skallen. Når man arbeider med flere mus, bør alle vev lagres på is inntil behandlet. For de fleste vev, ble en agarplate som brukes til å bestemme det totale antallet CFU til stede i vevet. Platen ble delt i tredjedeler og en 50-100 mL prøve av tre separate fortynninger av vev homogenat var belagt på hver tredje.
Metodene som beskrives her vil identifisere det totale antall L. monocytogenes i hver mus vev, ikke bare den intracellulære organismer. Den unike intracellulære livsstil L. monocytogenes er tenkt å være en viktig virulens faktor under infeksjonen 18,19. Men L. monocytogenes er fakultativ, ikke obligate, intracellulære patogener, og there er ingen definitive publiserte rapporter for å angi hvor stor prosentandel av Listeria som faktisk bor innenfor celler in vivo. De fleste tidligere studier med oral L. monocytogenes infeksjon avhengig av gentamicin behandling av gut vev å hemme veksten av tarmfloraen. Forbehandling med gentamicin har potensial til å eliminere ekstracellulære L. monocytogenes, som tillater gjenvinning av bare den intracellulære bakterier, men det er ikke klart i hvilken grad gentamicin er i stand til å trenge gjennom hele intestinal vev in vitro. Den supplementære protokollen beskrevet her gjør det mulig å bestemme både ekstracellulære og intracellulære bakterier i mucus lag, epitel, og lamina propria kupé av infiserte intestinal vev. I denne prosedyren, er gentamicin brukes til å behandle enkle cellesuspensjoner, slik at alle bakterier ble gjenvunnet inne i cellene i vevet.
Tre vask med NAC vanligvis rebeveget flertallet av slim fra intestinal vev, og de sammenslåtte vaskinger inneholdt ikke noen eukaryote celler (levedyktig eller døde), bestemt ved trypan blå farging. Andre vasker ikke gi synlig slim som bestemmes av Diff-Quik farging av Cytospin lysbilde forberedelser. Den cellularitet av EF-og LP-fraksjoner kan også bekreftes ved hjelp Diff-Quik eller Giemsa farging. EC-fraksjon bør bestå av hovedsakelig epitelceller, som lett kan skilles fra de få intraepitelisk lymfocytter stede i intestinal epitelium. LP-fraksjonen er mer mangfoldig, inneholdende en blanding av mono-nukleære celler som endrer sammensetningen etter infeksjon når inflammatoriske monocytter infiltrere vevet.
Den matbårne modell av listeriosis kan brukes sammen med et bredt utvalg av L. monocytogenes isolater, inkludert mus-tilpasset INLA m-uttrykke belastning 15 beskrevet her, villtype egde, og sletting mutant deriter som er tilpasset av disse stammer 16. I en tidligere studie viste vi at nivået av intestinal kolonisering ikke variere vesentlig fra disse stammer imidlertid gjorde isolater som ikke uttrykker en høy affinitet for ligand murine E-cadherin ha en viss defekt i formidling til de mesenteriale lymfeknutene og milt 16. På samme måte kan en hvilken som helst mus belastning brukes til infeksjon, noe som gjør dette til et attraktivt modellsystem for å studere både bakterie-og vert patogenese responser på infeksjon. Til slutt, selv om vi ennå ikke har testet dette direkte, foreslår vi at de grunnleggende prosedyrer som brukes her bør være allment gjeldende for andre matbårne bakterier som Salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter og Citrobacter arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser. Alle eksperimentene som er beskrevet her ble utført i samsvar med The Office for Laboratory Animal Welfare (OLAW) med godkjenning av ICAUC ved University of Kentucky.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (AI079442 og AI091918) tildelt SEFD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
