Summary
Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren für die orale Infektion von Mäusen mit
Abstract
L. monocytogenes sind fakultativ intrazelluläre bakterielle Erreger, die durch Lebensmittel übertragenen Infektionen beim Menschen verursachen. Sehr wenig ist über den Magen-Phase der Listeriose aufgrund des Fehlens von einem kleinen Tier-Modell, das imitiert menschliche Krankheit bekannt. Dieses Papier beschreibt eine neue Maus-Modell für die orale Übertragung von L. monocytogenes. Mit diesem Modell, Mäusen, L. monocytogenes-kontaminierte Brot haben eine diskrete Phase des Magen-Darm-Infektion, durch unterschiedliche Grade der systemischen Ausbreitung bei empfindlichen (BALB / c / von / J) oder resistent (C57BL / 6) Mäusestämmen gefolgt. In den späteren Stadien der Infektion, ist die Verbreitung auf der Gallenblase und des Gehirns beobachtet. Die Lebensmittel übertragenen Modell der Listeriose ist in hohem Maße reproduzierbar, erfordert keine speziellen Fähigkeiten, und kann mit einer Vielzahl von bakteriellen Isolaten und Labormaus-Stämmen verwendet werden. Als solches ist es das ideale Modell, um beide Strategien Virulenz von L. verwendet studieren monocytogenes
Introduction
Listeria monocytogenes sind fakultativ intrazelluläre bakterielle Erreger, die durch Lebensmittel übertragenen Infektionen beim Menschen verursachen. Die Bakterien sind resistent gegen viele der Prozesse verwendet werden, um unsere Versorgung mit Lebensmitteln, wie z. B. dem Austrocknen zu schützen, Salzen oder Kälte 1,2 und Infektionen sind in der Regel zu verarbeiten, "ready-to-eat" Lebensmittel, die nicht erhitzt werden vor dem Verzehr verbunden . In mehreren früheren Ausbrüchen, die Quelle der L. monocytogenes-kontaminierte Lebensmittel identifiziert wurde, und die eingeschränkte Gruppe von exponierten Personen war eng 3-6 überwacht. In diesen Beispielen klinischen Erkrankung bei ansonsten gesunden Personen von einem milden, selbst limitierende Gastroenteritis zu schweren Darm-und systemische Infektionen, die eine stationäre Aufnahme. L. variiert monocytogenes Infektionen bei Menschen mit geschwächtem Immunsystem, einschließlich der beiden Neugeborenen und älteren Menschen haben mit einer hohen Sterblichkeit (25-30%) in Verbindung gebracht, auch mit einer Antibiotika-Behandlung
Die am weitesten verbreitete Modell Listeriose intravenöse (iv) Impfung von Mäusen. Die iv-Modell ist in hohem Maße reproduzierbar, und war äußerst nützlich für die Untersuchung sowohl naive und Gedächtnis-T-Zell-Reaktionen während der Infektion 9,10. Der Nachteil der iv Modells ist, dass es vollständig umgeht die intestinale Phase der Infektion. Nach lebensmittelbedingten Übertragung stellt die Darmschleimhaut eine Barriere, die vermutlich verlangsamt und begrenzt die Anzahl der Bakterien, die kontinuierlich zu peripheren Geweben zu verbreiten. Im Gegensatz dazu kann der gesamte Impfstoff in der Milz und der Leber innerhalb weniger Minuten von iv-Gabe gefunden werden, und diese große Bolus von Organismen können angeborene Immunsystem überwältigen defenses in diesen Geweben. Oral Infektion von Mäusen über eine Sonde weniger häufig verwendet, weil hohe Dosen (10 9 -10 11 CFU) sind in der Regel erforderlich, um zu erreichen Darmbesiedlung 10. Auch dann, wenn intragastrischen (ig) Impfung mit einer Nadel Fütterung nicht zu einer reproduzierbaren Zeitraum von Magen-Darm-Infektion vor der systemischen Ausbreitung. Einige Labors haben berichtet, dass L. monocytogenes erreichen die Milz und Leber innerhalb 4-12 Stunden nach der Infektion (hpi), während andere zeigten keine systemische Ausbreitung bis zu 48 hpi 11-15. Dieses Labor zu Labor Variation kann eine Folge der invasiven Art der Impfung ig sein, das kann in kleinere Verletzungen der Schleimhaut der Speiseröhre führen und den direkten Blutbahn Invasion der Bakterien.
Wir haben vor kurzem eine neuartige Maus-Modell der oralen L. monocytogenes Infektion, imitiert alle Phasen der Krankheit beim Menschen 16. Infektion tritt auf, wenn die Mäuse aufnehmen Stücke contaminiertes Essen, ein Prozess, der nicht-traumatische ist, und erfordert keine speziellen Fähigkeiten durch Labor Ermittler. Für einen diskreten Zeitraum (36-48 Std.), L. monocytogenes reproduzierbar nur besiedeln den Magen-Darm-Trakt, so dass die Untersuchung der Mechanismen, durch pathogene Listeria verwendet, um über die Darmschleimhaut transloziert und verbreiten peripheren Geweben. Wichtig ist, dass das Modell verwendet werden, um Unterschiede in der Host angeborene Resistenz gegen die Infektion zu untersuchen. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass BALB / c / von / J Mäuse sehr anfällig für Lebensmittelvergiftungen Listeriose waren, mit exponentiellen Vermehrung von L. monocytogenes vorkommenden im Darm, Milz, Leber und Gallenblase 16. Im Gegensatz dazu wurden C57BL / 6 Mäuse gegen durch Lebensmittel übertragenen Infektion mit nur transient Kolonisierung L. monocytogenes vorkommenden in jedem dieser Gewebe. Ein zusätzliches Merkmal der durch Lebensmittel übertragenen Modell, das imitiert menschliche Krankheit ist, dass natürliche Verbreitungauf das Gehirn aufgetreten während der späteren Stadien der Infektion (5-7 dpi).
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Protocol
1. Herstellung von Selektivagar Medien (BHI / L + G) zu sperren Darmflora
- Abwiegen 26 g Brain Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g und 5,0 g LiCl Glycin und in einen 1-Liter-Kolben. In 500 ml entionisiertem Wasser.
- Wärme auf einem Magnetrührer bis der Agar kocht, unter ständigem Rühren. Nehmen Sie die Flasche vor der Hitze, lass die Blasen kurz absetzen, und dann wieder zu einem nochmals aufkochen.
- . Autoklav für 30 min bei 121 ° C unter 16-19 psi auf einer Flüssigkeit Zyklus Hinweis: Lassen Sie den Rührstab in den Kolben.
- Equilibrieren die Medien bis 55 ° C in einem Wasserbad oder lassen bei RT cool. Lassen Sie die Lösung, um kühler als 55 ° C oder Kristalle in den Agar zu bilden. Die Kristalle nicht hemmen L. monocytogenes Wachstum oder beeinflussen die selektiven Eigenschaften der Medien. Allerdings werden die Kristalle im Aussehen ähnlich sein, um kleine Kolonien und machen es schwierig, bakteriellen CFU zählen.
- Vorsichtig mischen dieAgar für 1 min mit einem Magnetrührer. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Gießen Sie das Agar in Petrischalen (~ 25 ml / Platte).
Hinweis: Diese Medien nicht unterstützt das Wachstum von allen L. monocytogenes Stämme. Zum Beispiel L. monocytogenes EGDe wächst gut auf diesem Agar, mit sichtbaren Kolonien innerhalb 36-48 Stunden, aber 10403S nicht auf diesem Medium wachsen.
2. Vorbereitung des Inokulums
- Schneiden Sie Scheiben Weißbrot (Kroger) in kleine (2-3 mm) Würfel mit einer sterilen Schere ora sterilen Skalpell. Verwenden Sie nicht die Krusten. Bewahren Sie einzelne Stücke in Reaktionsgefäße bei -20 ° C bis zu dem Tag der Infektion.
- Mit einem sterilen Skalpell, klein geschnitten (0,5-1 cm) Stücke von gesalzener Butter (Kroger) und legen jeweils in einem sterilen Reaktionsgefäß. Jedes Röhrchen enthält genügend Butter bis 50 vorbereiten - 60 Stück Brot. Lagerung bei -20 ° C bis zum Gebrauch.
- Wachsen L. monocytogenes in BHI-Bouillon Schütteln bei 30 ° C bis die Kultur eine OD 600 von ~ 0,8-1,0 erreicht. Bereiten Sie 500 ul Aliquots in Reaktionsgefäße, wobei darauf zu achten Wirbel die Probe häufig so alle Rohre die gleiche Anzahl von Bakterien enthalten. Lagerung bei -80 ° C.
- Um die bakterielle Aliquots Titer auftauen ein Rohr auf Eis, dann fügen Sie 500 ul bis 9,5 ml BHI-Bouillon. Inkubation für 1,5 Std. Stehen bei 30 ° C. Teller serielle Verdünnungen auf BHI-Agar. Erwarten einen Titer von ca. 1-5 x 10 8 CFU / ml. Hinweis: Wenn homogenen Aliquots hergestellt werden, erwartet jedes der Rohre, um diese Titer zu erhalten, wenn sie in einer ähnlichen Weise mit einer Abweichung von 2 bis 4-fachen hergestellt.
- Um Mäuse infizieren, bereiten ein Aliquot von L. monocytogenes wie in Schritt 2.4 beschrieben. Etwa 20 Minuten vor der L. monocytogenes Kultur ist bereit, tauen Sie die Stücke Brot bei RT. Melt ein Aliquot der Butter auf 55 ° C vorwärmen und ein kleines Volumen von PBS bei 55 ° C Planen genug Brot Stücke, so dass es mindestens eine pro Mausinfiziert und mindestens ein zusätzliches Stück zur Bestimmung des Titers der tatsächlichen Inokulum.
- Basierend auf der vorbestimmten Titer des bakteriellen Aliquot berechnet das Gesamtvolumen des L. monocytogenes Kultur benötigt, um die Inokula für die erforderliche Anzahl von Brot Stücke herzustellen. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 14.000 g für 10 min absaugen alle BHI-Bouillon und resuspendieren die Bakterien in einem kleinen Volumen vorgewärmten PBS (2 ul / Stück Brot).
- Vortex die geschmolzene Butter, um Bakterien (mit einem Gesamtvolumen in Höhe von 3 ul / Stück Brot) hinzufügen und gründlich mischen. Hinweis: Versuchen Sie nicht, mehr als 10-15 Stück Brot auf einmal, oder die Butter verfestigen vorzubereiten.
- Arbeiten schnell, Pipette 5 ul der Bakteriensuspension auf einem einzigen Stück Brot in einem Reaktionsgefäß. Die Lösung sollte vollständig vom Brot Stück aufgenommen werden.
- Um die tatsächliche Titer des Inokulums bestimmen, 1 ml steriler PBS auf eine der Brot pieces. Vortex kräftig für 1 min. Bereiten serielle Verdünnungen und Platte sowohl BHI und BHI / L + G-Agar.
- Alternative Verfahren für hohe Titer (> 10 9 CFU) Inocula. Wenn das bakterielle Pellet zu groß ist, kann es schwierig sein, in einem so kleinen Volumen auszusetzen, und das erhaltene Material ist sehr viskosen, wie eine Paste, und einige der Inokulum kann an den Seiten des Mikrozentrifugenröhrchen haften. In diesem Fall ist es besser, das Brot in einem sterilen 60 mm Kulturschale inokulieren, und die gesamte Schale (ohne Deckel) an der Maus bieten (siehe unten). Überschüssiges Inokulum, die nicht durch das Brot aufgenommen werden dann direkt von der Maus gegessen werden. Im Allgemeinen ist es mehr für die Mäuse, um alle dem Brot essen und lecken die Teller sauber als das Standardprotokoll beschrieben nimmt, so ist dies nur die bevorzugte Methode, wenn es um sehr hohe Titer Inocula.
3. Infektion von Mäusen
- Kauf weibliche BALB / c / By / J (stock # 0010026) und C57BL/6/J (stock# 000644) von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) und verwenden sie 6-9 Wochen alt sind.
- Schnell die Mäuse einen Tag (24 Stunden) vor der Infektion durch das Entfernen der Lebensmittel und platzieren die Mäuse auf erhöhten (1 Zoll) Draht Bodenbelag (# 3 mesh; Allentown) zu coprophagy verhindern. Lassen Sie nur genug Betten in den Käfig, um Urin zu absorbieren, aber nicht genug, um Schuppen Fäkalien zu erheben. Erlauben Sie unbeschränkten Zugang zu Wasser.
- Infect die Mäuse zu Beginn der Dunkel-Zyklus, die in einem Laminarströmungshaube mit einer roten Glühbirne ausgestattet. Übertragen einer einzigen Mausklick auf eine leere (kein Bettzeug) Käfig. Mit einer sterilen Pinzette, übertragen Sie die kontaminierten Brot Stück auf den Boden des leeren Käfig. Typischerweise wird die Maus abholen das Brot Stück und verbrauchen es vollständig innerhalb 2-10 min. Wenn die Maus nicht essen das Brot sofort, geben Sie den Käfig zu zerbrechen und verlassen Maus ungestört für 20-30 min. Die Mehrheit der Tiere wird das Brot innerhalb dieses Zeitrahmens zu essen, jedoch können die Mäuse ungestört gelassen werden, ohne Zugang zu otihre Nahrung oder Wasser für bis zu 2 Stunden.
- Nach der Infektion der Maus zurück in seine ursprüngliche Käfig und füllt die Mäusefutter. Weiter, um die Mäuse auf erhöhten Draht Bodenbelag für die Dauer des Experiments zu beherbergen.
4. Überwacht den Grad der Bakterien Schuppen in Kot
- Etiketten-und pre-wiegen Mikrozentrifugengefäße für Sammlung von Kot verwendet werden.
- Arbeiten schnell nach dem Abrufen eines Käfigs von Mäusen, platzieren Sie jede Maus in einem 500 ml Kunststoffbecher. Typischerweise werden die Mäuse 1-4 Hocker Pellets innerhalb von 5 min zu vertreiben.
- Verwenden Sie eine sterile Pinzette Kot auf entsprechend gekennzeichneten Röhrchen übertragen.
- Wiegen Sie jedes Rohr und berechnet das Gewicht der Fäkalien, indem das Gewicht der leeren Hülse. Typische Gewichte für fäkale Pellets reichen von 10 bis 30 mg.
- In PBS in jedes Röhrchen (200 mg μl/30 Kot) und eine sterile Zahnstocher Maische die fäkalen Pellets.
- Vortex jedes Röhrchen für 30 Sekunden, dann bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf BHI / L+ G Agar. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien und berechnen KBE / mg Kot.
5. Verarbeitung von Infected Darmgewebe
- Euthanize die Mäuse, aseptisch ernten den Magen und Darm von jeder Maus als ein einzelnes Gewebe und sammeln in leer 100 mm Petrischalen.
- Trennen Sie die Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm und in getrennten 60 mm Schalen auf Eis gelagert. Dünndarm kann weiter durch Länge werden in drei gleiche Stücke Annähern der Duodenum, Jejunum, Ileum und um die Entfernung der luminalen Inhalte erleichtern unterteilt. Die Gewebe Drittel kann dann entweder gemeinsam verarbeitet werden (CFU pro ganzen Dünndarm) oder getrennt. Feuchttachentücher mit ~ 0,5 ml sterilem PBS zu halten und zu verhindern, biegsam Tränen während der Handhabung.
- Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit 8 ml sterilem PBS und fügen Sie eine 25 g Nadel. Mit einer sterilen Pinzette den Squeeze-out der luminalen Inhalt in ein Becherglas Abfall (oder einer sterilen 50-ml-Tube, wenn das Sammeln der luminalen Bakterien). Grippenh 4 ml PBS durch ein Ende des Gewebes, verwenden Sie die Zange den Squeeze-out der Inhalte, und dann drehen Sie das Gewebe über und auf der anderen Seite wiederholen.
- Um die Anzahl der Listerien in der luminalen Inhalte quantifizieren, zentrifugieren Sie die gepoolten spült für 20 min bei 12.000 xg, aussetzen das Pellet in 0,5 - 1,0 ml sterilem Wasser.
- Um die Gesamtzahl der Zell-assoziierten Menge Listeria quantifizieren, öffnen Sie die gewaschenen Gewebe durch Schneiden in Längsrichtung mit sterilem Skalpell, und dann mehrere seitliche Schnitte, um das Gewebe in kleinere Fragmente schneiden. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Darmgewebe nicht um den Homogenisator Klinge wickeln. Übertragen der Darm-Stücke in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 2 ml sterilem Wasser.
- Sterilisieren eine Gewebehomogenisator (Fisher PowerGen 1000), indem Sie die Sonde in 70% Ethanol bei 60% Leistung für 30 Sekunden. Warten Ethanol an der Luft trocknen, oder Verfahren in sterilem Wasser für 10 Sekunden. Homogenisieren jedes tiusgabe für 1 min. Wiederholen Sie die Behandlung mit sterilem Wasser zwischen jeder Probe, und verwenden 70% Ethanol zwischen Probe Gruppen.
- Bereiten serielle Verdünnungen jeder Probe in sterilem Wasser und Teller auf BHI / L + G-Agar.
6. Verarbeitung von Infected Mesenteriallymphknoten
- Ernte Lymphknoten aseptisch, in eine sterile 60 mm-Schale auf Eis, und verwenden sterilen Pinzette, um alle angeschlossenen Fett zu entfernen. Erwarten Sie, um 3-6 Knoten pro Maus zu finden.
- Bereiten Drahtsiebe indem 1,5-2 cm quadratische Stücke aus Edelstahl # 80 mesh. Machen Sie einen kleinen Schnitt in jeder Ecke, und klappen Sie die vier Seiten, die Schaffung eines Hochbeet. Tauchen Sie in 95% Ethanol und dann Flamme zu sterilisieren, und in eine 60 mm Petrischale mit 0,75 ml sterilem Wasser. Nach jedem Gebrauch, können die Bildschirme durch Einweichen in 70% Ethanol für 20 min, Schrubben mit einer Bürste zu eingebetteten Geweben zu entfernen, Kochen für 20-30 min in 2N NaOH und dann ausgiebig mit Wasser spülen recycelt werden.
- Verwenden Sie den Kolbenaus einer sterilen 3 ml Spritze Maische die Knoten durch das Sieb. Achten Sie darauf, drücken Sie auf dem Bildschirm, um den Boden der Schale, damit es Kontakt mit dem Wasser in der Schale macht.
- Pass 0,75 ml sterilem Wasser durch das Sieb und dann und Abpipettieren mehrmals, um den Bildschirm zu spülen. Übertragen Zellsuspension auf eine Mikrozentrifugenröhrchens.
- Vortex jede Probe kräftig für 30 sec die Zellen zu lysieren. Bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf beiden BHI / L + G-Agar.
7. Verarbeitung von infizierten Milz, Leber, Gallenblase und
- Fassen Milz mit einer sterilen Pinzette und befreien, indem sie zwei Schnitte, eine an jedem Ende. Platz in einem 15 ml Röhrchen mit 2,5 ml sterilem Wasser. (Hinweis: Gefäße mit rundem Boden kann einfacher sein, mit dem Homogenisator verwendet werden.)
- Suchen Sie die Gallenblase (ein kleiner gelber Flüssigkeit gefüllten Sack an der Leber) und snip vorsichtig mit einer sterilen Schere aus Leber, ohne zu platzen lösen. Transf.er in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem Wasser.
- Aseptisch entfernen Sie die Leber, und achten Sie auf alle Lappen entfernen, und übertragen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 2,5 ml sterilem Wasser.
- Homogenisieren Milz und Leber, wie oben für 30 sec auf 60% Leistung beschrieben. Forgall Blasen, sterile Schere zu zerreißen in der Mikrozentrifugenröhrchens und dann kräftig vortexen für 30 Sekunden.
- Bereiten serielle Verdünnungen und Platte jede Probe auf beiden BHI oder BHI / L + G-Agar.
8. Verarbeitung von Infected Brains
- Ausgehend von der Rückseite der Maus, schneiden die Haut und das Gewebe über dem Hals und über beide Ohren in einem 45 °-Winkel. Verwenden Sie eine sterile Pinzette abziehen des U-förmigen Hautlappen durch Ziehen in Richtung der Nase und setzen den Schädel und Gesichtsknochen.
- Unbeweglichkeitseffekt den Schädel durch Halten des knöchernen Kamm zwischen den Augen mit einer Zange und mit einer Schere flach quer durch den seitlichen Rändern des Schädels machen. Seien SieAchten Sie darauf, nur die Knochen und nicht das Gehirn Gewebe zu schneiden. Dann schneiden die knöcherne Kamm zwischen die Augen. Verwenden Sie eine Zange, um die Oberseite des Schädels zu halten und nach hinten ziehen (Richtung Hals), um das Gehirn freizulegen.
- Heben Sie das Gehirn aus seinem Hohlraum mit einer sterilen Pinzette entnommen und in einen 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 1,5 ml sterilem Wasser.
- Homogenisieren für 20 sec auf 60% Leistung, wie oben beschrieben. Bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf beiden BHI oder BHI / L + G-Agar.
9. Supplemental Vorgehensweise: Fraktionierung von Darmgewebe
9.1 Isolierung von Bakterien im Schleim Fraction
- Für jede Darmgewebe vorzubereiten 3 Röhrchen mit 3 ml 6 mM N-Acetylcystein (NAC, Sigma # A-9165).
- Legen Sie die gerötete und längs geschnitten Gewebe in der ersten Röhre für 1-2 min, energisch wirbelnden jede 20-30 sek. Mit einer sterilen Pinzette, abholen das Gewebe und leicht gegen die Seite der Röhre quetschen, um überschüssige liqu entfernenID.
- Wiederholen Sie Schritt 9.1.2 noch zweimal mit den verbleibenden NAC Rohre. Entfernen Sie das Darmgewebe und beiseite stellen für die weitere Verarbeitung.
- Pool der NAC wäscht (insgesamt 9 ml) und Zentrifuge für 20 min bei 12.000 x g.
- Das Pellet in sterilem Wasser, Wirbel für 30 sec, bereiten serielle Verdünnungen und Platte auf BHI / L + G.
9.2 Isolierung von Bakterien in den Epithelzellen (EG) Fraction
- Schneiden Sie die einzelnen Gewebe in kleine Stücke mit einer sterilen Schere und in einem 50 ml Röhrchen mit 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) mit 5% FBS (RP-5), 5 mM EDTA und 1 mM DTT ergänzt. Inkubieren unter Schütteln bei 37 ° C für 20 min.
- Übertragen Sie die Darm-Stücke in ein frisches Röhrchen mit 5 ml RP5/EDTA/DTT und Inkubation unter Schütteln bei 37 ° C für 20 min. Speichern Sie die Medien aus dem ersten Rohr und beiseite stellen bei 37 ° C Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal mehr für insgesamt drei 20 min Inkubation in RP5/EDTA/DTT. Wenn Sie mit dem Lamina propria isonung Schritt, übertragen Sie die verbleibenden Darm-Stücke in den leeren 50-ml-Tube.
- Kombinieren Sie die drei RP5/EDTA/DTT Wäschen (Gesamtvolumen 15 ml) und Zentrifuge bei niedriger Geschwindigkeit (1.200 xg) zur Pelletierung der Zellen.
- Um extrazellulären Bakterien zu quantifizieren, den Überstand und Zentrifuge für 20 min bei 12.000 x g. Das Pellet in 0,5 - 1,0 ml steriles Wasser und Platte serielle Verdünnungen auf BHI / L + G-Agar.
- Um intrazelluläre Bakterien aufzuzählen, suspendieren die EG-Pellet in 5 ml RP-5 mit 25 ug / ml Gentamicin. Inkubieren Sie die einzigen Zellsuspension für 30 min bei 37 ° C plus 7% CO 2 zu töten alle verbleibenden extrazellulären L. monocytogenes. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS, aussetzen in 0,5 ml sterilem Wasser und Vortex für 30 Sekunden, um die Zellen zu lysieren. Bereiten serielle Verdünnungen in Wasser und Teller auf BHI / L + G.
Hinweis: Die Zellen in dieser Phase gesammelt werden auch Zellen aus dem zugrunde liegenden Peyer-Patches. Falls gewünscht, ist die sichtbare PeyerPatches können vom Darmgewebe entfernt werden, bevor Spülen und Schneiden in Längsrichtung.
9.3 Isolierung von Bakterien in der Lamina propria (LP) Fraction
- Spülen Sie die überschüssige DTT / EDTA von den Darm Stücke durch Zugabe von 25 ml sterilem PBS auf das Rohr. Kräftig schütteln, in ein frisches Röhrchen übertragen und zweimal wiederholen.
- Übertragen der Darm-Stücke in ein 50 ml Röhrchen mit 4 ml Aufschlusslösung aus RP-5 mit 1 mg / ml Kollagenase Typ IV und 40 ug / ml DNase I inkubieren ergänzt Schütteln bei 37 ° C für 40 min.
- Übertragen Sie die unverdaute Stücke in ein frisches Röhrchen mit 4 ml Lösung Verdauung und wiederhole noch einmal oder zweimal, bis die Gewebestücke vollständig verdaut werden. Speichern jeder der Verdauung Lösungen, die befreit LP Zellen enthalten, bei 37 ° C
- Zentrifugieren Sie die gepoolten Aufschlusslösungen bei niedriger Geschwindigkeit (1.200 xg) zur Pelletierung der Zellen. Verarbeiten Sie den Überstand und Zellpellet getrennt als descroben, um extra-und intrazellulären Bakterien aufzuzählen bzw. ibed.
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Representative Results
L. monocytogenes Kolonien sichtbar sein wird auf BHI / L + G Platten nach 36-48 h Inkubation bei 37 ° C. Die Kolonien haben eine glatte, kuppelförmige cremig weißes Aussehen (Abbildung 1A). Das Wachstum wird für die Mehrheit der Darmflora verhindert werden, aber es ist üblich, einige Kolonien, die nicht L. sehen monocytogenes, besonders beim Plattieren Dünndarm oder Dickdarm direkt ohne wesentliche Verdünnung (1B). Suspect Kolonien können durch Plattieren auf CHROMagar TM Listeria Platten bestätigt werden. L. monocytogenes als blaue Kolonien, die von einem weißen Heiligenschein auf diesen Platten (1C) umgeben ist. Die Nachweisgrenze für L. monocytogenes in jedem Gewebe ist abhängig von der Menge an Wasser verwendet werden, um das Gewebe zu homogenisieren. Die Probenvolumina in Tabelle 1 gezeigt sind, stellen die minimalen Volumen benötigt, um effektiv zu verarbeiten jedes Gewebe. Homogenate von Milz, gAlle Blase, Gehirn, oder fraktionierte Darmgewebe können bei 4 ° C für 1-2 Tage gelagert und wieder ausplattiert, falls erforderlich. Colon, Dünndarm oder Leberhomogenaten hemmen können einige L. monocytogenes Wachstum sei denn Probe ausreichend (1D) verdünnt, und diese Homogenaten nicht ergeben ähnliche KBE-Zählungen, wenn re-plated nach Lagerung bei 4 ° C.
Wir haben bereits gezeigt, dass BALB / c / von / J (BALB) Mäuse deutlich anfälliger für Lebensmittel übertragenen Listeriose als C57BL / 6 (B6) Mäuse 16 waren. Ein Inokulum von 10 7 CFU genügt Darm-Infektion in Mäusen BALB etablieren, jedoch mindestens 10 8 CFU benötigt wird, um den Magen-Darm-Trakt von B6-Mäusen (Abbildung 2) zu kolonisieren. Wie in 2 gezeigt, wird die Keimzahl in den Darm, Milz, Leber und Gallenblase proportional zu der Herausforderung Dosis, die den Mäusen. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass 5 x 10 9 CFU istdie ungefähre LD 50 für BALB / c / von / J-Mäuse mit diesem Modell 16.
Abbildung 1. Repräsentative Koloniewachstum auf selektiven Agarplatten. A) L. monocytogenes Kolonien nach 48 h Wachstum auf BHI / L + G-Agar. B) BHI / L + G Agar hemmt das Wachstum der meisten Darmflora, aber einige nicht-Listerienkolonien (Pfeil) können bei niedrigen Verdünnungen beobachtet werden. Die Agar-Platte hier gezeigten enthält 100 ul einer 10 -1 Verdünnung auf die Hälfte der Platte, und 50 ul jedes der 10 -2 und 10 -3 Verdünnungen von einem Doppelpunkt Homogenat. C) L. monocytogenes Kolonien können durch Wachstum auf CHROM-Agar Listeria Platten bestätigt werden. L. monocytogenes erscheinen blau mit einem weißen Heiligenschein rund um die Kolonie. D) Es ist nicht ungewöhnlich, dass see eine Hemmung von L. monocytogenes Wachstum, was in Kolonien unterschiedlicher Größe, in der niedrigsten Verdünnung entweder Darm oder Leberhomogenaten Platten auf BHI / L + G-Agar.
Abbildung 2. Dosis-Antwort von Lebensmittel übertragenen Infektion in BALB / c / von / J und C57BL / 6 Mäusen. Weibliche BALB / c / von / J (BALB) und C57BL / 6 (B6)-Mäuse wurden mit 10 9 (n = 7) infiziert, 10 8 (n = 8), 10 7 (n = 6) und 10 6 (n = 4) Lm InlA m und die Anzahl der CFU in jedem Gewebe wurden 5 dpi bestimmt. Mittelwerte + / - SD gezeigt. Die gesammelten Daten aus zwei verschiedenen Experimenten wurden analysiert. Die gestrichelten Linien geben die Nachweisgrenze in jedem Organ.
| Tissue | Probenvolumen (ml) ein | Nachweisgrenze (CFU) |
| Dünndarm | 2.0 | 50 |
| Blinddarm | 2.0 | 50 |
| Colon | 2.0 | 50 |
| Mesenteriallymphknoten | 1.5 | 15 |
| Spleen | 2.5 | 50 |
| Leber | 2.5 | 50 |
| Gallenblase | 0,5 | 10 |
| Gehirn | 1.5 | 15 |
Tabelle 1. Nachweisgrenze für L. monocytogenes in Gewebehomogenaten. durchschnittlich gesamten Probenvolumen aus sterilem Wasser plus der homogenisierte Gewebe.
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Discussion
Inzuchtmäuse nicht gleichmäßig empfänglich für Fütterung zu allen Zeiten des Tages, und ihre Bereitschaft, das kontaminierte Brot essen wird sowohl auf dem Stamm Art und dem Alter der Mäuse 17 abhängen. Nach unserer Erfahrung sind 6-9 Wochen alten B6 Mäuse empfänglich für Fütterung zu jeder Zeit des Tages, aber BALB Mäusen nicht konsequent von dem Brot essen Stück, wenn es während der Dunkel-Zyklus angeboten wird. Die Licht-Zyklus des Raumes verwendet werden, um die Tiere aufnehmen kann geändert werden, so die dunkle Phase fällt mit dem normalen Arbeitstag für Laborpersonal werden. Allerdings sollten die Mäuse, die mindestens zwei Wochen, um die geänderte Licht Zyklus vor der Infektion zu gewöhnen. Während der Infektion sollte nur rote Lampen entweder im Raum selbst oder im Laminarströmungshaube verwendet werden.
Bei der Entwicklung dieses Modells wurde Brot als Nahrungsquelle gewählt L. übertragen monocytogenes vor allem, weil Brot saugfähig ist. So war es einfach zu kleine Stücke mit th sättigene Bakterieninokulum und sicherzustellen, dass jede Maus die gleiche Dosis eingenommen werden. Allerdings könnte dieses Modell leicht angepasst, um andere Nahrungsquellen zu nutzen. In der Tat ist dies die einzige Maus-Modell, das verwendet werden, um direkt zu testen die Wirkung der Zusammensetzung von Lebensmitteln oder Lagerbedingungen auf bakterielle Infektiosität kann. L. monocytogenes kann leicht auf Wachstum in hohem Salzgehalt, niedrigen pH-Wert, oder kalten Temperaturen 1,2,18 anzupassen, aber es ist nicht bekannt, ob diese Wachstumsbedingungen die Fähigkeit der Bakterien zur Darm-Infektion zu etablieren verändern.
Etwa 10 min benötigt wird, um alle infizierten Organe aus einer Maus zu ernten. Die Gallenblase ist leicht gebrochen, so ist es am besten, um sie zuerst zu entfernen. Die Mesenteriallymphknoten sind am einfachsten zu erkennen, wenn der Darm nicht gestört worden, so dass sie als nächstes entfernt werden. Der Darm kann als einzelnes Gewebe durch Schneiden knapp unterhalb des Magens und knapp oberhalb der Anlage geerntet werden und dann in Zwölffingerdarm getrennt, Jejunum, ileum, Blinddarm und Dickdarm kurz vor dem Spülen und Homogenisieren. Die Milz und Leber sind in der Regel weiter entfernt und das Gehirn nach dem Abrufen Organe der Bauchhöhle, wie es nötig ist, um die Maus umzudrehen, um den Schädel zuzugreifen geerntet. Beim Arbeiten mit mehreren Mäusen sollten alle Gewebe auf Eis gelagert werden, bis verarbeitet. Für die meisten Gewebe wurde ein Agar-Platte verwendet, um die Anzahl der CFU in dem Gewebe zu bestimmen. Die Platte wurde gedrittelt und eine 50-100 ul Probe aus drei Verdünnungen der Gewebehomogenat wurde an jedem dritten ausplattiert.
Die hier beschriebenen Verfahren identifiziert die Gesamtzahl von L. monocytogenes in jeder Maus Gewebe, nicht nur die intrazellulären Organismen. Die einzigartige intrazelluläre Lebensweise von L. monocytogenes wird angenommen, dass ein Schlüssel Virulenzdeterminante während der Infektion 18,19 sein. Allerdings L. monocytogenes sind fakultativ, nicht obligat intrazelluläre Erreger und there sind keine definitiven veröffentlichten Berichte, um den Prozentsatz von Listeria, dass tatsächlich innerhalb der Zellen befinden in vivo zeigen. Die meisten früheren Studien mit oralen L. monocytogenes Infektion auf Gentamicin Behandlung von Darmgewebe verlassen, um das Wachstum der Darmflora hemmen. Eine Vorbehandlung mit Gentamicin hat das Potenzial, extrazellulären L. beseitigen monocytogenes, ermöglicht er die Wiederherstellung nur der intrazellulären Bakterien, aber es ist nicht klar, inwieweit Gentamicin ist in der Lage, ganze Darmgewebe in vitro zu durchdringen. Der ergänzende hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Bestimmung der beiden extra-und intrazellulären Bakterien in der Schleimschicht, dem Epithel und der Lamina propria Fach infizierter Darmgewebe. In diesem Verfahren wird Gentamycin verwendet, um einzelne Zellsuspensionen zu behandeln, so dass alle gewonnenen Bakterien innerhalb der Zellen im Gewebe waren.
Drei Waschungen mit NAC in der Regel wiederzog die Mehrheit der Schleim aus Darmgewebe, und die vereinigten Wäschen enthielt keine eukaryotischen Zellen (lebensfähigen oder toten), geändert durch Trypanblau-Färbung bestimmt. Zusätzliche Wäschen nicht ergeben sichtbaren Schleim wie Diff-Quik-Färbung von Zytospin Präparaten bestimmt. Die Zellstruktur von der EG und LP Fraktionen können auch bestätigt, mit Diff-Quik oder Giemsa-Färbung werden. Die EG-Anteil sollte in erster Linie von Epithelzellen, die leicht von den wenigen intraepithelialen Lymphozyten in das Darmepithel unterschieden werden kann bestehen. Der LP-Fraktion ist vielfältiger, die eine Mischung von mononukleären Zellen, die Veränderungen in der Zusammensetzung nach der Infektion bei entzündlichen Monozyten infiltrieren das Gewebe.
Die Lebensmittel übertragenen Modell der Listeriose kann mit einer Vielzahl von L. verwendet werden monocytogenes Isolate, einschließlich der mausadaptierten InlA m-exprimierenden Stamm 15 hier beschriebenen Wildtyp EGDe und Deletionsmutante derivierungsstoffe dieser Stämme 16. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass das Niveau der Darmbesiedlung nicht signifikant variieren zwischen diesen Stämmen, jedoch tat Isolate, die nicht zum Ausdruck bringen wollte eine hohe Affinität Ligand für murinen E-Cadherin haben einen leichten Defekt in der Verbreitung zu den mesenterialen Lymphknoten und Milz 16. Ebenso kann jeder Maus-Stamm für die Infektion verwendet werden, so dass dies ein attraktives Modellsystem, um sowohl bakterielle Pathogenese und Host-Reaktionen auf Infektion zu untersuchen. Schließlich, obwohl wir dies noch nicht getestet wurden direkt, schlagen wir vor, dass die grundlegenden Verfahren verwendet hier sollten allgemein anwendbar auf andere Lebensmittel übertragenen bakteriellen Krankheitserreger wie Salmonellen, Yersinien, Escherichia, Campylobacter und Citrobacter Arten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben. Alle hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Amt für Laboratory Animal Welfare (olaw) mit Zustimmung des ICAUC an der University of Kentucky durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (AI079442 und AI091918) verliehen SEFD unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
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