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Bioengineering

गतिशील सहभागिता की 3 डी स्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए correlative माइक्रोस्कोपी

Published: June 24, 2013 doi: 10.3791/50386
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Structural Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Physiology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

हम उच्च गति 3 डी रहने कक्ष फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोपी और उच्च संकल्प क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी को जोड़ती है एक correlative माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन है. हम इमेजिंग गतिशील, मेजबान HELA कोशिकाओं के साथ बातचीत के दौरान छोटे एचआईवी -1 कणों से correlative विधि की क्षमता प्रदर्शित करता है.

Abstract

क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (cryoET) एक बंद को शारीरिक स्थिति 1 में आणविक संकल्प पर सेलुलर संरचनाओं के 3 डी दृश्य की अनुमति देता है. हालांकि, cryoET साथ अपने मेजबान सेलुलर वातावरण में व्यक्ति वायरल परिसरों के प्रत्यक्ष दृश्य विशेष रूप से एचआईवी -1 के मामले में, वायरल प्रविष्टि के निराला और गतिशील प्रकृति के कारण, 2 चुनौती दे रहा है. समय चूक जीना सेल इमेजिंग एचआईवी 03-07 जनवरी के जीवन चक्र के कई पहलुओं के बारे में जानकारी का एक बड़ा सौदा प्राप्त हुए है, वहीं संकल्प रहते सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा afforded (~ 200 एनएम) सीमित है. हमारा काम, रहने कक्ष फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संयोजन क्रायो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, और cryoET द्वारा एचआईवी -1 संक्रमण के प्रारंभिक घटनाओं के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट कि एक संबंध विधि को विकसित करने के उद्देश्य से किया गया था. इस तरीके में, रहने कक्ष और क्रायो फ्लोरोसेंट संकेतों सही cryoET में नमूने मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, संरचनात्मक जानकारी cryoET कर सकते हैं ख से प्राप्तगतिशील कार्यात्मक डेटा के साथ पूरक ई फ्लोरोसेंट लेबल लक्ष्य का जीना सेल इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त की.

इस वीडियो लेख में, हम संरचनात्मक एचआईवी -1 की जांच और 3 डी correlative उच्च गति जीना सेल इमेजिंग और उच्च संकल्प cryoET संरचनात्मक विश्लेषण का उपयोग मेजबान सेल बातचीत के लिए विस्तृत तरीके और प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. एचआईवी -1 कणों से संक्रमित HELA कोशिकाओं कोंफोकल रहने कक्ष माइक्रोस्कोपी द्वारा पहली विशेषता थे, और एक ही वायरल कण युक्त क्षेत्र तो 3 डी संरचनात्मक विवरण के लिए क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया गया था. इमेजिंग डेटा, ऑप्टिकल इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन इमेजिंग के दो सेट के बीच संबंध एक घर में निर्मित क्रायो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश मंच का प्रयोग कर प्राप्त किया गया था. यहाँ विस्तृत दृष्टिकोण वायरस मेजबान सेल बातचीत के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी इस तरह के सेल संकेतन, झिल्ली रिसेप्टर की तस्करी जैसे कोशिका जीव विज्ञान में व्यापक अनुप्रयोगों,, और कई अन्य गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए ही नहीं, मूल्यवान होगा. </ P>

Introduction

क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (cryoET) कोशिकाओं और ऊतकों के तीन आयामी (3 डी) दृश्य की अनुमति देता है और एक बंद करने के लिए शारीरिक स्थिति 1 में आणविक प्रस्ताव पर देशी organelles और सेलुलर संरचनाओं के संगठन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक है. हालांकि, उनके विकिरण संवेदनशीलता के साथ संयुक्त बेदाग जमी हाइड्रेटेड नमूना, का स्वाभाविक कम विपरीत यह मुश्किल एक सेल के अंदर हित के क्षेत्रों का पता लगाने और बाद में लक्ष्य क्षेत्र को नुकसान पहुँचाए बिना सफलतापूर्वक झुकाव श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए आता है. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है एक correlative दृष्टिकोण आवश्यक है. फ्लोरोसेंट लेबलिंग से प्रकाश डाला विशिष्ट सुविधाओं की पहचान और प्रकाश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थित है, और फिर उनके निर्देशांक उच्च संकल्प 3 डी संरचनात्मक डेटा के अधिग्रहण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. इस correlative विधि एक लक्ष्य लगाने में मदद करता हैब्याज की reas संबोधित किया जाना है. CryoEM (<300 एनएम) के साथ नमूना मोटाई पर सीमा के कारण, वर्तमान में सेल के केवल परिधीय क्षेत्रों CryoET द्वारा 3 डी संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. इसके अलावा मिलिंग 9 शीशे 8 सेक्शनिंग द्वारा या क्रायो केंद्रित आयन बीम (मिथ्या) से जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों की मोटाई कम करने correlative इमेजिंग की क्षमता का विस्तार होगा.

इससे पहले, correlative के तरीकों में मुख्य रूप से बड़े और स्थिर संरचनाओं 10-13 के लिए cryoET डाटा अधिग्रहण की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया. इन अध्ययनों में, क्रायो चरणों cryoEM ग्रिड स्वीकार करते हैं और एक ईमानदार माइक्रोस्कोप या एक औंधा माइक्रोस्कोप 10,11,14 या तो पर फिट करने के लिए लागू किया गया है. ग्रिड स्विचिंग उनके डिजाइन में काफी सरल लगता है,, ईएम ग्रिड के लिए शामिल कदम स्थानांतरित ग्रिड, विकृत क्षतिग्रस्त और दूषित हो सकता है कि मौका बढ़ती अतिरिक्त रहे हैं. हमने हाल ही में एक तकनीकी अग्रिम का प्रदर्शनहमें सीधे संक्रमण 15 के प्रारंभिक दौर में इस तरह के एचआईवी -1 और मेजबान सेल बातचीत के रूप में कब्जा करने के लिए प्रकृति से मुश्किल हो जाता है कि गतिशील घटनाओं, कल्पना करने के लिए अनुमति देता है कि correlative माइक्रोस्कोपी. हम इस प्रकार के संबंध को सुविधाजनक बनाने, ग्रिड से निपटने के कारण नमूना क्षति को कम करने के लिए एक कारतूस प्रणाली adapts कि एक क्रायो प्रकाश माइक्रोस्कोपी नमूना मंच डिजाइन और लागू करने से यह पूरा. हमारे डिजाइन दोनों क्रायो प्रकाश और क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस प्रकार correlative प्रक्रिया को व्यवस्थित बनाने, नमूना हस्तांतरण के बिना, एक ही नमूना धारक पर, क्रमिक रूप से, प्रदर्शन करने की अनुमति, एक एकीकृत नमूना कारतूस धारक शामिल हैं. इसके अलावा, हम भी असंदिग्ध मार्कर के रूप में फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती का उपयोग कर एक सटीक और विश्वसनीय सहसंबंध प्रक्रिया लागू किया है.

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Protocol

1. कार्बन लेपित पर हेला सेल संस्कृति, गोल्ड ईएम खोजक ग्रिड

  1. ग्लो निर्वहन के 25 सेकंड के लिए 25 मा के तहत एक 200 जाल आर 2/2 Quantifoil सोने ईएम खोजक ग्रिड के कार्बन पक्ष.
  2. कोट 50 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin समाधान की एक 40 μl छोटी बिंदु पर, नीचे, कार्बन ओर चल द्वारा फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ उन्हें ग्रिड, तो एक टिशू कल्चर हुड में 2 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के तहत यह कीटाणुरहित.
  3. प्लेट हेला एक गिलास नीचे संस्कृति डिश में 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल (कुल 2 मिलीलीटर संस्कृति) के घनत्व पर ग्रिड पर कोशिकाओं और DMEM में, 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित 4.5 के साथ पूरक लगभग 18 घंटे के लिए छ / एल एल glutamine और ग्लूकोज, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 100 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन,. HELA कोशिकाओं हे / एन संस्कृति के बाद संक्रमित हैं.

2. एचआईवी -1 संक्रमण और लाइव सेल इमेजिंग

  1. गिलास नीचे संस्कृति में एक फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर (लाल CMTPX, 1 μl / 2 मिलीलीटर) जोड़ेंडिश (1.3 चरण से) और फ्लोरोसेंट डाई के ऊपर से लेने की अनुमति देने के लिए, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं.
  2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और 50 μl पूर्व गर्म ताजा मध्यम जोड़ें.
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, एक बह फील्ड Confocal स्कैनर खुर्दबीन के पर, रहने कक्ष कक्ष पर पकवान. वे cryoEM के बाद से सबसे अधिक प्रसार हुआ और फ्लैट (आंकड़े -2 सी और 2 देखें) कर रहे हैं, जब से अपेक्षाकृत पतली क्षेत्रों की आवश्यकता है दो पिंजरे का बँटवारा चरणों के बीच कोशिकाओं के साथ 1-3 कोशिकाओं / वर्ग होते हैं कि कई क्षेत्रों (10-15 पदों) का चयन करें नमूना. भविष्य इमेजिंग (2.5 कदम) के लिए इन पदों स्टोर.
  4. (हम पी 24 के 40 एनजी / एमएल युक्त एक नमूना के 40 μl उपयोग) GFP-Vpr होते हैं कि VSV जी छद्म टाइप एचआईवी -1 कणों के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. इमेजिंग के लिए पदों पर पहले से चयनित और संग्रहीत किया गया है के बाद से डिश के तल में वायरस कणों जोड़ते समय, ईएम ग्रिड को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहना होगा.
  5. तुरंत virions की इसके बाद, ती इकट्ठा20-40 मिनट के लिए पहले से चयनित पदों पर उच्च गति 3 डी confocal छवियों, (कदम 2.3 से) मुझे चूक.
  6. Confocal छवियों MetaMorph का उपयोग कर प्राप्त कर लिया और Imaris सॉफ्टवेयर (चित्रा 1 देखें) का उपयोग कर एक कण गतिशीलता के लिए स्वचालित 3 डी कण ट्रैकिंग द्वारा विश्लेषण किया गया. हम विवर्तन सीमित की गतिशील व्यवहार correlating रहे हैं जब से एचआईवी -1 सेलुलर फैटी, समय चूक जीना सेल इमेजिंग और 3 डी कण ट्रैकिंग के साथ कणों परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, एक बड़े और स्थिर संरचना के लिए, एक सरल प्रतिदीप्ति छवि (रहते सेल) के बिना correlative के विश्लेषण के लिए पर्याप्त होगा.

3. जमे हुए हाइड्रेटेड ईएम नमूना तैयार

पिछले confocal छवि और नमूना की क्रायो निर्धारण के संग्रह के बीच के समय में देरी को कम करने के लिए, फी Vitrobot (या अन्य कांच में रूपांतर डिवाइस) प्रतिदीप्ति कोंफोकल रहने कक्ष चित्रों के संग्रह के दौरान शुरू की और डुबकी ठंड के लिए तैयार रहना चाहिए.

  1. कांच में रूपांतर उपकरण चालू करें और 22 को अपनी जलवायु तापमान सेट डिग्री सेल्सियस, 100% करने के लिए लक्ष्य नमी, 7 सेकंड के लिए सोख्ता समय और इंतजार करो और 1 सेकंड का समय नाली.
  2. सवार देवर में ग्रिड भंडारण बॉक्स प्लेस और ठंडे तरल एटैन तैयार करते हैं. कांच में रूपांतर डिवाइस पर देवर माउंट.
  3. तुरंत कोंफोकल जीना सेल इमेजिंग (खंड 2) के बाद, एक बर्फ से ठंडा तांबे ब्लॉक पर संस्कृति पकवान जगह और cryoEM नमूना तैयार कक्ष को हस्तांतरण. विशेष चिमटी पर ईएम ग्रिड लोड और जल्दी से ग्रिड पर किसी भी मीडिया को दूर दाग. सोख्ता 0.2 माइक्रोन फ्लोरोसेंट microspheres तुरंत ग्रिड पर रखा गया है साथ 15 एनएम सोने मनका समाधान के 4 μl मिलाया, जिसके बाद फिल्टर पेपर के साथ, मैन्युअल रूप से किया जाता है. सोने की माला tomographic डेटा संग्रह और संरेखण सहायता करने के लिए विश्वस्त मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है. फ्लोरोसेंट microspheres (आंकड़े 2c-2 एफ देखें) फ्लोरोसेंट और cryoEM छवियों के बीच संबंध को सहायता करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  4. कांच में रूपांतर डिवाइस पर चिमटी लोड और तरल एटैन 16 में फ्रीज दाग और डुबकी डिवाइस हिदायत. सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित सोख्ता मापदंडों हैं: धब्बा समय, 7 सेकंड, दाग ऑफसेट, 0, नाली समय, 1 सेकंड; तापमान 22 डिग्री सेल्सियस, और नमी, 100%.
  5. बाद में उपयोग के लिए तत्काल cryoET इमेजिंग के लिए एक cryoEM धारक, या एक तरल नाइट्रोजन भंडारण देवर को जमी हाइड्रेटेड ग्रिड स्थानांतरण.

4. क्रायो प्रतिदीप्ति लाइट माइक्रोस्कोपी

एक घर में निर्मित, क्रायो प्रतिदीप्ति नमूना कक्ष और मंच प्रणाली (चित्रा 3) कदम 4.1-4.10 बाहर ले जाने के लिए आवश्यक है. चरण की विस्तृत विनिर्देशों और विवरण जून एट अल. 15 में पाया जा सकता है.

  1. कम से कम 2 घंटे क्रायो प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3a देखें) शुरू करने से पहले तरल नाइट्रोजन के साथ एक आत्म दबाव तरल नाइट्रोजन देवर भरें.
  2. एक homebuilt क्रायो च माउंटइस तरह के एक ओलिंप नौवीं 71 के रूप में एक औंधा प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोप, पर luorescence नमूना चरण 15 (चित्रा 3).
  3. आत्म दबाव देवर को क्रायो नमूना मंच के तरल नाइट्रोजन इनलेट कनेक्ट और एक उपयुक्त कंटेनर में तरल नाइट्रोजन अतिप्रवाह संरक्षण दुकान जगह है. लेंस गर्म और ठंढ से मुक्त रखने के उद्देश्य लेंस पर रखा एक आस्तीन के लिए एक सूखी नाइट्रोजन गैस लाइन से कनेक्ट करें.
  4. जमे हुए हाइड्रेटेड नमूना ग्रिड लोड करने के लिए क्रायो चरण चेंबर में एक तांबे ब्लॉक मंच (चित्रा 3b में काला तीर) रखें. शांत और आत्म दबाव भरने देवर से इनलेट लाइन के माध्यम से तरल नाइट्रोजन के साथ क्रायो चरण की तांबे चैम्बर भरें.
  5. क्रायो चरण तरल नाइट्रोजन तापमान (~ 4-6 मिनट में) तक पहुँच जाता है, क्रायो चरण के लिए ग्रिड भंडारण बॉक्स (3.5 कदम से) हस्तांतरण.
  6. तांबा ब्लॉक पर ईएम नमूना कारतूस में जमी हाइड्रेटेड नमूना ग्रिड प्लेस और छ क्लिपएक सी अंगूठी का उपयोग जगह में छुटकारा पा लिया है, या शीर्ष पर एक पूर्व ठंडा तांबे की अंगूठी (चित्रा 3 डी में काले रंग की नोक) जगह है, ग्रिड से आसानी से पुनः प्राप्ति के लिए भी जगह में ग्रिड रखने के लिए और करने के बाद (एक Polara माइक्रोस्कोप कारतूस का उपयोग अगर) क्रायो प्रतिदीप्ति इमेजिंग (एक गैर Polara क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए अगर).
  7. क्रायो चरण (चित्रा 3b में सफेद arrowhead) के भीतरी कक्ष में कारतूस (कदम 4.6 से) रखें.
  8. खोज और जीना सेल इमेजिंग डेटा से एक ही वायरस कणों हैं. ईएम ग्रिड एक सूचकांक है, यह जीना सेल छवियों और क्रायो पुष्पन छवियों दोनों में ग्रिड पर एक ही कण स्थानीयकरण का सीधा है.
  9. एक लंबे समय तक काम (2.7-4 एमएम) उद्देश्य लेंस के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग क्रायो शर्त के तहत पहचान पदों पर क्रायो डीआईसी और GFP छवियों मोल. क्रायो प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान, समय समय पर, क्रायो चरण में है और इसे फिर से भरना में तरल नाइट्रोजन के स्तर की जांच के रूप में की जरूरत है, -170 नीचे नमूना मंच रखने के लिएडिग्री सेल्सियस
  10. क्रायो प्रतिदीप्ति इमेजिंग के पूरा होने पर, ध्यान से तांबा ब्लॉक मंच करने के लिए नमूना कारतूस लौटने और एक Polara प्रणाली के साथ भविष्य cryoET विश्लेषण के लिए एक तरल नाइट्रोजन देवर में कारतूस की दुकान. एक गैर Polara क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, तो, तांबे की अंगूठी हटाने नमूना ग्रिड निकालते हैं, एक ग्रिड भंडारण बॉक्स में जगह है, और नमूना cryoET द्वारा जांच की है जब तक एक तरल नाइट्रोजन देवर में नमूना की दुकान.
  11. डेटा विश्लेषण के लिए अधिग्रहीत क्रायो डीआईसी और GFP छवियों ओवरलैप (कदम 4.9 से, चित्रा 4b देखें) और जीना सेल इमेजिंग श्रृंखला में प्राप्त उन लोगों के साथ क्रायो प्रतिदीप्ति छवि में GFP संकेतों के पदों सहसंबंधी.

5. क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी

  1. ऐसे Polara G2 खुर्दबीन के रूप में एक क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक से लैस एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के क्रायो हस्तांतरण स्टेशन में नमूना कारतूस लोड.
  2. 140X, आईडीई की एक बढ़ाई तहत कम खुराक खोज मोडntify और एक मंच फ़ाइल में जुड़े ग्रिड वर्गों (कदम 4.11) से बचाने के लिए.
  3. 3500 एक्स के एक बढ़ाई कम खुराक खोज मोड के तहत, एक 100 माइक्रोन उद्देश्य एपर्चर, खोज डालने और एक दूसरे चरण फ़ाइल में GFP के संकेतों के साथ सहसंबद्ध सभी पदों को बचाने के.
  4. एक महत्वहीन कार्बन क्षेत्र में बर्फ दूर जला कर, चरण वाई समारोह का उपयोग कर, / ए 2 और झुकाव अक्ष निखारने - कम खुराक जोखिम मोड के तहत, 1 या 2 ई की एक खुराक के लिए बीम तीव्रता को समायोजित करने के लिए एक रिक्त क्षेत्र खोजने कई सोने की माला के साथ.
  5. कम खुराक पर ध्यान केंद्रित मोड के तहत, ~ 3 माइक्रोन को ध्यान दूरी को समायोजित करने और झुकाव अक्ष के समानांतर होना ध्यान की दिशा के लिए पंक्ति में कोण समायोजित करें.
  6. कम खुराक खोज मोड के तहत, (5.3 कदम से) बचाया पदों को याद करते हैं, नमूना eucentric ऊंचाई को समायोजित करने और हित के क्षेत्र के लिए झुकाव रेंज की जाँच करें. Expos में, 8 से 10 माइक्रोन defocus में - बहुत कम इलेक्ट्रॉन खुराक (/ A 2 ~ 1 ए) के साथ एक प्रक्षेपण छवि मोलक्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सहसंबद्ध वायरस कणों की पुष्टि करने के उरे मोड,.
  7. कम खुराक फोकस मोड में स्विच करें. मंदिर ऑटो कार्यों के मेनू में, स्वचालित eucentric ऊंचाई पूर्व में होना और फोकस क्षेत्र पर कार्य करता है ध्यान केंद्रित.
  8. एक झुकाव श्रृंखला प्राप्त करने के लिए पैरामीटर सेट. / एक 2 कुल खुराक - इस पत्र में चित्रा 4 के लिए, झुकाव कोण, क्रमश: 3 ° और 2 ° झुकाव वेतन वृद्धि पर, डिग्री, नीचे और ऊपर 45 ° ± 70 लेकर एक 6 माइक्रोन defocus और लगभग 70 ई के साथ इस्तेमाल किया गया.
  9. सभी बचाया पदों के लिए कदम 5.7 और 5.8 दोहराएँ. बैच टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर throughput बढ़ाने के लिए कई स्थानों पर स्वचालित डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

6. IMOD 17 का उपयोग करते हुए तीन आयामी पुनर्निर्माण

  1. न्यूनतम और अधिकतम घनत्व मूल्यों को समायोजित करने और बड़ी छवि बदलाव की वजह से बाहर रखा जाना करने के लिए किसी भी दृश्य नहीं है, तो यह निर्धारित करने के लिए कच्चे झुकाव श्रृंखला का निरीक्षण किया.
  2. ETomo और अक्ष प्रकार, पिक्सेल आकार, विश्वस्त व्यास, आदि का उपयोग कर सेटअप रण पैनल प्रारंभ. तब कॉम स्क्रिप्ट बनाने.
  3. रण गणना के कई चरणों समायोजित / एक साथ पीछा किया जा सकता है कि इस तरह के मुख्य खिड़की विन्यास करें. आवश्यक मानकों को संशोधित करने और प्रत्येक प्रसंस्करण कदम (eTomo ट्यूटोरियल देखें, से अपेक्षा की जाती है कि विशिष्ट कार्यक्रमों पर अमल http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
  4. अंतिम चरण में, एक पूर्ण गठबंधन ढेर बनाने (0.6 से कम एक मतलब अवशिष्ट त्रुटि के साथ) और IMOD में एक भारित वापस प्रक्षेपण एल्गोरिथ्म का उपयोग tomograms का पुनर्निर्माण किया.
  5. इसके विपरीत और स्पष्टता बढ़ाने के लिए उपयुक्त मानकों के साथ IMOD में लागू एक 3 डी अरेखीय अनिसोट्रोपिक प्रसार बढ़त को बढ़ाने प्रोग्राम का उपयोग ब्याज के संभावित क्षेत्रों denoise.

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Representative Results

वायरस कणों के गतिशील व्यवहार को चिह्नित करने के लिए, एचआईवी -1 से संक्रमित HELA कोशिकाओं उच्च गति कोंफोकल रहने कक्ष माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे और कण आंदोलनों (चित्रा 1) स्वचालित 3 डी कण ट्रैकिंग द्वारा विश्लेषण किया गया. पिछले कोंफोकल रहने कक्ष छवि के संग्रह और डुबकी ठंड (जो काफी लंबे समय सहसंबद्ध एचआईवी -1 कणों को कम करने के लिए हो सकता है), एक क्रायो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश मंच (चित्रा 3 के बीच हो सकता है कि कई मिनट का समय व्यतीत हो जाने से बचने के लिए ) प्रकाश माइक्रोस्कोप पर, cryoEM कारतूस के भीतर, इमेजिंग जमी हाइड्रेटेड नमूने 15 के लिए डिजाइन और निर्माण किया गया था. एक तांबे ब्लॉक मंच (चित्रा 3b, काला तीर) और तांबे की अंगूठी (चित्रा 3 डी, नोक) गैर Polara इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग करने के लिए जोड़ा गया है. कोंफोकल रहने कक्ष, क्रायो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश, और cryoET के बीच सहसंबंध अनुक्रमित सोने Quantifoil ग्रिड और 0.2 और म्यू का प्रयोग कर प्राप्त किया गया था ; मीटर फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती (चित्रा 2). साथ में ले ली, चित्रा 4 उन्नत correlative के रहने कक्ष माइक्रोस्कोपी और एक मेजबान हेला सेल के साथ बातचीत fluorescently लेबल एचआईवी -1 कणों कल्पना करने के लिए क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए समग्र प्रक्रिया की व्यवहार्यता को दर्शाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. HELA कोशिकाओं में एचआईवी -1 कणों का समय चूक कोंफोकल जीना सेल इमेजिंग. एक भी हरी फ्लोरोसेंट वायरल कण (पीले arrowhead) फ्रेम के बीच में एक 3 मिनट समय अंतराल के साथ 3 डी कोंफोकल के ढेर में लगाया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. एक 2X (एक) और 20X (ख) के उद्देश्यों के साथ दर्ज की गई एक Quantifoil सोने ईएम खोजक ग्रिड, पर सभ्य HELA कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवियों और cryoEM छवियों के बीच सहसंबंध. (एक और ख) अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियाँ. (ग) क्रायो प्रतिदीप्ति जमी हाइड्रेटेड HELA कोशिकाओं की छवि (माइटोकांड्रिया के लिए लाल रंग) और 0.2 माइक्रोन एक क्रायो मंच और कोशिकाओं की एक डीआईसी छवि से मढ़ा एक 40X लंबे समय तक काम दूरी हवा के उद्देश्य के साथ दर्ज की फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती (हरा),. (घ इसी क्षेत्र के) कम बढ़ाई cryoEM छवि में (ग). (ई एंड एफ 0.2 माइक्रोन फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती का उपयोग कर प्रतिदीप्ति और cryoEM छवियों के बीच) सहसंबंध. इसी मोती ही रंग के साथ परिक्रमा कर रहे हैं. स्केल सलाखों, एक में 200 माइक्रोन, ख में 50 माइक्रोन, सी, डी में 25 माइक्रोन ई, एफ में 5 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3. क्रायो प्रकाश माइक्रोस्कोपी मंच का निर्माण. (एक) तांबे क्रायो नमूना मंच (सफेद तीर) को ठंडा करने के लिए इस्तेमाल तरल नाइट्रोजन से भरा एक आत्म दबाव देवर,. क्रायो नमूना मंच (ख) ऊपर, अंदर देखने , भीतरी कक्ष (सफेद नोक) दिखा. नमूना ग्रिड एक तांबे ब्लॉक (काला तीर) के केंद्र में बैठता है जो ईएम नमूना कारतूस, पर रखा गया है. एक बार नमूना ग्रिड के साथ भरी हुई, कारतूस के भीतरी कक्ष (सफेद नोक) को सौंप दिया है क्रायो प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी. (ग एवं घ) नमूना कारतूस से पहले (ग) और (घ) एक तांबे की अंगूठी (काला नोक रखने के बाद ) गैर Polara क्रायो इलेक्ट्रॉन माइकर के साथ प्रयोग करने के लिए जगह में ग्रिड रखने के लिएoscope.

चित्रा 4
4 चित्रा. Correlative माइक्रोस्कोपी द्वारा एक हेला सेल के सेलुलर फलाव के लिए बाध्य एक एक फ्लोरोसेंट कण की CryoET. (एक और ख) GFP टैग कणों की एक क्रायो प्रतिदीप्ति छवि के साथ मढ़ा एक क्रायो प्रकाश माइक्रोस्कोपी मंच (एक) के साथ दर्ज एक डीआईसी छवि (लाल) (ख) (ग - ई). 140X (ग), 3500 एक्स (घ) और 27,500 पर एक फ्लोरोसेंट कण (पैनल ख और ग में परिक्रमा) एक्स (ई) से युक्त क्षेत्र की कम खुराक cryoEM छवियों, क्रमशः . Tomographic झुकाव श्रृंखला के अधिग्रहण के बाद दर्ज इनसेट, एक बढ़े हुए दृश्य (च - ज). Z दिशा में 21 एनएम की दूरी के द्वारा अलग तीन 4 एनएम मोटी tomographic स्लाइस. कण और हेला कोशिका झिल्ली के बीच सम्पर्क indicat हैंप्रक्षेपण छवि (पैनल ई में इनसेट) और tomographic स्लाइस (पैनल एफ एंड जी) दोनों में तीर द्वारा एड. स्केल सलाखों, एक और ख में 10 माइक्रोन, सी में 20 माइक्रोन, डी में 500 एनएम, और ई में 100 एनएम - ज.

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Discussion

हम cryoET द्वारा पीछा समय व्यतीत कोंफोकल, रहने कक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर गतिशील सेलुलर घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए एक उन्नत correlative दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए प्रोटोकॉल का एक सरल सेट प्रस्तुत किया है. उच्च संकल्प cryoET के साथ 3 डी जीना सेल इमेजिंग सहसंबंधी हमारी पद्धति के विकास में इस तरह मेजबान कोशिकाओं के साथ दुर्लभ, गतिशील (, के रूप में पहले से स्थिर की सूचना नहीं), और विवर्तन सीमित वायरल कणों और उनकी बातचीत visualizing के रूप में कई चुनौतीपूर्ण जैविक समस्याओं की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है . जीवित कोशिकाओं में विशिष्ट कणों के स्थानिक और लौकिक व्यवहार रहने कक्ष विश्लेषण की विशेषता है और परिभाषित संक्रमण चरणों में वायरस सेल बातचीत के संरचनात्मक विवरण पता लगाया जाता है. एक घर, क्रायो प्रकाश माइक्रोस्कोपी मंच cryoEM द्वारा कब्जा जीवित कोशिकाओं और छवियों से प्रतिदीप्ति प्रकाश छवियों के बीच सीधा संबंध को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जाता है.

में मन में रखने के लिए कई महत्वपूर्ण बातें हैंइष्टतम डेटा संग्रह और विश्लेषण करने के लिए आदेश. ग्रिड के किनारे में झुकाव श्रृंखला के अधिग्रहण के लिए देखने के क्षेत्र के साथ हस्तक्षेप के बाद पहले, समय चूक कोंफोकल जीना सेल इमेजिंग के लिए कई स्थानों उठा, जब चयनित पदों, ईएम ग्रिड के केंद्र से 0.5 मिमी के भीतर होना चाहिए cryoET. वे सबसे अधिक प्रसार हुआ और फ्लैट हैं जब इसके अलावा, विश्लेषण के लिए चयनित कक्षों, दो पिंजरे का बँटवारा चरणों के बीच होना चाहिए. इसलिए, cryoET विश्लेषण के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की पतली क्षेत्रों, उनके सबसे विस्तारित चरण में हैं. एक ही अंतरावस्था स्तर पर संवर्धित कोशिकाओं का बहुमत है करने के लिए, सेल चक्र एस चरण 18 जल्दी में है कि ब्लॉक सेल चक्र डबल thymidine उपचार का उपयोग सिंक्रनाइज़ किया जा सकता. Thymidine ब्लॉक से जारी कोशिकाओं तो G2-और mitotic चरण के माध्यम तुल्यकालिक प्रगति.

दूसरा, जैसा कि पहले उल्लेख किया है, नमूना के confocal छवि और क्रायो निर्धारण की अंतिम सीमा के बीच के समय में देरी को कम से कम किया जाना चाहिएगतिशील वस्तुओं के कुशल सीधा संबंध अनुमति देते हैं. इसके अलावा, ग्रिड की उदासी और अखंडता सभी प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं और नंगे ग्रिड गैर Polara सूक्ष्मदर्शी के लिए नियंत्रित किया जाता है जब विशेष रूप से, प्रोटोकॉल भर में बनाए रखा जाना चाहिए.

अंत में, प्रतिदीप्ति छवि और लक्ष्य को खोजने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि,, के बीच सटीक और विश्वसनीय सहसंबंध cryoET डेटा के सफल बाद के अधिग्रहण के लिए आवश्यक है. एक प्रक्षेपण छवि में, एक कम बढ़ाई, एक चयनित कक्ष के आकार और दिशा की मान्यता और कभी कभी ग्रिड पर छेद गिनती EM क्षेत्र में सहसंबद्ध क्षेत्र का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं. फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती एक और अधिक मजबूत और सटीक सहसंबंध के लिए नमूने के लिए जोड़ रहे हैं. फ्लोरोसेंट और इलेक्ट्रॉन घने दोनों हैं जो फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती या क्वांटम डॉट्स, प्रयोग, प्रतिदीप्ति छवि में लक्ष्य के निर्देशांक सीधे एक सटीक स्थानीयकरण के लिए उन्हें करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है. यह shoulफ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती या क्वांटम डॉट्स की तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन लक्ष्य का उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ ओवरलैप के लिए नहीं चुना गया है कि ध्यान दिया जाना चाहते हैं.

एक लक्ष्य क्षेत्र की पहचान करने के लिए स्थापित हमारे वर्तमान संबंध को इस प्रकार एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप से एक अतिरिक्त नमूना हस्तांतरण कदम को शामिल करने, एक क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के बाहर जगह लेता है. एक और अधिक प्रत्यक्ष और सरल तरीका इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के भीतर एक फ्लोरोसेंट इमेजिंग उपकरण स्थापित करके, 19 बाहर लगा दिया गया है. इसके अलावा, 0.6 की एनए के साथ एक लंबे समय तक काम दूरी हवा के उद्देश्य से afforded संकल्प (~ 0.6 माइक्रोन) सीमित है. 3 डी सेलुलर tomograms में सटीक और सही है nanoscale एक अणु स्थानीयकरण आगे फैटी में फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन सहसंबंधी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी शामिल होगी.

Correlative प्रकाश माइक्रोस्कोपी और cryoET में इसके अलावा अग्रिम अतिरिक्त टी के संयोजन से उम्मीद कर रहे हैंऐसी जमी हाइड्रेटेड नमूनों की 8 सेक्शनिंग क्रायो केंद्रित आयन बीम (मिथ्या) मिलिंग 9,20 और कांच के रूप में echniques,. इन तकनीकों में, नमूना मोटाई की सीमाओं को पार बहुत cryoET विश्लेषण के लिए उत्तरदायी नमूनों की रेंज का विस्तार, इस प्रकार की अनुमति की कोशिकाओं के अंदर गहरे कूच किया है कि वायरल कणों की जांच. मेजबान सेल कारकों, एचआईवी -1 सीए के लिए जुड़े हुए एक टेट्रा सिस्टीन प्रतिदीप्ति जांच के साथ विशिष्ट सेलुलर प्रोटीन और एचआईवी -1 कोर के आगे डबल लेबलिंग के साथ वायरस कण बातचीत के अध्ययन के संदर्भ में की विशेष प्रारंभिक दौर की पहचान की सुविधा सकता है एचआईवी -1 जीवन चक्र और मेजबान कारकों और वायरल कणों के स्थानिक और कार्यात्मक संबंध. हम अध्ययन संकेतन सेल, झिल्ली रिसेप्टर की तस्करी, और कोशिका जीव विज्ञान में कई अन्य गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए correlative 3 डी जीना सेल इमेजिंग और cryoET पद्धति आशा.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों तकनीकी के लिए क्रायो प्रतिदीप्ति नमूना मंच, चीन के विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय में Changlu ताओ और चेंग जू के निर्माण के लिए ट्रैविस व्हीलर और सेल बायोलॉजी विभाग में मशीन की दुकान और फिजियोलॉजी, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहूंगा सहायता, और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. टेरेसा Brosenitsch. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (GM082251 और GM085043) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA 12-604F
Fibronectin Sigma, St. Louis, MO F1141-1MG HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA C34552 Red CMTPX
Protein A gold conjugates Ted Pella, Inc., Redding, CA 15822-1 15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA F8811 Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA 10082-139
Penicillin-Streptomycin Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA 15140-122
Glass-bottom culture dish MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA 70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun FEI, Hillsboro, OR 300 keV
Vitrobot Mark III FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope Olympus America Inc., Center Valley, PA LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope Nikon Instruments, Melville, NY using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage Home-made Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.

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References

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Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, … More

Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions. J. Vis. Exp. (76), e50386, doi:10.3791/50386 (2013).

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