Summary
우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.
Abstract
cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET은) 근접에 생리적 상태 1 분자 해상도의 세포 구조의 3D 시각화 할 수 있습니다. 그러나 cryoET와 숙주 세포 환경에서 각각의 바이러스 복합체의 직접 시각화는 특히 HIV-1의 경우, 바이러스 성 항목의 자주와 동적 인 특성으로 인해, 2 도전합니다. 시간 경과 라이브 세포 이미징 HIV-1 3-7 라이프 사이클의 여러 측면에 대한 정보의 큰 거래를 굴복 동안, 해상도는 살아있는 세포 현미경으로 여유가 (~ 200 nm의) 제한됩니다. 우리의 작품은 살아있는 세포 형광 현미경을 결합내는 형광 현미경 및 cryoET에 의해 HIV-1 감염의 초기 사건의 직접적인 시각화를 허용하는 상관 관계 방법을 개발을 목표로 하였다. 이러한 방식으로, 라이브 셀내는 형광 신호를 정확하게 cryoET에서 샘플링을 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 구조 정보는 cryoET 수 있습니다 B에서 얻은동적 기능을 데이터로 보완 전자 형광 표지 대상의 라이브 세포 이미징을 통해 얻은.
이 비디오 문서에서는, 우리는 구조 HIV-1의 조사 및 3D 상호 고속 라이브 세포 이미징 및 고해상도 cryoET 구조 분석을 사용하여 호스트 세포 상호 작용에 대한 자세한 방법과 프로토콜을 제공합니다. HIV-1 입자에 감염 헬라 세포는 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 첫 번째 특징하였고, 같은 바이러스 성 입자를 포함하는 영역은 다음 차원 구조 자세한 내용은 cryo - 전자 단층 촬영을 이용하여 분석 하였다. 영상 데이터, 광학 이미징 및 전자 이미지의 두 세트 사이의 상관 관계는 집에서 내장내는 형광 빛 현미경 스테이지를 사용하여 달성되었다. 여기에 설명 된 방법은 바이러스 숙주 세포의 상호 작용 연구,뿐 아니라 세포 신호 전달, 막 수용체 인신 매매와 같은 세포 생물학의 광범위한 응용 프로그램, 그리고 많은 다른 동적 셀 프로세스뿐만 아니라, 도움이 될 것입니다. </ P>
Introduction
cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET)는 세포와 조직의 3 차원 (3D) 시각화를 허용하고 근접에 생리 상태 1 분자 해상도에서 기본 세포 소기관 및 세포 구조의 조직에 대한 통찰력을 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 그러나, 그들의 방사선 민감도와 결합 흠 냉동 수화 시편의 본질적 낮은 콘트라스트가 어려운 세포 내부 관심 분야를 찾아 연속적으로 대상 영역을 손상시키지 않고 성공적으로 기울기 시리즈를 수행 할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 빛과 전자 현미경을 결합하여 상호 접근 방식이 필요합니다. 형광 라벨에 의해 강조 특정 기능을 식별 및 형광 광학 현미경에 의해 위치, 그리고 자신의 좌표는 고해상도 3D 구조의 데이터 수집을위한 전자 현미경으로 전송됩니다 수 있습니다. 이 상관 관계 방법은 대상의 위치를하는 데 도움이관심 REAS가 해결 될 수 있습니다. cryoEM (<300 nm의)에 시료 두께 제한으로 인해, 현재 셀의 단지 주변 지역은 CryoET하여 3D 구조 분석에 적합합니다. 또한 밀링 9 유리체가 8 단면 또는 극저온 집중 이온빔 (FIB)에 의해 냉동 수화 시편의 두께를 줄이는 것은 상호 이미징의 기능을 확장 할 것이다.
이전에 상호 방법은 주로 대형 및 정적 구조 10-13 cryoET 데이터 수집을 용이하게하기 위해 사용되었다. 이 연구에서는 극저온 단계는 cryoEM 격자를 받아 직립 현미경 또는 거꾸로 현미경 10,11,14 중 하나에 맞게 구현되었습니다. 그리드를 전환하여 자신의 설계에 매우 간단 해 보이지만, EM 그리드에 대한 참여 단계를 전송하는 그리드, 변형 손상 및 오염 될 수있는 가능성을 증가 추가가 있습니다. 우리는 최근의 기술적 진보를 보여우리가 직접 감염 15 초기 단계에서 이러한 HIV-1과 숙주 세포의 상호 작용으로 촬영 자연 어려운 동적 인 이벤트를 시각화 할 수 있습니다 상호 현미경. 따라서 우리는 상관 관계를 촉진, 그리드 처리에 의한 시편의 손상을 최소화하기 위해 카트리지 시스템을 적응내는 빛 현미경 샘플 단계를 설계하고 구현하여이 작업을 수행. 우리의 디자인은 모두 극저온 빛과 cryo - 전자 현미경은 따라서 상호 프로세스를 능률화, 샘플 전송하지 않고 동일한 시편 홀더에 순차적으로 수행 할 수 있도록 통합 된 시편 카트리지 홀더가 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 또한 기준점 표지로 형광 라텍스 구슬을 사용하여 정확하고 신뢰할 수있는 관계 절차를 구현했습니다.
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Protocol
1. 탄소 코팅에 헬라 세포 배양, 골드 EM 찾기 그리드
- 글로우 방전 25 초 25mA 이하 200 메쉬 R2 / 2 Quantifoil 금 EM 찾기 그리드의 탄소 쪽.
- 코트 50 ㎍ / ㎖의 fibronectin의 용액 40 μL 비말로, 아래로, 탄소 측을 떠하여 피브로넥틴과 EM 그리드, 다음, 조직 문화 후드에서 2 시간 동안 UV 빛의 밑에 그것을 소독.
- 판 헬라 유리 바닥 문화 접시에 2 × 10 4 세포 / ㎖ (총 2 ㎖ 문화)의 밀도 그리드 위에 세포 DMEM에서 5 % CO 2, 37 ° C에서 세포 성장을 4.5로 보충 약 18 시간 동안 G / L L-글루타민과 포도당, 10 % 열 - 불 활성화 된 송아지 태아 혈청, 100 단위 / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신. 헬라 세포는 O / N 문화 이후에 감염됩니다.
2. HIV-1 감염과 라이브 셀 이미징
- 유리 바닥 문화에 형광 세포 추적기 (레드 CMTPX, 1 μL / 2 ㎖)를 추가접시 (단계 1.3)와 형광 염료의 최대 걸릴 수 있도록, 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- PBS로 세포를 세척하고 50 μL 사전 예열 신선한 매체를 추가합니다.
- 37 ° C, 스윕 필드 공 촛점 스캐너 현미경에서 라이브 셀 챔버에 접시를 놓습니다. 그들은 cryoEM 이후 대부분의 스프레드 아웃과 평면 (그림 2C와 2D 참조) 때 상대적으로 얇은 영역을 필요로 두 개의 유사 분열 단계 사이의 세포와 1-3 셀 / 사각형이 포함 된 여러 필드 (10-15 위치)을 선택 샘플. 미래 영상 (단계 2.5)에 대한이 위치를 저장합니다.
- (우리는 P24의 40 NG / ML을 포함하는 시료 40 μl를 사용) GFP-VPR을 포함 VSV-G 의사 입력 된 HIV-1 입자로 세포를 감염. 영상의 위치가 이미 선택되어 저장 되었기 때문에 접시의 바닥에 바이러스 입자를 추가 할 때, EM 그리드를 방해하지 않도록주의해야합니다.
- 바로 비리의 추가 후, TI 수집20 ~ 40 분 이전에 선택한 위치에서 고속 3D 공 촛점 이미지를 (단계 2.3) 나 경과.
- 공 촛점 이미지는 MetaMorph를 사용하여 인수 Imaris 소프트웨어 (그림 1 참조)를 사용하여 단일 입자 역학에 대한 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 우리는 회절의 동적 동작을 상호 연관되어 있기 때문에 HIV-1 세포의 미세 구조, 시간 경과 라이브 세포 이미징 및 3D 입자 추적을 가진 입자는 결과에 매우 중요합니다. 그러나 큰 정적 구조, 간단한 형광 이미지 (살아있는 세포없이) 상관 관계 분석에 충분할 것입니다.
3. 냉동 수화 EM 샘플 준비
마지막으로 공 촛점 이미지와 샘플 극저온 고정 모음 사이의 시간 지연을 최소화하기 위해, FEI Vitrobot (또는 다른 유리화 장치) 형광 공 촛점 라이브 셀 이미지를 수집하는 동안 시작과 플 런지 냉동 준비를해야합니다.
- 유리화 장치의 전원을 켜고 22의 기후 온도를 설정 ° C, 100 %로 목표 습도, 7 초에 더럽히는 시간 및 대기를하고 1 초 시간을 드레인.
- 플런저 듀어에 그리드 스토리지 박스를 배치하고 차가운 액체 에탄을 준비합니다. 유리화 장치에 듀어를 탑재합니다.
- 즉시 공 촛점 라이브 세포 이미징 (2 절) 후 얼음 냉각 구리 블록에 배양 접시를 놓고 cryoEM 샘플 준비 방에 전송할 수 있습니다. 전문 핀셋에 EM 그리드를로드하고 빠르게 그리드에서 모든 미디어를 멀리 얼룩. 모래 바닥은 0.2 μm의 형광등 마이크로 즉시 격자에 배치와 함께 15 나노 골드 비드 솔루션의 4 μL를 혼합 한 후, 여과지, 수동으로 이루어집니다. 골드 비즈는 단층 데이터 수집 및 정렬을 돕기 위해 기준점 마커로 사용됩니다. 형광 마이크로는 (그림 2C-2F 참조) 형광등 cryoEM 이미지 사이의 상관 관계를 원조하는 데 사용됩니다.
- 유리화 장치에 핀셋을 넣고 액체 에탄 16 동결을 몰아 내고 빠지게 할 장치를 지시합니다. 최상의 결과를 달성하기 위해 최적화 된 더럽히는 매개 변수는 다음과 같습니다 오점 시간, 7 초, 오점 오프셋 0, 배출 시간, 1 초, 온도 22 ° C, 습도 100 %.
- 나중에 사용하기 위해 즉시 cryoET 이미징을위한 cryoEM 홀더, 또는 액체 질소 저장 듀어에 냉동 수화 격자를 전송합니다.
4. CRYO-형광 광학 현미경
홈 내장, 극저온 형광 샘플 챔버 및 단계 시스템 (그림 3) 단계 4.1-4.10를 수행해야합니다. 단계의 자세한 사양과 설명은 6월 등. 15에서 찾을 수 있습니다.
- 적어도 2 시간내는 형광 빛 현미경 (그림 3A 참조) 시작하기 전에 액체 질소로 자기 가압 액체 질소 듀어를 입력합니다.
- homebuilt CRYO-F를 탑재이러한 올림푸스 IX 71로 거꾸로 형광 광학 현미경, 위에 luorescence 샘플 스테이지 15 (그림 3).
- 자기 가압 듀어에 극저온 샘플 단계의 액체 질소 주입구를 연결하고 적절한 용기에 액체 질소 오버 플로우 방지 콘센트를 배치합니다. 렌즈가 온난하고 서리 무료로 유지하는 대물 렌즈 위에 배치 슬리브 건조 질소 가스 라인을 연결합니다.
- 냉동 수화 샘플 그리드를로드 CRYO 단계 챔버 구리 블록 플랫폼 (그림 3B에서 검은 색 화살표)를 놓습니다. 냉각 및 자기 가압 충전 듀어에서 유입 라인을 통해 액체 질소 극저온 단계의 구리 챔버를 입력합니다.
- 극저온 단계는 액체 질소 온도 (~ 4-6 분)에 도달하면, 극저온 단계로 그리드 스토리지 상자 (단계 3.5에서) 전송합니다.
- 구리 블록 EM 표본 카트리지에 냉동 수화 샘플 격자를 놓고 G 클립C-링을 사용하여 장소를 제거하거나 상단에 미리 냉각 구리 반지 (그림 3D 블랙 화살촉)를 배치 격자의 쉬운 검색을 위해 또한 장소에 그리드를 유지하기 위해 한 후 (Polara 현미경 카트리지를 사용하는 경우) CRYO-형광 이미징 (비 Polara cryo - 전자 현미경을위한 경우).
- CRYO 단계 (그림 3B 흰색 화살촉)의 내부 챔버에서 카트리지를 (단계 4.6)에 놓습니다.
- 검색하고 살아있는 세포 이미징 데이터에서 동일한 바이러스 입자를 찾을 수 있습니다. EM 격자 인덱스를 가지고 있기 때문에 살아있는 세포 이미지와 CRYO-형광 이미지를 모두 그리드에 동일한 입자를 지역화하는 간단합니다.
- 긴 작동 (2.7-4 mm) 대물 렌즈와 광학 현미경을 사용하여 극저온 조건에서 식별 된 위치에 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 획득. CRYO-형광 이미징 동안 주기적으로, 극저온 무대와 리필을에서 액체 질소 레벨을 점검 필요, -170 아래의 샘플 단계를 유지하기 위해° C.
- CRYO-형광 이미징이 완료되면, 조심스럽게 구리 블록 플랫폼 표본 카트리지를 반환하고 Polara 시스템과 미래 cryoET 분석을 위해 액체 질소 듀어에 카트리지를 보관하십시오. 비 Polara cryo - 전자 현미경을 사용하는 경우, 구리 반지를 제거 샘플 격자를 검색, 그리드 스토리지 박스에 배치하고, 시편 cryoET에 의해 검사 될 때까지 액체 질소 듀어의 표본을 저장합니다.
- 데이터 분석의 경우, 인수 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 오버랩 (단계 4.9에서 그림 4b 참조) 라이브 세포 이미징 시리즈에서 얻은 사람들과 극저온 형광 이미지 GFP 신호의 위치를 연관.
5. cryo - 전자 단층 촬영
- 이러한 Polara G2 현미경으로 전계 방출 총을 탑재 전자 현미경의 극저온 전송 스테이션에 샘플 카트리지를로드합니다.
- 140X, IDE의 배율에 따라 저용량 - 검색 모드ntify 및 스테이지 파일에 연결된 그리드 사각형 (단계 4.11부터) 저장합니다.
- 3,500 X의 배율 낮은 복용량 검색 모드에서, 100 μm의 목표 조리개 검색을 삽입하고 두 번째 단계의 파일에 GFP 신호와 상관 관계가있는 모든 위치를 저장합니다.
- 중요하지 않은 탄소 영역에서 얼음을 떨어져 연소, 무대 Y 기능을 사용하여, / 2과 경사 축 수정 - 저용량 노출 모드에서, 1 또는 2 E의 복용량에 빔 강도를 조정하는 빈 영역을 찾아 여러 개의 금 구슬.
- 저용량 초점 모드에서, 2 ~ 3 μm의 초점 거리를 조정하고 경사 축에 평행 초점의 방향을 정렬 각도를 조정합니다.
- 저용량 - 검색 모드에서 (단계 5.3에서) 저장 위치를 기억, 표본 eucentric 높이를 조정하고 관심 영역의 기울기 범위를 확인합니다. 박람회에 8 ~ 10 ㎛ defocus 조명에서 - 매우 낮은 전자 선량 (/ 2 ~ 1 E)와 투사 이미지를 획득cryo - 전자 단층 촬영을 위해 상호 바이러스 입자를 확인하기 위해 우레 모드.
- 저용량 초점 모드로 전환합니다. TEM 자동 기능 메뉴에서 자동 eucentric 높이를 앞에하고 초점 영역에 기능을 집중한다.
- 틸트 시리즈를 구입하는 매개 변수를 설정합니다. / 2 총 용량 - 본 논문에서는 그림 4, 틸트 각도는 각각 3 °, 2 ° 경사 단위에서, °, 아래 이상 45 ° ± 70 범위는 6 μM이 초점 흐림 약 70 E와 함께 사용되었다.
- 모든 저장 위치에 대한 단계 5.7 및 5.8를 반복합니다. 배치 단층 촬영 소프트웨어는 처리량을 증가하기 위해 여러 위치에서 자동 데이터 수집에 사용할 수 있습니다.
6. IMOD 17을 사용하여 입체적으로 재구성
- 최소 및 최대 밀도 값을 조정하고 큰 이미지의 변화로 인해 제외 할 모든보기가 있는지 확인하기 위해 원시 경사 시리즈를 검사합니다.
- eTomo 및 축 유형, 픽셀 크기, 기준점 직경 등을 사용하여 설치 단층 촬영 패널을 시작합니다. com을 스크립트를 만들 수 있습니다.
- 단층 계산의 여러 단계를 조정 / 동시에 따라야 할 수 있도록 메인 화면을 구성합니다. 필요한 매개 변수를 수정하고 각 처리 단계 (eTomo 자습서를 참조하여 필요한 특정 프로그램을 실행 http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- 최종 단계에서 전체 정렬 된 스택을 만들 (0.6 미만의 평균 잔차)와 IMOD에서 가중 다시 프로젝션 알고리즘을 사용하여 tomograms을 재구성.
- 명암과 선명도를 향상시키기 위해 적절한 매개 변수와 함께 IMOD에서 구현 된 3D 비선형 이방성 확산 가장자리 향상 프로그램을 사용하여 잠재적 인 이해의 영역을 워터 마크.
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Representative Results
바이러스 입자의 동적 거동을 특성화하기 위해, HIV-1에 감염된 헬라 세포는 고속 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 몇 군데 있었다 및 입자의 운동은 (그림 1) 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 마지막으로 공 촛점 라이브 셀 이미지 수집 및 플 런지 냉동 (이는 충분히 상관 HIV-1 입자를 잃을 수 있습니다)내는 형광 빛 현미경 단계 (그림 3 사이에 발생할 수있는 몇 분의 시간 경과를 방지하려면 ) 가벼운 현미경에 cryoEM 카트리지 내에서 이미지 냉동 수화 샘플 15을 위해 설계 및 건설되었다. 구리 블록 플랫폼 (그림 3B, 검은 색 화살표)과 구리 반지 (그림 3 차원, 화살촉)는 비 Polara 전자 현미경과 함께 사용하기 위해 추가되었습니다. 공 촛점 라이브 셀내는 형광 빛 현미경 및 cryoET의 상관 관계는 인덱스 금 Quantifoil 그리드 0.2 & MU를 사용하여 달성되었다 , M 형광 라텍스 구슬 (그림 2). 종합적으로, 그림 4는 고급 상호 살아있는 세포 현미경과 호스트 헬라 세포와 상호 작용 찬란 HIV-1 입자를 시각화하는 cryo - 전자 단층 촬영에 대한 전반적인 절차의 가능성을 보여줍니다.
그림 1. 헬라 세포에서 HIV-1 입자의 경과 공 촛점 라이브 세포 이미징. 한 녹색 형광 바이러스 입자 (노란색 화살촉) 프레임 사이에 3 분 시간 간격으로 3 차원 공 초점 스택에서 추적되었다가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. 2X (a)와 20X (B) 목표로 촬영 한 Quantifoil 금 EM 찾기 그리드에서 배양 된 HeLa 세포의 형광 이미지와 cryoEM 이미지 간의 상관 관계. (& B) 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지. (C) 극저온 형광 냉동 수화 헬라 세포의 이미지 (미토콘드리아 붉은 색)와 0.2 μm의 극저온 무대와 세포의 DIC 이미지와 겹쳐 40X 긴 작동 거리의 공기 목적으로 기록 된 형광 라텍스 구슬 (녹색). (D 해당 지역의) 낮은 배율 cryoEM 이미지의 (C). (E & F 0.2 μm의 형광 라텍스 구슬을 사용하여 형광 cryoEM 이미지 사이) 상관 관계. 해당 구슬 같은 색으로 동그라미되어 있습니다. 스케일 바, 200 μm의, B에 50 μm의, C, D에 25 μm의 E, F에 5 μm의.
그림 3. CRYO-가벼운 현미경 단계의 건설. () 구리 극저온 샘플 단계 (흰색 화살표)를 냉각하는 데 사용되는 액체 질소로 가득 자기 가압 듀어. 극저온 샘플 단계 (B) 상단 내부보기 , 내부 챔버 (흰색 화살촉)를 표시합니다. 샘플 그리드는 구리 블록 (검은 색 화살표)의 중심에 앉아 EM 표본 카트리지에 배치됩니다. 일단 샘플 그리드로드 카트리지의 내부 챔버 (흰색 화살촉)로 전송내는 형광 광학 현미경. (C & D) 시편 카트리지 전에 (c)와 (d) 구리 반지 (검은 색 화살표를 배치 한 후 ) 비 Polara cryo - 전자 MICR과 함께 사용하는 장소에서 그리드를 유지하는oscope.
그림 4. 상호 현미경으로 헬라 세포의 세포 돌기에 바인딩 한 형광 입자 CryoET. (& B) GFP - 태그 입자내는 형광 이미지와 겹쳐내는 빛 현미경 단계 (A)로 촬영 한 DIC 이미지 (빨강) (B) (C - E). 140X (C) 3500 X (D) 및 27,500의 형광 입자 (패널 B & C에 동그라미) X (E)를 포함하는 영역의 낮은 선량 cryoEM 이미지를 각각 . 단층의 경사 시리즈의 인수 후 기록 삽입물, 확대 (F - H). Z 방향에서 21 나노의 거리로 구분하여 세 4 nm의 두께의 단층 조각. 입자와 헬라 세포막 사이의 연결은 indicat 있습니다투사 이미지 (패널 E의 삽입) 및 단층 조각 (패널 F & G) 모두에서 화살표로 에드. 스케일 바, A와 B에서 10 ㎛, C에서 20 μm의, D 500 nm의 전자 100 nm의 - H.
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Discussion
우리는 cryoET 다음 시간 경과 공 촛점 라이브 세포 형광 이미징을 사용하여 동적 세포 이벤트를 분석하는 고급 상호 접근 방식을 제공하는 프로토콜의 간단한 세트를 발표했다. 고해상도 cryoET와 3D 라이브 세포 이미징의 상관 관계를하는 우리의 방법론 개발은 숙주 세포로 희귀, 동적 (앞에서 정적보고되지 않은) 및 회절 바이러스 입자와의 상호 작용을 시각화 많은 도전 생물학적 문제를 조사하는 것이 중요합니다 . 살아있는 세포에서 특정 입자의 공간과 시간적 동작은 살아있는 세포 분석에 의해 특징 및 정의 감염 단계에서 바이러스 세포 상호 작용의 구조적 세부 사항은 탐구한다. 수제, 극저온 광학 현미경의 무대 cryoEM에 의해 캡처 살아있는 세포와 이미지에서 형광 빛을 이미지 사이의 직접적인 상관 관계를 촉진하는 데 사용됩니다.
염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 포인트가있다최적의 데이터 수집 및 분석을 가지고 주문한다. 그리드의 가장자리에 경사 시리즈 수집을위한 시야의 방해 때문에 첫째, 시간 경과 공 촛점 라이브 셀 이미징에 대해 여러 포지션을 따기 때, 선택된 위치는, EM 격자의 중심에서 0.5 mm 이내이어야한다 cryoET. 그들은 대부분의 스프레드 아웃 및 평면 때 추가 분석을 위해 선택된 셀은 두 개의 유사 분열 단계 사이 여야합니다. 따라서 cryoET 분석 가능한 세포의 얇은 지역은, 그들의 가장 확장 단계에 있습니다. 같은 계면 단계에서 배양 세포의 대부분을 위해, 세포주기는 S-상 18 초에서 차단하는 세포주기의 두 배 티미 딘 치료를 사용하여 동기화 할 수 있습니다. 티미 딘 블록에서 발표 세포는 G2와 유사 분열 단계를 통해 동시에 진행.
둘째, 앞에서 언급 한 샘플의 공 촛점 이미지와 극저온 고정의 마지막 프레임 사이의 시간 지연을 최소화해야한다동적 객체를 효율적으로 직접적인 상관 관계를 허용합니다. 또한, 그리드의 평탄도 및 무결성은 모든 절차에 대한 중요하며 노출 된 격자는 비 Polara 현미경 처리 할 때 특히, 프로토콜에 걸쳐 유지되어야합니다.
마지막으로, 형광 이미지와 대상을 찾을 수있는 전자 현미경 이미지 사이에 정확하고 신뢰할 수있는 상관 관계를 cryoET 데이터의 성공 이후 인수가 필요합니다. 투사 이미지, 낮은 배율에서 선택한 셀의 모양과 방향을 인식하고 때로는 그리드에 구멍을 계산하여 EM 필드에 상호 영역을 찾을 필요합니다. 형광 라텍스 구슬은 더욱 강력하고 정확한 상관 관계 샘플에 추가됩니다. 형광 및 전자 밀도가 둘 다 형광 라텍스 구슬 또는 양자 점, 사용, 형광 이미지에서 대상의 좌표를 직접 정확한 현지화에 EM을 전송할 수 있습니다. 그것은 말아야형광 라텍스 구슬이나 양자점의 발광 파장은 대상의 방출 파장과 중복을 가지고 선택하지 않습니다 주목해야 거라고.
대상 영역을 식별하기위한 설정 현재의 상관 관계가 있으므로 전자 현미경 광학 현미경에서 추가 샘플 전송 단계를 포함하는, cryo - 전자 현미경의 외부에서 이루어진다. 더 직접적이고 간단한 방법은 전자 현미경 내에서 형광 이미징 장치를 설치하여, 19을 생각했습니다. 또한, 0.6 NA와 긴 작동 거리의 공기 목적에 의해 여유 해상도 (~ 0.6 μm의) 제한됩니다. 3D 세포 tomograms의 정밀하고 정확한 나노 단일 분자 현지화 더 미세 구조에 형광 표지 단백질의 상관 관계를 초 고해상도 현미경을 포함합니다.
상호 가벼운 현미경과 cryoET에서 더 진보 추가 t을 결합하여 예상되는이러한 냉동 수화 시편 8 단면 극저온 집중 이온빔 (FIB) 밀링 9,20 및 유리체 등 echniques. 이 기술은 시편 두께의 한계를 극복 크게 cryoET 분석을위한 의무 샘플의 범위를 확대하고, 따라서 허용하는 세포의 깊은 내부를 여행 한 바이러스 입자의 조사. 숙주 세포 인자, HIV-1 CA에 융합 테트라 시스테인 형광 프로브 특정 세포 단백질과 HIV-1 코어의 추가를 두 번 표시와 바이러스 입자의 상호 작용 연구의 측면에서 특히 초기 단계의 식별을 용이하게 할 수 HIV-1 수명주기 및 호스트 요인과 바이러스 입자의 공간과 기능의 관계. 우리는 연구 세포 신호, 막 수용체 인신 매매, 및 세포 생물학의 많은 다른 동적 세포 과정에 중요한 역할을하는 상호 3D 라이브 세포 이미징 및 cryoET 방법론을 기대하고 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 기술의 CRYO-형광 샘플 단계, 중국 과학 기술 대학의 Changlu 어르신과 쳉 쑤의 건설 트래비스 휠러 및 세포 생물학의학과 기계 공장 및 생리학, 피츠버그 대학교에 감사드립니다 안내, 원고의 중요한 읽기 박사 테레사 Brosenitsch. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (GM082251 & GM085043)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
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