Summary
Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.
Abstract
Cryo-elektron tomografi (cryoET) yakın-to-fizyolojik durumu 1 moleküler çözünürlükte hücresel yapıların 3 boyutlu görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, cryoET ile ev sahibi hücresel ortamda ayrı ayrı virütik kompleksleri, doğrudan görselleştirme özellikle HIV-1 durumunda, viral giriş seyrek ve dinamik yapısı nedeniyle, 2 zordur. Zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme HIV-1 3-7 yaşam döngüsü birçok yönleri hakkında bilgi büyük bir vermiştir ise, çözünürlük canlı hücre mikroskobu sağladığı (~ 200 nm) sınırlıdır. Çalışmalarımız, canlı hücre floresan ışık mikroskobu birleştirerek cryo-floresan mikroskop ve cryoET tarafından HIV-1 enfeksiyonu erken olayların doğrudan görselleştirme izin veren bir korelasyon yöntemi geliştirmeyi amaçlıyordu. Bu şekilde, canlı hücre ve kriyo-floresan sinyalleri doğru cryoET içinde numuneleme yönlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, yapısal bilgi cryoET olabilir b eldedinamik fonksiyonel verileri ile tamamlanmaktadır E floresan etiketli hedef canlı-hücre görüntüleme ile kazandı.
Bu video makalede, biz yapısal HIV-1 araştırılması ve 3D karşılıklı yüksek hızlı canlı hücre görüntüleme ve yüksek çözünürlüklü cryoET yapısal analizi ile konak-hücre etkileşimleri için detaylı yöntem ve protokolleri sağlar. HIV-1 ile enfekte olmuş partiküller HeLa hücreleri canlı hücre konfokal mikroskopi ile ilk olarak karakterize edilmiştir, ve aynı viral partikül içeren bölgesi, daha sonra 3 boyutlu yapısal detayları için kriyo-elektron tomografi ile analiz edilmiştir. Görüntüleme verileri, optik görüntüleme ve elektron görüntüleme, iki takım arasındaki ilişki bir ev yapımı cryo-floresan ışık mikroskobu sahne kullanılarak elde edilmiştir. Burada ayrıntılı yaklaşım virüs-konak hücre etkileşimleri çalışma için değil, aynı zamanda hücre sinyal, membran reseptör ticareti gibi hücre biyolojisi daha geniş uygulamaları, ve diğer birçok dinamik hücresel süreçleri için değil sadece, değerli olacaktır. </ P>
Introduction
Cryo-elektron tomografi (cryoET) hücre ve dokuların üç boyutlu (3D) görselleştirme izin verir ve bir yakın-fizyolojik durum 1 moleküler çözünürlükte yerli organeller ve hücresel yapıların örgüt haline anlayışlar sağlayan güçlü bir görüntüleme tekniğidir. Ancak, radyasyon duyarlılığı ile birlikte lekesiz dondurulmuş sulu numune, en doğal düşük kontrast zor bir hücre içinde ilgi alanları bulmak ve daha sonra hedef alan zarar vermeden başarıyla eğim dizi performans için yapar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, ışık ve elektron mikroskopi birleştiren bir bağlaşık bir yaklaşım gereklidir. Floresan etiketleme tarafından vurgulanan özgü özellikleri tespit ve floresan ışık mikroskobu ile bulunan ve daha sonra koordinatları yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu yapısal veri toplama için elektron mikroskobu aktarılır edilir. Bu yöntem, bir korelâsyon hedef bulma yardımcıilgi Arıkan ele alınması. CryoEM (<300 nm) numune kalınlığına sınırlama nedeniyle, şu anda, hücrenin, sadece çevre bölgelerinde CryoET ile 3 boyutlu yapısal analizi için uygundur. Ayrıca freze 9 vitreus 8 kesit veya kriyo-odaklı iyon demeti (FIB) tarafından dondurulmuş sulu örneklerin kalınlığı azaltmak bağıntılı görüntüleme yeteneği genişletmek olacaktır.
Daha önce, bağıntılı yöntemler öncelikli olarak büyük statik ve yapıları için 10-13 cryoET veri toplama kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Bu çalışmalarda, cryo-aşamaları cryoEM ızgaraları kabul ve dik bir mikroskop ya da ters bir mikroskop 10,11,14 ya sığacak şekilde uygulanmıştır. Izgaraları geçiş kendi tasarımları oldukça basit görünse de, EM ızgara için ilgili adımları transfer ızgara, deforme hasar ve kontamine olabilir şansı artan ek vardır. Biz son zamanlarda bir teknik ilerleme gösterdibize doğrudan enfeksiyon 15 erken aşamalarında, HIV-1 ve konak hücre etkileşimleri olarak yakalamak için doğası gereği zordur dinamik olaylar, görüntülemenizi sağlar bağıntılı mikroskobu. Böylece korelasyon kolaylaştırmak, ızgara kullanım nedeniyle örnek hasarı en aza indirmek için bir kartuş sistemi adapte bir cryo-ışık mikroskobu örnek sahne tasarımı ve uygulayarak bu başarılı. Tasarım her iki kriyo-ışık ve cryo-elektron mikroskobu böylece karşılıklı süreç düzene, örnek transferi olmadan, aynı numune tutucu üzerine, sırayla, yapılacak sağlayan, entegre örnek kartuş tutucu içerir. Buna ek olarak, aynı zamanda indirgeme belirteçleri olarak floresan lateks boncukları kullanılarak doğru ve güvenilir bir korelasyon işlemi uygulanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Karbon kaplı üzerinde HeLa Hücre Kültürü, Altın EM Bulucu Izgaralar
- Glow deşarj 25 saniye için 25 mA altında 200-örgü R2 / 2 Quantifoil altın EM bulucu ızgara karbon tarafı.
- Coat 50 mg / ml fibronektin çözümün bir 40 ul damlacık üzerine, aşağı, karbon-yan yüzen fibronektin ile EM ızgara, daha sonra bir doku kültürü kaputu 2 saat UV ışığı altında dezenfekte edin.
- Plaka HeLa bir cam alt kültürü çanağı içinde 2 x 10 4 hücre / ml (toplam 2 ml kültür) bir yoğunlukta ızgara üzerine hücreleri ve DMEM içinde,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de hücrelerin büyümesi 4.5 ile takviye edilmiş yaklaşık 18 saat boyunca g / L L-glutamin ve glikoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin,. HeLa hücreleri O / N kültürden sonra enfekte edilir.
2. HIV-1 enfeksiyonu ve Canlı hücre Görüntüleme
- Cam-alt kültür bir floresan hücre izci (Kırmızı CMTPX, 1 ul / 2 ml) EkleÇanak (adım 1.3) ve floresan boya kadar almak izin vermek için, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe çanak.
- Hücreler PBS ile yıkanır ve 50 ul önceden ısıtılmış taze ortam ilave edin.
- 37 ° C, bir Tebeşir Alan Konfokal tarayıcı mikroskop de, canlı-hücre odası üzerine çanak yerleştirin. Onlar cryoEM yana en yayılma-out ve düz (Şekil 2c ve 2d bakınız), zaman nispeten ince bölgeleri gerektirir iki mitoz faz arasındaki hücreleri ile 1-3 hücre / kare içeren birden çok alan (10-15 pozisyonları), seçin örnek. Gelecekte görüntüleme (adım 2.5) için bu pozisyonları saklayın.
- (Biz p24 40 ng / ml içeren bir numunenin 40 ul kullanın) GFP VPR içeren VSV-G sözde yazılmış HIV-1 parçacıkları ile hücreleri enfekte. Görüntüleme için pozisyon seçili ve saklanan beri çanak alt içine virüs parçacıkları eklerken, EM ızgara rahatsız değil dikkatli olun.
- Hemen virionlar eklenmesinden sonra, Ti toplamak20-40 dakika önce seçilen pozisyonlarda yüksek hızlı 3D konfokal görüntüleri, (adım 2.3 'e) me-sukut.
- Konfokal görüntüleri MetaMorph kullanılarak elde ve Imaris yazılım (Bakınız Şekil 1) kullanarak tek parçacık dinamiği için otomatik 3D parçacık izleme ile analiz edildi. Biz kırınım-sınırlı dinamik davranışı arasında ilişki olduğu için HIV-1 hücresel ince yapı, zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme ve 3D parçacık izleme ile parçacıklar sonuçları için önemlidir. Ancak, büyük ve statik yapısı için, basit bir floresan görüntü (canlı hücre olmadan) karşılıklı analiz için yeterli olacaktır.
3. Dondurulmuş-sulu EM Numune Hazırlama
Son konfokal görüntü ve örnek cryo-fiksasyon toplanması arasındaki zaman gecikmesini en aza indirmek için, FEI Vitrobot (ya da diğer vitrifikasyon cihaz) floresan konfokal canlı hücre görüntüleri toplama sırasında başlatılan ve dalma-dondurma için hazırlanmalıdır.
- Vitrifikasyon cihazı açın ve 22 iklim sıcaklığını ayarlamak ° C,% 100 hedef nem, 7 saniye için kurutma süresi ve bekleme ve 1 sn zaman boşaltın.
- Piston Dewar içinde ızgara saklama kutusu yerleştirin ve soğuk sıvı etan hazırlamak. Vitrifikasyon cihaz üzerine Dewar monte edin.
- Hemen konfokal canlı hücre görüntüleme (bölüm 2) sonra, bir buz soğutmalı bakır blok üzerine kültür çanak yerleştirin ve cryoEM numune hazırlama odasına aktarın. Özel cımbız üzerine EM ızgara yüklemek ve hızlı bir şekilde ızgara üzerinde herhangi bir medya uzak kurulayın. Kurutma 0.2 mikron floresan mikroküreler hemen ızgara yerleştirilir ile 15 nm altın boncuk çözüm 4 ul karışık sonra, filtre kağıdı ile, elle yapılır. Altın boncuklar tomografi veri toplama ve hizalama yardım etmek için indirgeme marker olarak kullanılmaktadır. Floresan mikroküreler (Şekil 2c-2f bakınız) floresan ve cryoEM görüntüler arasında korelasyon yardım için kullanılır.
- Vitrifikasyon cihaz üzerine cımbız yükleyin ve sıvı etan 16 dondurma leke ve atılmak için cihaz talimat. En iyi sonucu elde etmek için optimize kurutma parametreler şunlardır: leke zaman, 7 saniye, leke ofset, 0, drenaj süresi, 1 sn, sıcaklık, 22 ° C ve nem,% 100.
- Daha sonra kullanmak için hemen cryoET görüntüleme için bir cryoEM tutucu, ya da bir sıvı azot depolama Dewar dondurulmuş sulu ızgara aktarın.
4. Cryo-floresan Işık Mikroskopi
Bir ev yapımı, cryo-floresan örnek odası ve sahne sistemi (Şekil 3) adımları 4,1-4,10 yürütmek için gereklidir. Sahnenin ayrıntılı özellikleri ve açıklama Haziran ve ark. 15. bulunabilir.
- En az 2 saat cryo-floresan ışık mikroskobu (Şekil 3a bak) başlamadan önce sıvı azot ile kendinden basınçlı sıvı nitrojen Dewar doldurun.
- Bir homebuilt cryo-f monteBöyle bir Olympus IX 71 olarak ters bir floresan ışık mikroskobu, üzerine luorescence örnek sahne 15 (Şekil 3).
- Kendini basınçlı Dewar için cryo-örnek sahne sıvı azot girişi bağlayın ve uygun bir kabın içine sıvı azot taşma koruması çıkışı yerleştirin. Objektif sıcak ve don serbest tutmak için objektif lens üzerine yerleştirilen bir kol için kuru azot gazı hattı bağlayın.
- Dondurulmuş sulu örnek ızgara yüklemek için cryo aşamalı odasına bir bakır blok platformu (Şekil 3b siyah ok) yerleştirin. Soğumasını ve öz-basınçlı dolum Dewar gelen giriş hattı üzerinden sıvı nitrojen ile cryo-sahne bakır odası doldurun.
- Cryo aşamalı sıvı azot sıcaklığında (~ 4-6 dakika içinde) ulaştığında, cryo aşamalı için ızgara saklama kutusu (adım 3.5 dan itibaren) aktarın.
- Bakır blok EM numune kartuş içine donmuş-sulu örnek ızgara yerleştirin ve g klibiC-ring kullanılarak yerinde kurtulmak, ya da üstüne bir önceden soğutulmuş bakır halka (Şekil 3d siyah ok) yerleştirin, ızgara kolay erişim için de bir yerde ızgara tutmak ve sonra (bir Polara mikroskop kartuş kullanıyorsanız) Cryo-floresan görüntüleme (olmayan bir Polara cryo-elektron mikroskobu için ise).
- Kriyo-aşamada (Şekil 3b'de beyaz ok başı) iç bölmesi içinde kartuşu (adım 4,6) yerleştirin.
- Arama ve canlı hücre görüntüleme verilerden aynı virüs parçacıkları bulmak. EM ızgara bir dizin olduğundan, canlı hücre görüntüleri ve cryo-floresans görüntüler hem de ızgara üzerinde aynı parçacık tespit etmek için basittir.
- Uzun çalışma (2,7-4 mm) objektif lens ile bir ışık mikroskobu kullanarak cryo-koşul altında belirlenen pozisyonlarda cryo-DIC ve GFP görüntüler elde. Cryo floresan görüntüleme sırasında, periyodik olarak, cryo aşamalı ve dolum içinde sıvı azot seviyesini kontrol gerektiği gibi, -170 aşağıdaki örnek sahne tutmak için° C
- Kriyo-floresan görüntüleme tamamlanmasından sonra, dikkatli bir şekilde, bakır blok platformuna örnek kartuşu dönmek ve Polara sistemi ile gelecekteki cryoET analizi için bir sıvı azot Dewar kartuşunu. Olmayan bir Polara cryo-elektron mikroskobu kullanıyorsanız, bakır halka kaldırmak için örnek ızgara almak, bir ızgara saklama kutusu yerleştirin ve numune cryoET tarafından incelenir kadar sıvı azot Dewar içinde numune saklayın.
- Veri analizi için, satın cryo-DIC ve GFP görüntüleri üst üste (adım 4,9, Şekil 4b) ve canlı hücre görüntüleme serisi elde edilen ile cryo floresan görüntü GFP sinyallerin pozisyonları ilişkilidir.
5. Cryo-elektron Tomografi
- Bu Polara G2 mikroskop gibi bir alan emisyon silah ile donatılmış bir elektron mikroskop cryo-aktarma istasyonuna örnek kartuşu yükleyin.
- 140X, ide bir büyütme altında düşük doz-arama moduntify ve bir sahne dosyasına ilgili ızgara kareler (adım 4.11 'dan itibaren) kaydedin.
- 3.500 X bir büyütmede düşük doz-arama modu altında, bir 100 mikron objektif diyafram, arama eklemek ve bir ikinci aşama dosyaya GFP sinyalleri ile ilişkili tüm pozisyonları kaydedin.
- Önemsiz bir karbon bölgedeki buz uzak yakarak, sahne y işlevini kullanarak, / Å 2 ve eğim ekseni rafine - düşük doz-pozlama modu altında, 1 veya 2 e bir doz ışın yoğunluğunu ayarlamak için boş bir alan bulmak birkaç altın boncuk ile.
- Düşük doz-odak modu altında, ~ 3 mikron olarak odak mesafesini ayarlamak ve eğim eksenine paralel olarak odak yönünü hizalamak için açısını ayarlayın.
- Düşük doz-arama modu altında, (adım 5.3) kayıtlı pozisyonları hatırlamak, örnek eucentric yüksekliğini ayarlayın ve ilgi alanı için eğim aralığı kontrol edin. Expos de, 8 ile 10 mikron bulanıklaştırma az - çok düşük elektron doz (/ Å 2 ~ 1 e) ile bir projeksiyon görüntü eldekriyo-elektron tomografi için ilişkili virüs parçacıkları onaylamak için ure modu,.
- Düşük doz odak moduna geçin. TEM otomatik fonksiyonları menüsünde, otomatik eucentric yüksekliği öncesinde ve odak alanı fonksiyonları odaklanmak.
- Bir eğim serisi elde etmek için parametreleri ayarlayın. / Å 2 toplam doz - Bu yazıda Şekil 4 için, eğim açıları, sırasıyla, 3 ° ve 2 ° eğim artışlarla, °, altında ve üstünde 45 ° ± 70 arasında değişen 6 mikron bulanıklaştırma ve yaklaşık 70 e, kullanılmıştır.
- Tüm kayıtlı pozisyonlar için adımları 5.7 ve 5.8 tekrarlayın. Toplu tomografi yazılım iş verimini arttırmak için çoklu pozisyonlarda otomatik veri toplama için kullanılabilir.
6. IMOD 17 kullanarak üç boyutlu İmar
- Minimum ve maksimum yoğunluk değerleri ayarlayın ve büyük görüntü değişimine bağlı olarak dışlanacak herhangi bir görünümü var olup olmadığını belirlemek için ham tilt serisi kontrol edin.
- ETomo ve Eksen tipi, piksel boyutu, konvansiyonel indirgeme çapı, vb kullanarak kurulum tomografisinde paneli başlatın. Sonra com komut dosyaları oluşturabilirsiniz.
- Tomografisinde hesaplama birkaç aşamada ayarlanabilir / eş zamanlı olarak takip edilebilir şekilde ana pencere yapılandırın. Gerekli parametreleri değiştirin ve her işlem adım (eTomo öğretici bak, gerekli olan özel programlar yürütmek http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- Son aşamada, tam uyumlu yığını oluşturmak (0.6 daha az bir ortalama kalıntı hata ile) ve IMOD bir ağırlıklı arka projeksiyon algoritması kullanılarak tomografi yeniden.
- Kontrast ve netlik geliştirmek için uygun parametrelerle IMOD uygulanan bir 3D doğrusal olmayan anizotropik difüzyon kenar geliştirme programını kullanarak ilgi potansiyel alanları Denoise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virüs partiküllerinin dinamik davranışını karakterize etmek için, HIV-1 ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde yüksek hızlı canlı hücre konfokal mikroskopi ile görüntülenmiştir ve partikül hareketleri (Şekil 1) otomatik 3 parçacık izleme ile analiz edilmiştir. Son konfokal canlı hücre görüntü toplama ve dalma-dondurma (ki yeterince ilişkili HIV-1 parçacıkların kaybetmek olabilir), bir cryo-floresan ışık mikroskobu aşamada (Şekil 3 arasında oluşabilir birkaç dakika zaman atlamalı önlemek için ) ışık mikroskobu ile, cryoEM kartuşları içinde, görüntüleme dondurulmuş sulu örnekleri 15 için tasarlanmış ve inşa edilmiştir. Bir bakır blok platformu (Şekil 3b, siyah ok) ve bakır halka (Şekil 3d, ok ucu) olmayan Polara elektron mikroskopları ile kullanmak için eklendi. Konfokal canlı hücre, cryo-floresan ışık mikroskobu ve cryoET arasındaki korelasyon endeksli altın Quantifoil ızgaraları ve 0.2 ve mu kullanılarak elde edildi ; M floresan lateks boncuk (Şekil 2). Birlikte ele alındığında, Şekil 4 ileri karşılıklı canlı hücre mikroskopi ve bir dizi HeLa hücre ile etkileşim floresan etiketli HIV-1 parçacıkların görselleştirmek için kriyo-elektron tomografi için genel yöntemin uygulanabilirliğini göstermektedir.
Şekil 1. HeLa hücrelerinde HIV-1 parçacıkların zaman atlamalı konfokal canlı hücre görüntüleme. Tek yeşil floresan viral partikül (sarı ok) kareler arasında bir 3 dakika zaman aralığı ile 3D konfokal yığınlarının içinde takip edildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
d/50386/50386fig2.jpg "/>
Şekil 2. Bir 2X (a) ve 20X (b) hedefleri ile kaydedilmiş bir Quantifoil altın EM bulucu ızgara, kültüre HeLa hücrelerinin floresan görüntüleri ve cryoEM görüntüleri arasındaki ilişki. (A ve b) Diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri. (C) Cryo -floresan dondurulmuş sulu HeLa hücrelerinin görüntüsü (mitokondri için kırmızı renk) ve 0.2 mikron bir cryo aşamalı ve hücrelerin bir DIC görüntü ile kaplanmış bir 40X uzun çalışma mesafesi hava amacı, kaydedilen floresan lateks boncuk (yeşil),. (d karşılık gelen bölge) düşük büyütme cryoEM görüntü (c). (E & F 0.2 mikron floresan lateks boncukları kullanılarak floresans ve cryoEM görüntüleri arasında) korelasyon. Sorumlu boncuklar aynı renk ile daire vardır. Ölçek bar, bir 200 mikron, 50 mikron, b, c, d, 25 mikron e, f 5 mikron.
Şekil 3,. Cryo-ışık mikroskobu sahne inşaatı. (A) bakır cryo-örnek sahne (beyaz ok) soğutmak için kullanılan sıvı nitrojen dolu bir kendini basınçlı Dewar,. Cryo-örnek sahne (b) Top, iç görünümü , iç oda (beyaz ok) gösteren. Örnek ızgara bir bakır blok (siyah ok) ortasına oturur EM numune kartuş, üzerine yerleştirilir. Bir kez örnek ızgara yüklü, kartuş için iç oda (beyaz ok) aktarılır cryo-floresan ışık mikroskobu. (C ve d) Numune Kartuş önce (c) ve (d) bir bakır halka (siyah ok ucu yerleştirdikten sonra ) olmayan Polara cryo-elektron MICR kullanmak için yerinde ızgara tutmak içinOscope.
Şekil 4. Karşılıklı mikroskobu ile bir HeLa hücrenin hücresel çıkıntı bağlı tek bir floresan parçacığın CryoET. (A ve b) GFP etiketli parçacıkların bir cryo-floresan görüntü ile kaplanmış bir cryo-ışık mikroskobu aşamasında (a) ile kaydedilen bir DIC görüntü (kırmızı) (b) (c - e). 140X (C), 3500 X-(d) ve 27.500 bir floresan parçacık (panel B ve C işaretli) X (e) ihtiva eden bölgenin düşük doz cryoEM görsel sırasıyla . Tomografik tilt serisi kazanılmasından sonra kaydedilen Ankastre, büyük bir görüntü (f - h). Z yönünde 21 nm bir mesafe ile ayrılmış üç 4 nm kalınlığında tomografik dilim. Parçacık ve HeLa hücre zarı arasındaki bağlantılar değil Göstergeler olanprojeksiyon görüntü (panel e ilave) ve tomografik dilimleri (paneller f ve g) hem de oklarla ed. Ölçek bar, a & b 10 mikron, c 20 mikron, d 500 nm ve e 100 nm - h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz cryoET takip zaman atlamalı konfokal, canlı hücre floresan görüntüleme kullanarak dinamik hücresel olayları analiz etmek için gelişmiş bir karşılıklı bir yaklaşım sağlamak için protokoller basit bir dizi sundu. Yüksek çözünürlüklü cryoET ile 3D canlı hücre görüntüleme ilişkilendirmek için metodolojik geliştirme gibi ana hücreleri ile nadir, dinamik (, daha önce statik rapor değil), ve kırınım sınırlı viral parçacıklar ve etkileşimleri görselleştirme gibi birçok zorlu biyolojik sorunları, araştırmak için önemlidir . Canlı hücreler, belirli parçacıkların uzaysal ve zamansal seyri canlı hücre analiz ile karakterize edilir ve tanımlanmış enfeksiyon aşamalarında virüs-hücre etkileşimleri yapısal detayları incelenmiştir. Bir ev yapımı, cryo-ışık mikroskobu sahne cryoEM tarafından yakalanan canlı hücreleri ve görüntülerden floresan ışık görüntü arasında doğrudan bir ilişki kolaylaştırmak için kullanılır.
Akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardıren iyi veri toplama ve analiz için sipariş. Izgara kenar eğim serisi edinimi için görüş alanı engelleyen bu yana ilk, zaman atlamalı konfokal canlı hücre görüntüleme için birden fazla pozisyon seçerken, seçilen pozisyonları, EM ızgara ortasından 0,5 mm içinde olmalıdır cryoET. En çok yayılma-out ve düz olduğunda, daha fazla analiz için seçilen hücreler, mitoz, iki faz arasında olmalıdır. Bu nedenle, cryoET analizi için kullanılabilir hücrelerinin ince bölgeler, onların en uzun bir aşamadadır. Aynı interfaz aşamasında kültür hücrelerinin çoğunluğu sahip olmak için, hücre döngüsü S-fazı 18 erken de engelleyen hücre döngüsü çift timidin tedavi ile senkronize edilebilir. Timidin blok serbest hücreler daha sonra G2-ve mitotik faz ile eş zamanlı ilerleme.
İkinci olarak, daha önce belirtildiği gibi, örnek konfokal görüntü ve cryo-tespitin son kare arasındaki zaman gecikmesini minimize edilmelidirDinamik nesne verimli doğrudan bir ilişki sağlar. Buna ek olarak, ızgara düzlüğü ve bütünlüğü tüm işlemler için kritik olan ve çıplak ızgaraları olmayan Polara mikroskoplar için işlenir zaman özellikle, protokol boyunca muhafaza edilmelidir.
Son olarak, floresan görüntü ve hedef bulmak için elektron mikroskopi görüntü arasındaki, hassas ve güvenilir bir korelasyon cryoET veri başarılı sonraki elde edilmesi için gereklidir. Bir projeksiyon görüntü, düşük büyütmede, seçilen bir hücrenin şekil ve yön tanınması ve bazen ızgara üzerinde delikler sayma EM alanında ilişkili bölge bulmak için gereklidir. Floresan lateks boncuk, daha sağlam ve doğru korelasyon için numuneye eklenir. Floresan ve elektron-yoğun, her ikisi de floresan lateks boncuk ya da Quantum noktalar kullanılarak, floresan görüntü hedef koordinatları doğrudan tam olarak lokalize EM transfer edilebilir. Bu omuzfloresan lateks boncuk veya Kuantum nokta emisyon dalga boyu hedefin emisyon dalga boyu ile örtüşme var değil seçilir belirtmek d.
Bir hedef alan belirlenmesi için ayarlanmış mevcut ilişki böylece elektron mikroskobu için bir optik mikroskop ek bir örnek transferi adım içeren, bir kriyo-elektron mikroskobu dışında gerçekleşir. Bir daha doğrudan ve kolay yöntem elektron mikroskobu içinde bir floresan görüntüleme cihazı takarak, 19 düşünülmüş. Buna ek olarak, 0.6 NA ile uzun çalışma mesafesi hava objektif sağladığı çözünürlük (~ 0.6 mikron) sınırlıdır. 3D hücresel tomografi hassas ve doğru nano tek bir molekül lokalizasyonu daha ultrastrüktür floresan etiketli proteinlerin ilişkilendirmek için süper çözünürlük mikroskopi içerecektir.
Karşılıklı ışık mikroskobu ve cryoET daha fazla gelişmeler ek t birleştirerek bekleniyorBu dondurulmuş sulu örneklerin 8 kesit cryo-odaklı iyon demeti (FIB) freze 9,20 ve vitreus gibi echniques,. Bu teknikler, numune kalınlığı sınırlamaları aşmak büyük ölçüde cryoET analizi için mükellef örneklerin yelpazesini genişleterek, bu nedenle izin hücrelerin derin iç seyahat ettim viral parçacıkların incelenmesi. Konak hücre faktörler, HIV-1 CA erimiş bir tetra-Sistein floresan prob ile spesifik hücresel protein ve HIV-1 çekirdek daha fazla çift etiketleme ile virüs parçacık etkileşimleri çalışma açısından özellikle erken dönemlerinde belirlenmesini kolaylaştırabilir HIV-1 yaşam döngüsü ve konak faktörleri ve viral parçacıkların mekansal ve fonksiyonel bir ilişki. Biz çalışma hücre sinyal, membran reseptör ticareti ve hücre biyolojisi diğer birçok dinamik hücresel süreçleri önemli rol oynamak için karşılıklı 3D canlı hücre görüntüleme ve cryoET metodoloji tahmin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarının beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar teknik için cryo floresan örnek sahne, Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Changlu Tao ve Cheng Xu yapımı için Travis Wheeler ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nde makine atölyesi ve Fizyoloji, University of Pittsburgh teşekkür etmek istiyorum hizmetleri ve yazının eleştirel okuma Dr Teresa Brosenitsch. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM082251 & GM085043) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W.
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al.
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
