Summary
Vi beskriver en samsvarende mikroskopi metode som kombinerer høyhastighets 3D live-cell fluorescerende lys mikroskopi og høy oppløsning Cryo-elektron tomografi. Vi demonstrerer evnen til correlative metoden ved bildebehandling dynamisk, små HIV-1 partikler i samspill med host Jakten celler.
Abstract
Cryo-elektron tomografi (cryoET) kan 3D visualisering av cellulære strukturer på molekylært oppløsning i en nær-til-fysiologisk tilstand en. Imidlertid er direkte visualisering av individuelle virale komplekser i deres vert cellulære miljø med cryoET utfordrende 2, på grunn av den uvanlige og dynamiske natur av viral inngang, særlig i tilfellet med HIV-1. Mens time-lapse live-cell imaging har gitt en god del informasjon om mange aspekter av livet syklus av HIV-1 3-7, oppløsningen gis av live-cell mikroskopi er begrenset (~ 200 nm). Vårt arbeid var rettet mot å utvikle en sammenheng metode som tillater direkte visualisering av tidlige hendelser av HIV-1-infeksjon ved å kombinere live-cell fluorescerende lys mikroskopi, Cryo-fluoriserende mikroskopi, og cryoET. På denne måte kan leve-celle og kryo-fluorescerende signaler brukes til å nøyaktig styre prøvetakingen på cryoET. Videre strukturell informasjon innhentet fra cryoET kan be supplert med de dynamiske funksjonelle data innhentet gjennom live-cell imaging av fluorescerende merket målet.
I denne videoen artikkelen gir vi detaljerte metoder og protokoller for strukturell undersøkelse av HIV-1 og vert-celle interaksjoner med 3D trene seg høyhastighets live-cell bildebehandling og høy oppløsning cryoET strukturell analyse. HeLa-celler infisert med HIV-1 partikler ble først karakterisert ved konfokal mikroskopi levende celle, og regionen som inneholder den samme viruspartikkelen ble deretter analysert ved kryo-elektron tomografi for 3D strukturelle detaljer. Korrelasjonen mellom to sett av imaging data, optisk bildebehandling og elektron bildebehandling, ble oppnådd ved hjelp av en hjemme-bygget Cryo-fluorescens lysmikroskopi scenen. Tilnærmingen detaljert her vil være verdifull, ikke bare for studier av virus-vert celle interaksjoner, men også for bredere anvendelse i cellebiologi, for eksempel cellesignalisering, membran reseptor menneskehandel, og mange andre dynamiske cellulære prosesser. </ P>
Introduction
Cryo-elektron tomografi (cryoET) er en kraftig bildebehandling teknikk som gjør tredimensjonal (3D) visualisering av celler og vev, og gir innsikt i organiseringen av innfødte organeller og cellulære strukturer på molekylært oppløsning i en nær-til fysiologisk tilstand en. Imidlertid gjør den iboende lav kontrast av unstained frosset hydrert prøven, kombinert med deres stråling følsomhet, er det vanskelig å lokalisere områder av interesse inne i en celle og deretter utføre den vippbare serie med hell uten å skade målområdet. For å overvinne disse problemer, er en samsvarende fremgangsmåte som kombinerer lys-og elektronmikroskopi er nødvendig. Spesifikke funksjoner markert med fluorescerende merking er identifisert og lokalisert ved fluorescens lysmikroskopi, og deretter deres koordinater overføres til elektronmikroskop for erverv av høyoppløselige 3D strukturelle data. Denne trene seg metoden hjelper lokalisere målet enreas av interesse tas opp. På grunn av begrensning på prøven tykkelse med cryoEM (<300 nm), for tiden bare de perifere delene av cellen er egnet for 3D strukturell analyse av CryoET. Ytterligere redusere tykkelsen av frossen-hydrert eksemplarer av glasslegemet seksjonering 8 eller ved Cryo-fokusert ion stråle (FIB) fresing 9 vil utvide evnen til correlative bildebehandling.
Tidligere ble samsvarende metoder primært brukes til å forenkle cryoET datainnsamling for store og statiske strukturer 10-13. I disse studiene har Cryo-etapper er iverksatt for å akseptere cryoEM nett og passe på enten en oppreist mikroskop eller en invertert mikroskop 10,11,14. Selv bytter nett virker ganske grei i sine design, er det ekstra overføring trinn involvert for EM rutenett, øker sjansen for at nettet kan bli deformert, skadet og forurenset. Vi har nylig demonstrert en teknisk fremskritt icorrelative mikroskopi som tillater oss å direkte visualisere dynamiske hendelser som er av natur vanskelig å fange, slik som HIV-1 og vert celle interaksjoner på tidlige stadier av infeksjon 15. Vi oppnådd dette ved å designe og implementere en Cryo-lysmikroskopi prøven scenen som tilpasser en patron system for å minimere prøven skade på grunn av rutenett håndtering, og dermed tilrettelegge for korrelasjon. Vår design inkluderer en integrert eksemplar kassettholderen, slik at både Cryo-lys og Cryo-elektron mikroskopi som skal utføres, sekvensielt, på samme prøven holder, uten sample overføring, og dermed effektivisere den samsvarende prosessen. I tillegg har vi også implementert en nøyaktig og pålitelig korrelasjon prosedyren ved hjelp av fluoriserende latekskuler som fiducial markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. HeLa Cell Culture on Carbon-belagt, Gold EM Finder Rister
- Glødeutladning karbon-siden av et 200-mesh R2 / 2 Quantifoil gull EM finder gitteret under 25 mA i 25 sek.
- Coat EM rutenett med fibronektin, ved den flytende, karbon-siden ned, på en 40 ul dråpe på 50 ug / ml fibronektin-løsning, deretter desinfisere den under UV-lys i 2 timer i en vevskultur hette.
- Plate Jakten celler bort på nettet med en tetthet på 2 x 10 4 celler / ml (totalt 2 ml kultur) i et glass-bottom kultur tallerken og vokser cellene ved 37 ° C, med 5% CO 2, i DMEM supplert med 4,5 g / l L-glutamin og glucose, 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum, 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, i omtrent 18 timer. Jakten celler er infisert etter at O / N kultur.
2. HIV-1-infeksjon og Live-cell Imaging
- Legg et fluorescerende celle tracker (Red CMTPX, 1 mL / 2 ml) inn i glass-bunn kulturkonkavitet (fra trinn 1.3) og inkuber fatet ved 37 ° C i 10 min, for å tillate opp-ta av det fluorescerende fargestoff.
- Vask cellene med PBS og tilsett 50 mL forvarmet frisk medium.
- Sett fatet på live-cell kammer, ved 37 ° C, av en Swept Felt Confocal skanner mikroskop. Velg flere felt (10-15 stillinger) som inneholder 1-3 celler / kvadrat, med cellene mellom to mitose faser når de er mest spredt ut og flat (se figur 2c og 2d), siden cryoEM krever relativt tynne regioner av prøven. Lagre disse posisjonene for fremtidig imaging (trinn 2.5).
- Infisere celler med VSV-G pseudo-skrev HIV-1 partikler som inneholder GFP-Vpr (vi bruker 40 mL av en prøve som inneholder 40 ng / ml p24). Når du legger de viruspartikler i bunnen av fatet, være nøye med å ikke forstyrre EM rutenettet, siden posisjonene for bildebehandling har allerede valgt og lagret.
- Umiddelbart etter tilsetning av virioner, samle TIme-lapse høyhastighets 3D confocal bilder, på de tidligere valgte posisjoner (fra trinn 2.3) for 20-40 min.
- Confocal bildene ble anskaffet ved hjelp MetaMorph og analysert av automatiserte 3D partikkel sporing for enkelt partikkel dynamikk ved hjelp Imaris programvare (se figur 1). Siden vi samkjøre den dynamiske oppførselen til diffraksjon-begrenset HIV-1 partikler med mobilnettet ultrastructure, time-lapse live-cell bildebehandling og 3D partikkel sporing er kritiske til resultatene. Imidlertid, for en stor og statisk struktur, ville en enkel fluorescens bilde (uten levende celle) være tilstrekkelig for samsvarende analyse.
3. Frossen hydrert EM Sample Preparation
For å minimere tidsforsinkelsen mellom samling av siste confocal bilde og Cryo-fiksering av prøven, bør FEI Vitrobot (eller andre vitrifisering enhet) initieres og klargjort for stup-frysing under innsamling av fluorescens konfokale levende celle bilder.
- Slå på vitrifisering enheten og sette sitt klima temperaturen til 22 ° C, målet fuktigheten til 100%, det blotting tid til 7 sek, og ventetiden og renne tid til 1 sek.
- Plasser grid oppbevaringsboks i stempelet dewar og forberede kald væske etan. Monter dewar på vitrifisering enheten.
- Umiddelbart etter confocal live-cell imaging (§ 2), plasser kultur tallerken på en is-avkjølte kobber blokk og overføre den til cryoEM prøveopparbeidelse rom. Laste EM rutenett på de spesialiserte pinsett og raskt klatt bort noen medier på nettet. Den blotting skjer manuelt, ved hjelp av filtrerpapir, hvoretter 4 pl av 15 nm gull perle oppløsningen ble blandet med 0,2 mikrometer fluorescerende mikrosfærene umiddelbart plasseres på risten. Gullet perler blir brukt som fiducial markører for å hjelpe tomographic datainnsamling og justering. Den fluorescerende mikrosfærer blir brukt til å hjelpe korrelasjon mellom fluorescerende og cryoEM bilder (se figur 2c-2f).
- Laste pinsett på vitrifisering enheten og instruerer enheten til blot og stupe fryse i flytende etan 16. Blotting parametere er optimalisert for å oppnå beste resultat er: blot tid, 7 sekunder; blot offset, 0, dreneringstid, en sek; temperatur, 22 ° C og fuktighet, 100%.
- Overfør den frosne hydrert rutenettet til en cryoEM holder for umiddelbar cryoET bildebehandling, eller til en flytende nitrogen oppbevaring dewar for senere bruk.
4. Cryo-fluorescens lysmikroskopi
En hjemme-bygget, Cryo-fluorescens prøven kammer og scene system (figur 3) er nødvendig for å utføre trinnene 04.01 til 04.10. De detaljerte spesifikasjoner og beskrivelse av scenen kan bli funnet i juni et al. 15..
- Fyll en selv-trykksatt flytende nitrogen Dewar med flytende nitrogen i minst 2 timer før start Cryo-fluorescens lysmikroskopi (se figur 3a).
- Monter en homebuilt Cryo-fluorescence prøven trinn 15 (figur 3) på en invertert fluorescens lysmikroskop, slik som et Olympus 71. IX.
- Koble flytende nitrogen innløpet til Cryo-prøven scenen til selv-trykksatte dewar og plassere det flytende nitrogen overløpsikring utløp i en egnet beholder. Koble en tørr nitrogengass linje til en hylse plassert over objektivet for å holde linsen varm og fri for frost.
- Plasser en kobber blokk plattform (svart pil i figur 3b) i Cryo-scenen kammer for lasting av frossen hydrert prøve rutenett. Avkjøl og fyll kobber kammer av kryo-fasen med flytende nitrogen gjennom innløpet linje fra selv-trykksatt fylling Dewar.
- Når Cryo-scenen når flytende nitrogen temperatur (i ~ 4-6 min), overføre grid oppbevaringsboks (fra trinn 3.5) til Cryo-scenen.
- Plasser den frosne hydrert prøve rutenett i EM prøven kassetten på kobber blokk og klippet gkvitt på plass ved hjelp av en C-ring (hvis du bruker en Polara mikroskop patron), eller plassere en forhånds-avkjølte kobber ring på toppen (svart pilspiss i figur 3d), for å holde nettet på plass, og også for enkel gjenfinning av nettet etter Cryo-fluorescens imaging (hvis for en ikke-Polara Cryo-elektron mikroskop).
- Plassere kassetten (fra trinn 4.6) i det indre kammer av kryo-trinn (hvitt pilhode i figur 3b).
- Søk og finn de samme viruspartikler fra live-cell imaging data. Siden EM rutenettet har en indeks, er det enkelt å lokalisere den samme partikkel på rutenettet i både levende celle bilder og Cryo-florescence bilder.
- Erverve Cryo-DIC og GFP bilder på de identifiserte stillingene under Cryo-tilstand ved hjelp av et lysmikroskop med en lang arbeidsdag (2,7 til 4 mm) objektiv. I løpet av Cryo-fluorescens bildebehandling, regelmessig sjekke flytende nitrogen nivå i Cryo-scenen og fylle den etter behov, for å holde prøven scenen under -170° C.
- Ved ferdigstillelse av Cryo-fluorescens bildebehandling, forsiktig tilbake prøven kassetten til kobber blokk plattform og lagre kassetten i en flytende nitrogen dewar for fremtidig cryoET analyse med en Polara system. Hvis du bruker et ikke-Polara Cryo-elektronmikroskop, fjerne kobber ring, hente prøven rutenett, legg den i et rutenett oppbevaringsboks, og oppbevar prøven i en flytende nitrogen dewar inntil prøven er undersøkt av cryoET.
- For dataanalyse, overlapper de oppkjøpte Cryo-DIC og GFP bilder (fra trinn 4.9, se figur 4b) og relatere posisjonene til de GFP signaler i Cryo-fluorescens bilde med de som ble oppnådd i live-cell imaging-serien.
5. Cryo-elektron tomografi
- Laste prøven kassetten inn i Cryo-overføring stasjon av et elektronmikroskop utstyrt med et felt utslipp pistol, for eksempel Polara G2 mikroskop.
- Under lavdose-søkemodus ved en forstørrelse på 140X, vederbukntify og lagre de tilknyttede grid ruter (fra trinn 4.11) i en scene fil.
- Under lavdose-søkemodus ved en forstørrelse på 3500 X, sette inn en 100 mikrometer objektiv blenderåpning, søk og lagre alle posisjonene korrelert med GFP signaler inn i en andre fase fil.
- Under lavdose-eksponering modus, finne et tomt område å justere intensitet på lysstrålen til en dose på 1 eller 2 e - / Å 2 og avgrense tilt aksen, bruker scenen y funksjon, ved å brenne bort isen i en uviktig karbon region med flere gull perler.
- Under lavdose-fokus-modus, stille fokus avstand til ~ 3 mikrometer og justere vinkelen for å justere retning av fokus til å være parallell med tilt aksen.
- Under lavdose-søkemodus, hente frem lagrede stillinger (fra trinn 5.3), justere prøven eucentric høyde og sjekk vippområde for det aktuelle området. Erverve en projeksjon bilde med svært lav elektron-dose (~ en e - / Å 2) på 8 til 10 mikrometer defokus, i exposure-modus, for å stadfeste korrelerte viruspartikler for Cryo-elektron tomografi.
- Bytt til lavdose-fokus modus. I TEM auto funksjoner meny, gå forut for automatisert eucentric høyde og fokusere funksjoner på fokusområdet.
- Sett opp parameterne for å anskaffe en tilt-serien. For figur 4 i denne utredningen, vinkler spenner ± 70 °, under og over 45 °, på 3 ° og 2 ° steg tilt, henholdsvis, ble brukt, med en seks mikrometer defokus og ca 70 e - / Å 2 total dose.
- Gjenta trinn 5.7 og 5.8 for alle de lagrede stillinger. Batch tomografi programvare kan bli brukt til automatisk datafangst ved flere posisjoner for å øke gjennomstrømningen.
6. Tredimensjonal rekonstruksjon ved hjelp imod 17
- Inspiser rå tilt serien å justere minimum og maksimum tetthet verdier og finne ut om det er noen utsikt til å bli ekskludert på grunn av stort bilde skift.
- Begynn eTomo og oppsett tomogram panel hjelp aksen type, pixel størrelse, fiducial diameter, etc. Deretter opprette com skript.
- Konfigurer hovedvinduet slik at flere stadier av tomogram beregning kan justeres / følges samtidig. Endre de nødvendige parametrene og utføre spesifikke programmer som kreves av hver behandling trinn (Se eTomo opplæringen, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
- På den siste etappen, lage en full linje stack (med en gjennomsnittlig gjenværende feil mindre enn 0,6) og rekonstruere tomografi ved hjelp av en vektet back-projeksjon algoritme i imod.
- Denoise potensielle områder av interesse ved hjelp av en 3D-lineær anisotrop diffusjon kanten styrke program implementert i imod med riktige parametere for å øke kontrasten og klarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å karakterisere den dynamiske oppførselen til viruspartikler, ble Jakten celler infisert med HIV-1 fotografert av high-speed konfokal live-cell mikroskopi og partikkel bevegelsene ble analysert ved automatisert 3D partikkel sporing (figur 1). For å unngå tidsforløp av flere minutter som kan oppstå mellom oppsamling av siste konfokal levende celle bilde og dykk-frysing (som kan være lang nok til å miste korrelert HIV-1 partikler), et kryo-fluorescens lysmikroskopi stadium (figur 3 ) ble designet og bygget for imaging frossen-hydrert prøver 15, innen cryoEM patroner, på lysmikroskoper. En kobber blokk plattform (3b figur, svart pil) og kobber ring (figur 3d, pilspiss) tilsatt for bruk med ikke-Polara elektronmikroskop. Korrelasjon mellom confocal live-cell, Cryo-fluorescens lysmikroskopi, og cryoET ble oppnådd ved hjelp indeksert gull Quantifoil nett og 0,2 & mu , M fluorescerende latekskuler (figur 2). Til sammen viser figur 4 gjennomførbarheten av den generelle prosedyren for avansert trene seg live-cell mikroskopi og Cryo-elektron tomografi å visualisere fluorescensmerkede HIV-1 partikler i samspill med en rekke HeLa celle.
Figur 1. Time-lapse confocal live-cell avbildning av HIV-1 partikler i Jakten celler. Et enkelt grønt-fluorescerende viruspartikkelen (gul pilspiss) ble sporet i 3D konfokale stabler med en 3 min tidsintervall mellom rammer. Klikk her for å se større figur .
d/50386/50386fig2.jpg "/>
Figur 2. Korrelasjon mellom fluorescens bilder og cryoEM bilder. (A & b) Differential interferens kontrast (DIC) bilder av Jakten celler dyrket på en Quantifoil gull EM finder rutenett, innspilt med en 2X (a) og 20x (b) mål. (C) Cryo -fluorescens bilde av frossen-hydrert Jakten celler (rød farge for mitokondrier) og 0,2 mikrometer fluorescerende latex perler (grønn), innspilt med Cryo-scene og en 40X lang arbeidsavstand luft objektiv, kledde med en DIC bilde av celler. (d ) Lav forstørrelse cryoEM bilde av den tilsvarende regionen i (c). (e og f) Korrelasjon mellom fluorescens og cryoEM bilder med 0,2 mikrometer fluorescerende latekskuler. Tilsvarende perler er sirklet med samme farge. Scale barer, 200 mikrometer i en, 50 mikrometer i b, 25 mikrometer i c, d e, 5 mikrometer i f..
Figur 3. Bygging av Cryo-lysmikroskopi scenen. (A) En selvstendig trykksatt dewar, fylt med flytende nitrogen, som brukes til å kjøle ned kobber Cryo-prøven scenen (hvit pil). (B) Topp, innvendig visning av Cryo-prøven scenen , som viser det indre kammeret (hvit pilspiss). Prøven rutenett plasseres på EM prøven patron, som sitter i sentrum av en kobber-blokk (sort pil). Når lastet med prøven rutenett, patronen overføres til det indre kammeret (hvit pilhode) for kryo-fluorescens lysmikroskopi. (C og d) Prøven patronen før (c) og etter (d) plassering av en kobber ring (Black pilspiss ) for å holde nettet i stedet for å bruke med ikke-Polara Cryo-elektron microscope.
Figur 4. CryoET av et enkelt fluorescerende partikkel bundet til mobilnettet utstikket av en HeLa celle ved correlative mikroskopi. (A & b) En DIC bilde som er tatt med en Cryo-lysmikroskopi scenen (a) overlappet med en Cryo-fluorescens bilde av GFP-merket partikler (rødt) (b) (c - E). lav dose cryoEM bilder av området som inneholder en fluorescerende partikler (innringet i panel B og C) ved 140X (c), X 3500 (d) og 27 500 X (E), hhv . Innfelling, et forstørret riss tatt etter anskaffelsen av tomografisk vippe-serien (f - t). Tre 4 nm tykk tomografiske skiver atskilt med en avstand på 21 nm i z retningen. Tilkoblinger mellom partikkelen og HeLa cellemembranen er anmerketed med piler i både det projiserte bildet (innfelt i panelet e) og tomographic skiver (paneler f & g). Scale barer, 10 mikrometer i a & b, 20 mikrometer i c, 500 nm i d, og 100 nm i e - h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presentert en grei sett med protokoller for å gi en avansert samsvarende tilnærming til å analysere dynamiske cellulære hendelser ved hjelp av time-lapse confocal, live-cell fluorescens bildebehandling etterfulgt av cryoET. Vår metodeutvikling å korrelere 3D live-cell bildebehandling med høy oppløsning cryoET er kritisk å undersøke mange utfordrende biologiske problemer, for eksempel visualisere sjeldne, dynamiske (ikke statisk, som tidligere meldt), og diffraksjon begrenset viruspartikler og deres samspill med vertscellene . Den romlige og tidsmessige oppførselen til bestemte partikler i levende celler er preget av live-cell analyse og de strukturelle detaljer om virus-celle interaksjoner ved de definerte infeksjon etapper er utforsket. En hjemmelaget, Cryo-lysmikroskopi scenen brukes til å legge til rette for direkte sammenheng mellom fluorescens lys bilder fra live-celler og bilder tatt av cryoEM.
Det er flere viktige punkter å huske på iFor å få optimal datainnsamling og analyse. Først når plukke flere posisjoner for time-lapse confocal live-cell imaging, bør de valgte posisjoner være innenfor 0,5 mm fra midten av EM rutenettet, siden kanten av rutenettet forstyrrer synsfeltet for tilt-serie oppkjøp i cryoET. Videre bør cellene selektert for analyse være mellom to mitose faser, når de er mest spredt ut og flat. Derfor, de tynne regioner av celler, tilgjengelig for cryoET analyse, er på sitt mest utvidet scenen. For å ha mesteparten av dyrkede celler ved samme interfase trinnet kan cellesyklus kan synkroniseres ved hjelp av dobbel tymidin behandling som blokkerer celle-syklus ved tidlig S-fase 18.. Celler løslatt fra thymidine blokk så videre synkront gjennom G2-og mitotic fase.
Andre, som nevnt tidligere, bør tidsforsinkelsen mellom den siste rammen av konfokal bilde og cryo-fiksering av prøven bli minimert for åtillate effektiv direkte korrelasjon av dynamiske objekter. I tillegg er den planhet og integriteten av risten er kritisk for alle prosedyrer og må opprettholdes gjennom hele protokollen, spesielt når bare nett håndteres for ikke-Polara mikroskoper.
Endelig er presis og pålitelig korrelasjon mellom fluorescens bildet og elektronmikroskopi bildet, for å finne målet, som kreves for vellykket påfølgende anskaffelse av cryoET data. I en projeksjon bilde, til en lav forstørrelse, erkjennelsen av formen og retningen av en utvalgt celle og noen ganger telling hull på rutenettet er nødvendig for å lokalisere de korrelerte region i EM-feltet. Fluorescerende latekskuler er lagt til utvalget for en mer robust og nøyaktig korrelasjon. Ved hjelp av fluoriserende latekskuler eller Quantum prikker, som er både fluoriserende og elektron-tett, kan koordinatene for målet i fluorescens bilde overføres direkte til EM for en presis lokalisering. Det Should bemerkes at emisjonsbølgelengde på fluorescerende latekskuler eller kvanteprikker er valgt ikke å ha overlapping med emisjonsbølgelengde på målet.
Vår nåværende korrelasjon satt opp for å identifisere et målområde foregår utenfor et kryo-elektronmikroskop, således som involverer en ytterligere prøve overføring trinn fra et optisk mikroskop i et elektronmikroskop. En mer direkte og grei metode har blitt tenkt ut 19, ved å installere en fluorescent avbildning apparat innenfor elektronmikroskop. I tillegg er den oppløsning som gis ved en lang arbeidsavstand luft objektiv med NA på 0,6 begrenset (~ 0,6 mikrometer). Presis og nøyaktig nanoskala eneste molekyl lokalisering i 3D mobilnettet tomografi vil videre innebære super oppløsning mikroskopi å korrelere fluorescerende merket proteiner i ultrastructure.
Ytterligere fremskritt i correlative lysmikroskopi og cryoET forventes ved å kombinere flere techniques som Cryo-fokusert ion stråle (FIB) fresing 9,20 og glasslegemet seksjonering 8 av frossen-hydrert prøver. Disse teknikkene overvinne begrensninger av prøvestykket tykkelse, sterkt utvide utvalget av prøvene mottagelig for cryoET analyse, noe som tillater undersøkelse av virale partikler som har reist dypt inne i cellene. Når det gjelder studiet av viruspartikkelen interaksjoner med vertscellen faktorer, ytterligere dobbelt merking av spesifikke cellulære proteiner og HIV-1-kjerner med en tetra-Cystein fluorescens sonde fusjonert til HIV-1 CA kunne lette identifiseringen av bestemte tidlige stadier av HIV-1 livssyklus og romlig og funksjonell forholdet mellom vert faktorer og virale partikler. Vi forventer trene seg 3D live-cell bildebehandling og cryoET metodikk for å spille viktige roller i studien cellesignalisering, membran reseptor menneskehandel, og mange andre dynamiske cellulære prosesser i cellebiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Travis Wheeler og maskinen butikken ved Institutt for cellebiologi og fysiologi, Universitetet i Pittsburgh for byggingen av Cryo-fluorescens prøven scenen, Changlu Tao og Cheng Xu ved University of Science and Technology i Kina for teknisk assistanse, og Dr. Teresa Brosenitsch for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (GM082251 & GM085043).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. | |
References
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
