Summary
Это видео иллюстрирует статью настройки, процедуры, чтобы исправить клеточных тел и, как реализовать динамические записи зажим из ганглиозных клеток в целом монтажа сетчатки мыши. Этот метод позволяет исследовать точное вклад возбуждающих и тормозных синаптических входов, и их относительная величина и сроки нейронов пики.
Abstract
Ганглий клетки являются выходными нейронами сетчатки и их деятельность отражает интеграцию различных синаптических входов, вытекающих из конкретных нейронных цепей. Патч зажим методы, в напряжении зажим и зажим текущих конфигураций, которые обычно используются для изучения физиологических свойств нейронов и характеризуют их синаптических входов. Хотя применение этих методов является весьма информативным, они представляют различные ограничения. Например, трудно количественно как точное взаимодействие возбуждающих и тормозящих входов определения выходного отклика. Для решения этого вопроса мы использовали модифицированную технику текущего зажим, зажим динамической, которая также называется проводимостью 1 зажим, 2, 3 и изучили влияние возбуждающих и тормозных синаптических входов на возбудимость нейронов. Этот метод требует введения ток в клетку и зависит от реального времени обратной связи ее мембранный потенциал в то время. Или введенныхD Текущее рассчитывается по заданной возбуждающих и тормозных синаптических проводимостей, их потенциалы разворот и мгновенная мембранного потенциала клетки. Подробности на экспериментальные процедуры, фиксации потенциала клетки для достижения цельноклеточная конфигурации и занятости метод динамического зажим показано на этом видео статье. Здесь показана реакции мыши ганглиозных клеток сетчатки к различным проводимость сигналов, полученных из физиологических экспериментов в контрольных условиях или в присутствии препаратов. Кроме того, мы покажем использование искусственных возбуждающих и тормозящих проводимость генерируется с использованием альфа-функции для исследования реакции клеток.
Introduction
Сетчатка почти прозрачной нервной ткани, выстилающие задней части глаза. Многие исследования сетчатки использовать как модель для изучения первых шагов в обработке зрительной и механизмы синаптической сигнализации. Поскольку сетчатки сети в целом монтажа препарат остается неизменным после вскрытия, он представляет собой идеальную системы для изучения синаптических взаимодействий как его физиологические реакции очень похожи в естественных условиях. Таким образом, в изолированной сетчатки свойства его нейроны могут быть исследованы с помощью методов патч зажим (по отзывам на технике, см. 6,9,13). Идентификация точной вклада отдельных схем и нейротрансмиттеров ганглий-клеточный ответ, однако, как правило, препятствуют в качестве фармакологических агентов выступают на различных участках.
Физиологические реакции нейронов сетчатки к свету, натуральный раздражитель, могут быть записаны со стеклянной пипетки заполнены внутриклеточной жидкости. Использование патча CLусилитель методы, нейронные ответы на световое раздражение может быть записана как колебания мембранного потенциала (токовые клещи) или в виде токов (напряжения зажим). Путем проведения мембранного потенциала при различных напряжениях и реализации апостериорного анализа проводимости, можно изолировать тормозных и возбуждающих синаптических входов 5,12. Этот тип эксперименты можно проводить в нормальной среде купание и в присутствии различных фармакологических агентов, чтобы изолировать вклад различных нейротрансмиттеров и рецепторов нейронов ответов. Множество исследований из многих лабораторий характеризуется зависимость пики производства и возбуждающих и тормозных входов на стимул свойства, такие как размер, контрастность, пространственных и временных частот, направление ориентации и другие переменные стимула. Хотя эти экспериментальные подходы предоставить информацию об отношениях между всплеск производства и синаптические входы в зависимости от свойств стимула,Интерпретация вклада специфических типов клеток и их синаптических входов возбудимости клеток не совсем просто. Это связано с тем, что обычно возбуждающие и подавляющие входов зависит стимул свойства и, таким образом, это не возможно оценить точное влияние, что изменения в любом из этих входов имеет на нейронную пики.
Альтернативный подход, чтобы обойти эти ограничения, осуществлять динамическое зажим записи, которые позволяют критически оценить вклад отдельных синаптических входов пики выхода. Динамический метод зажима обеспечивает прямое впрыскивание текущего в камеру и количество ток, подаваемый в данный момент времени, зависит от записанных мембранного потенциала в то время 1,2,3 (для обзора см. 7,14). Это изменение текущей зажим настройки, где в режиме реального времени, быстрое взаимодействие обратной связи между клеткой при записи и устройство, содержащее специализированные аппаратные средства, программное обеспечениеи компьютер достигнута. Величина тока, введенный в клетку вычисляется соответственно. Таким образом, преимуществом этого метода является то, что клетки могут быть стимулированы с различными комбинациями проводимость сигналов, и его ответ будет имитировать активации рецепторов, которые опосредуют синаптических входов. Например, сравнение ответ на инъекцию возбуждающих и тормозящих проводимость для небольшого места с ответом на инъекцию возбуждающих проводимости для небольшого места только предоставляет информацию о влиянии ингибирование клеточного ответа. Аналогичным образом, другие комбинации физиологически записаны проводимостей могут быть совместно вводили чтобы показать, как стимул-зависимые изменения в возбуждающих и / или ингибирующим проводимость влияют шип выход.
В нашем исследовании, метод динамического зажим используется для демонстрации влияния относительной амплитуды и времени синаптических входов на огневом свойства ганглиозных клеток сетчатки. Различные проводимостиполученные из физиологической экспериментов в контрольных условиях или в присутствии фармакологических агентов были использованы в качестве входных данных. Кроме того, искусственное проводимости на основе альфа-функции также были использованы для того, чтобы исследовать, как синаптические входы интегрируются нейронов. Таким образом, это универсальный метод, который позволяет различные типы проводимости генерироваться как физиологически, фармакологически или вычислительно, который будет введен в ту же клетку ганглия, так что сравнение ответов на эти входы могут быть сделаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Генеральный Настройка и Приготовление тканей
- Держите мышь в темноте в течение 30 мин (направлены на снижение ее уровня стресса). Ожидая, подготовить 1 л внеклеточной решение. Первая растворить 1,9 г бикарбоната натрия в половине литра Milli-Q воды. Ее рН поддерживается на уровне 7,4 путем пропускания с 95% O 2 и 5% CO 2. Через пять минут, растворить 8,8 г среды Эймса в 100 мл Milli-Q воды, добавить в раствор бикарбоната натрия, долить до 1 л Milli-Q воды и хорошо перемешать. Хранить этот раствор carboxygenated для остальной части эксперимента.
- Возьмите 250 мл carboxygenated Средний Ames и настроить систему жидкости реперфузии в электрофизиологических установки. Держите решение carboxygenated.
- Равномерно намазать тонким слоем вакуумной смазки на дно перфузии камеры. Скрепите покровного стекла и убедитесь, что он герметичен. Возьмите небольшое количество смазки (~ 2 мм в диаметре) и поместите его на верхнюю иНижние концы камеры. Эти шары проведет сетки (платина рамка с нанизанными на нитку для чистки зубов) на месте и не допустить его чрезмерного давления на сетчатке. Закрепите камеру на платформу и выровнять оба отверстия.
- Животное первый анестезировали изофлуран в течение 2 мин, а затем умерщвляли смещением шейных позвонков. Быстрое удаление глаза с парой небольших ножниц (лопатками), тщательно промойте carboxygenated внеклеточной жидкости в небольшой стакан, а затем поместить в чашку Петри с carboxygenated внеклеточной жидкости.
- Под рассекает микроскоп, сделать установочное отверстие в роговице (~ 2 мм от края) с использованием 19 иглы. Повторите эти действия для другого глаза. Этот важный шаг должен быть быстрым, чтобы позволить оксигенации как сетчатка. Удалите один роговицы с небольшой парой ножниц радужной оболочки за счет сокращения параллельно его краю. Затем удалите радужной оболочки и линзы с пинцета. Повторите эти действия для другого глаза. Передача одного глаза чашку в стакан, содержащийcarboxygenated внеклеточной решение.
- С лезвие скальпеля, вырезать один глаз чашку пополам, чтобы быть в состоянии сгладить целом монтажа и получить целых два-крепления на сетчатке. Осторожно отделите сетчатки от пигментного эпителия при помощи тупого зонда или рассечения, осторожно потянув его. Как только отдельно, сетчатка достаточно прозрачна. Обратите внимание на выпуклой поверхности фоторецепторов стороны. Вогнутая поверхность боковой ганглиозных клеток и может прилипать к себе благодаря наличию липких стекловидное тело.
- С парой тонких щипцов, возьмитесь за край отдельных сетчатки близко ткани Ora Serrata и захватить Ora Serrata с другой парой тонких щипцов, потяните его по направлению к центру сетчатки. Это тонкий процесс и может занять несколько попыток. В случае успеха, ора Серрата, цилиарное тело и стекловидного тела удаляются в результате этого процесса, и кривизна сетчатке уменьшается (то есть плоский).
- Обрезать края, а затем передать его вкамеры для слияния с ганглиозных клеток вверх. Держа ткани в месте размещения сетки на смазку шаров. Поместите оставшиеся ткани с другой чашкой глаз для последующего использования. Аналогичные процедуры для сетчатки рассечение описаны в Мидлтон и Протти 16 и Pottek соавт. 17.
- Установите записи камеры под прямой микроскоп. Немедленно создало непрерывной перфузии сетчатки с carboxygenated внеклеточной решение (35,5 ° C) в размере 3 - 5 мл / мин. Убедитесь, что заземляющий электрод на месте.
- В приложении к Микроскоп цифровой камеры и возможности визуализации ткани. Целый набор находится над таблицей воздуха (амортизация), так и внутри клетки Фарадея (блоки внешнего статического и не статические электрические поля).
- Включите источник света (инфракрасный,> 850 нм) и объектив 40Х, привести свое внимание на клеточных тел ганглиозных клеток. Найти центральной площади всего-крепление для RecorДин.
- Размораживание замороженной пробирке К + на основе внутриклеточный раствор (300 мкл, рН 7,4), содержащий (в мМ) K-глюконат: 140, HEPES кислота: 10, MgCl 2: 4,6, АТФ-Na +: 4, ГТФ-Na + : 0,4 и ЭГТА: 10. Все реагенты приобретены у Sigma-Aldrich.
2. Исправление клеточных тел ганглиозных клеток сетчатки
- Первый пожар полировать концы боросиликатного стекла капиллярной трубки, затем потяните их при помощи съемника стекла Микроэлектродные с двумя ступени нагрева (сопротивление: 5 - 8 МОм).
- Добавить 3 мкл Люцифер Желтый (конечная концентрация 0,2%) с внутриклеточным решение, хорошо перемешать, и центрифуги его. Далее, передача верхний 85% раствор в шприц емкостью 1 мл, подключите его к 0,22 мкм ILTER блока F, а затем в 30 G многоразовый шприц для подкожных инъекций. Охладите.
- Закрепите стеклянную пипетку, такого же размера чаевых, поскольку те, которые используются для записи, в держатель и переместите его под микроскопом, используя micromanipulaTor. Под объектив 40Х, медленно снизить пипетки, пока он не делает небольшой углубление на поверхности внутренней ограничивающей мембраны. Тщательно продвижения пипетки вперед, пока он не поймает небольшое количество ткани, а затем переместить его вверх и / или в сторону, чтобы оторвать небольшое отверстие, чтобы разоблачить клеточных тел ганглиозных клеток. Чем меньше отверстие, тем выше степень целостности сетчатки сети сохраняется. При желании сульфородамина 101 (SR101, 0,5 - 1 мкм) могут быть добавлены к внеклеточной среде для обозначения поврежденных нейронов с помощью флуоресцентной микроскопии 15.
- Заполнение чистой пипетки с 8 - 10 мкл внутриклеточного раствора. Вставьте ее в держатель крепится к голове этап усилителя и убедитесь, что хлорированная электрод хлорида серебра погружен в воду. Откажитесь, если грязь и / или пузырьков воздуха присутствует / присутствуют.
- Включите все оборудование. Мы использовали EPC 8 патч зажим усилителя контролируется PatchMaster для достижения цельноклеточная записей в напряжении Con зажимконфигурацию. Обратите внимание, что другие усилители, которые позволяют текущие записи зажим в быстром режиме также может быть использован. Применить и поддерживать положительное давление в пипетку решение. Выделите ячейку с большой клетке тела так что скорее всего это ганглиозных клеток, а не перемещенных амакринные клетки или глиальные клетки. Медленно снизить пипетки так что делает небольшое углубление на поверхности мембраны, остановки и сброса давления. Немедленно снизить потенциал для проведения - 60 мВ. После gigaseal (ГОм) достигается между ними, осторожно сосать разорвать мембраны для достижения цельноклеточной патч зажим конфигурации. Эта процедура представляет собой тонкий шаг, если слишком много отрицательное давление, то связь становится вытекающей, а если слишком мало, мембрана остается неповрежденной.
- Со временем, Люцифер Желтый наполнит клетки, позволяя визуализации морфологии клетки. Если стабильно, эта установка должна длиться 30 минут или больше.
3. Записи ганглиозных клеток Использование DynamiC зажим
- Во-первых, ток-напряжение теста (от - 75 до + 35 мВ каждые 10 мВ) выполняется с использованием PatchMaster. Перейдите к более последние испытания, только если большое Na + ток (> 1 нА) присутствует. Отметим, что в тех редких случаях, где перемещенные ячейки амакринные пропатчена, в таком случае, не будет реагировать с поездами потенциалов действия в последующих текущих инъекций.
- Открытое LabVIEW и выполнить обычай письменных Neuroakuma программы, а затем загрузить различные проводимости сигналов. Установите количество повторений до 8 (6 - 8 для статистических целей). Установить разворот потенциалов возбуждающих и тормозящих проводимости при 0 и - 75 мВ соответственно. Выберите одну подходящую пару возбуждающих и тормозящих проводимость для тестирования. Возбуждающие след проводимости (в зеленом) и тормозного следа проводимости (в красном) появится в нижней панели.
- Вернуться к PatchMaster выберите текущем режиме зажим, и сразу же включит усилитель в текущем режиме зажим «CC + Comm быстрым". Этот режим позволяет Точностьurately следить за быстрыми изменениями мембранного потенциала. Если хорошее уплотнение между мембраной и пипетки сохраняется, мало / без компенсации не требуется, в противном случае запись не будет длиться долго. В Neuroakuma, нажмите кнопку «Запись». Клеточного ответа (как правило, с фазовых взрыв потенциалов действия, рис. 1А) появится на верхней панели. Подачи тока в клетку с низкой проводимости масштабирование Во-первых, если мало / ответа не наблюдается, увеличение с небольшим шагом, пока он не производит решительного ответа. Избыточный ток инъекции может убить клетку. Как только тесты будут завершены, выбрать новую пару проводимости сигналов, повторите для всех пар физиологических и искусственных проводимости. Физиологических токов (I) вводят в реальном времени на основе:
(Т) = G отл (Т) х (V М (Т) - отл V) + G Н (Т) х (V М (Т) - V чел)
Проводимости (G в нс) может быть сиnaptic или искусственные. Возбуждающих и тормозящих сигналов синаптической проводимости были собраны из предыдущих экспериментов выполняемых Протти, Ди Марко, Хуан, Vonhoff, Нгуен и Соломона (неопубликованные результаты) в ответ на различные визуальные стимулы в контрольных условиях и в присутствии тетродотоксин (ТТХ, 1 мкм) . Искусственный проводимости сигналов были смоделированы с использованием альфа-функции. V м (в мВ) представл ет собой записанные мембранного потенциала. G и G отл чел представляют возбуждающих и тормозящих проводимость соответственно в то время как V и V отл чел представляют разворот потенциалов возбуждающих и тормозящих проводимости соответственно. Время Т в мс. Частота дискретизации 40 кГц.
Я S = I 0 (т / α) Электронная вида ɑØ
Приведенное выше уравнение представляет собой альфа функции (I 0 = максимальный ток; 1 / α = время до пика (сек -1) текущих). Время нарастания и времени спада синаптическихток диктуется α 4. Возбуждающие проводимость не изменилась в то время как задержка ингибирующих проводимость была изменена, снижая его задержкой относительно начала возбуждения (рис. 2D).
- После записи тщательно убрать пипетку так тело клетки остаются нетронутыми. Сразу зафиксировать ткани в 4% параформальдегид в течение 30 мин, а затем три 10 мин промывки 0,1 М фосфатного буфера. Охладите и выполнять окрашивание антител на следующий день или в течение недели.
4. Окрашивание антител против Люцифера Желтый Заполненные ганглиозных клеток сетчатки
- Антитела против окрашивания Lucifer желтый заполненный ганглиозных клеток при комнатной температуре (первичные анти-Lucifer Желтый IgG кролика (разведение = 1:10000) в течение пяти дней, на шестой день в течение ночи окрашивания вторичный козьих антител против кроличьего IgG (разбавление 1:500 = )). Мокрые горы сетчатки в люминесцентных Сохранение медиа. Покровного стекла и печать с ногтей Polish.
- Возьмите конфокальной картины клеточной морфологии использованием Leica Spec-II конфокальной микроскопии (рис. 1В). Наличие аксон дает подтверждение ганглиозных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вклад различных источников тормозных входов к ответам ганглиозных клеток показано, за счет применения различных проводимости сигналов. Эти сигналы были получены при различных стимулов яркости в нормальных условиях и в присутствии ТТХ, напряжения закрытого Na +-канала блокатор, который блокирует генерации потенциала действия только в подмножестве ингибирующее сетчатки интернейронов. Фиг.2А показывает характерный ответ на инъекцию возбуждающих и тормозящих сигналов проводимости записали в ответ на стимуляцию с небольшим черным пятном на сером фоне в нормальных условиях. Когда проводимость сигналов, полученных с черные пятна различного размера в присутствии ТТХ вводили в той же клетке, лишь слабый ответ наблюдался (фиг. 2В).
На фиг.2С иллюстрирует реакцию другого ганглиозных клеток к инъекции различных парпроводимость сигналов, в которых соотношение между контрольными возбуждающих и тормозных проводимость манипулировали (G отлично: G чел соотношений: от 1:0 до 1:2). Очевидно, что ответ клетки уменьшается по мере уровень ингибирования была увеличена. Таким образом, манипулируя баланс между возбуждением и торможением позволяет оценить количественно их воздействие на нейронную выход.
Мы также проверили эффект изменения относительного времени между возбуждением и торможением на нейронные ответы. Как показано на фигуре 2D, ответы различных ганглиозных клеток были снижены как задержка ингибирующего проводимость была снижена, демонстрируя, что сила реакции зависит от времени ее синаптических входов.
Рисунок 1. (A) Экспериментальная установка в схематичной форме. Цифровая камера используется для визуализации клеточных тел ганглиозных клеток для того, чтобы их патч зажим (левый монитор). Ответы каждой ячейки в различные текущие инъекции были впервые зарегистрированы, усиливаются и затем отображаются на правом мониторе. Следует отметить, что петля обратной связи также устанавливается между компьютером и клетки таким образом, что мембранный потенциал (V) ячейки в данном случае используется, чтобы вычислить ток (I), в виде инъекций. (B) Морфология ганглиозных клеток исследовали под Leica Spec-II конфокальной микроскопии после окрашивания записи и иммуноцитохимической. Окончательное изображение было получено с использованием ImageJ после рушится стек изображений. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Реакции ганглиозных клеток инъекцией возбуждающих (зеленый следы) и тормозных (красный следы) проводимость сигналов, полученных из экспериментов, проведенных в контроле условий (А) и после ванны применением тетродотоксин (ТТХ, Б). (C) Ответы другого ганглиозных клеток различных пар проводимости сигналов. Соотношения между возбуждающими проводимости (G отл) и тормозные проводимости (G чел) была изменена с 1:00 до 1:2. Так как степень ингибирования увеличивается, ответ клетки была снижена. (D) Реакции ганглиозных клеток на тот же уровень возбуждения, в котором начала торможения различны. Δt представляет разницу во времени между началом тормозных и возбуждающих проводимости. Поскольку задержка ингибирование была снижена, реакция тон стал клетки слабее. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь показано использование динамического зажим, чтобы оценить влияние соотношения и относительной синхронизации возбуждения и торможения на выходе сетчатки ганглиозных клеток. Динамический зажим использует компьютерное моделирование, чтобы ввести физиологически записанных или искусственного синаптической проводимости в живые нейроны. Эта методика обеспечивает интерактивный инструмент, посредством которого проводимости может быть изменен и вводят в нейронах для вычисления их влияния на нейронных ответов. Проводимость сигналы могут быть получены из экспериментов, в которых визуальные стимулы используются для активизации фоторецепторов в контрольных условиях и в присутствии фармакологических агентов, чтобы изолировать вклад конкретной ячейке или в схемах. Инъекция различные комбинации этих сигналов проводимости показывает их вклад в пики выхода. Использование динамических записей зажим также осуществлять манипуляции уровни фоновых шумов, которые могут иметь место при различных световых адаптации Conditio нс. Кроме того, проводимость сигналов также могут быть получены из модели синаптических входов, такие как альфа-функций, а также для синаптических входов с напряжением зависимость (т.е. NMDA-рецепторов), а также для напряжения закрытого ионных каналов или электрически соединены клеток. Таким образом, сравнение между различными условиями открывают огромные возможности для понимания вклада различных синаптических механизмов нейронных ответов и обработки сигналов в нейронных сетях. Важно отметить, что даже тогда, когда различные типы ганглий клетки экспрессируют заметно различных типов и плотности напряжения закрытого канала, мы обнаружили, что результаты интеграции синаптической проводимости были последовательно через типах клеток. Таким образом, изменения в соотношении и времени возбуждающих и тормозных проводимости были аналогичным образом отражено в ответах хотя всплеск частоты между шип интервалы и адаптации свойства варьироваться в зависимости от типа клеток (данные не показаны).
ove_content "> Хотя динамические зажим имеет много преимуществ, есть некоторые ограничения, присущие технике (см. обзор 7). основным является то, что проводимость инъекции в Сома может не совсем точно представляют синаптические входы опосредовано рецепторами и каналы, которые специально распределенных вдоль мембраны дендритных процессов и любой нелинейной взаимодействий, которые могут произойти в дендритов. Таким образом, проводимость дистально от места инъекции могут быть смоделированы лишь приблизительно. Хотя динамический зажим был успешно применен к дендритов в пирамидальных клетках делать четверной цельного ячейки записи 8, морфологическая сложность процессов ганглий дендритных клеток исключает реалистичное моделирование пространственного распределения синапсов, делая дендритных записей. Изложенный здесь подход использует проводимость сигналов компьютерной из соматических напряжения зажим эксперименты, которые также зависят от точечного источника электрода и предполагает линейное взаимодействие между возбужденнойAtory и тормозящих входов, предположение широкое признание в обществе. Таким образом, эти исследования дают важную информацию о влиянии изменений в синаптической проводимости на нейронную интеграции на уровне сомы и аксонов холмик.Наши эксперименты не копируют физиологических реакций, что также нанимать напряжения закрытого проводимости в дендриты ганглиозных клеток. Это, однако, может быть также осуществлена путем модификации уравнений модели таким образом, что ток, подаваемый включать дендритных проводимости и кабель эффектов, основанных на нескольких отсеков модели (как описано в разделе 7).
Еще одним ограничением является то, что деятельность-зависимые изменения, которые изменяют ответ нейронов, то есть изменения внутриклеточного кальция или вторичных мессенджеров вызвана активацией мембранных каналов или рецепторов, не воспроизводятся в этих динамических записей зажима. Хотя наша модель не иметь дело с этим уровнем сложности, которые могут быть сpecific для некоторых типов клеток, моделирование с участием бассейн кальция и приток кальция в этом пуле в реальном времени на основе напряжения колебаний записанных нейронов были успешно реализованы 10.
Даже при том, частотой дискретизации 10 кГц будет точно следовать временной ход потенциалов действия, наши записи вместо этого использовал частоту дискретизации 40 кГц. Эта более высокая частота дискретизации, необходимые для поддержания стабильности в системе и позволяют реалистично и высокоточные записей (см. обзор 11).
Экспериментальный подход, описанный здесь, не требует, чтобы держать сетчатки адаптированных к темноте. Проводимость сигналов, полученных из темно-адаптированных сетчатки в физиологических условиях были использованы для вычисления текущей который будет введен в клетку, в этом случае ток, подаваемый имитировали физиологическую стимуляцию светом. Тем не менее, он все равно будет возможно поддерживать ткани темно-адаптированный и, таким образом, быть в состоянии сompare ответов на проводимость инъекций с теми, на световую стимуляцию. В этом случае, физиологические свойства ганглиозных клеток (ответ полярности, т.е. ВКЛ, ВЫКЛ или ВКЛ-ВЫКЛ, пространственной и временной частоты чувствительности направлении селективность и т.д.) могут быть классифицированы перед применением различных проводимость сигналов для оценки или нет инъекций проводимостей от конкретного типа клеток имеет разные последствия в зависимости от типа клеток они применяются.
В целом мы считаем, что динамические зажим представляет собой очень мощный метод, чтобы помочь раскрыть взаимодействие между возбуждающих и тормозных синаптических входов нейронов, которые генерируют выходной, исследовать роль различных напряжения закрытого проводимость в нейронах, а также для проверки гипотез о механизмах синаптической . Применение этого метода в сетчатке является особенно полезным, так как синаптических входов на несколько типов ганглиозных клеток были полностью характеризоватьг в зависимости от физиологического стимула. Кроме того, этот подход может дать представление о функции нейронных цепей в других областях центральной нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все процедуры были впервые одобрен Animal Care комитета по этике в Университете Сиднея, а затем выполняется в соответствии с руководящими принципами Австралийским Кодекс практики по уходу и использованию животных в научных целях (национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии ).
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке Австралийского исследовательского совета (АРК DP0988227) и медико-биологических наук Research Initiative Грант от дисциплины медико-биологических наук, Университет Сиднея. Зажим заплата оборудования усилитель EPC 8 был профинансирован фондом Startup от дисциплины медико-биологических наук, Университет Сиднея. Оборудование InstruTech LIH 8 +8 система сбора данных была приобретена на средства от Rebecca L. Cooper фонда и фонда Startup от дисциплины медико-биологических наук, Университет Сиднея. Мы хотели бы поблагодарить рецензентов за их проницательные предложения и замечания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Micr–lectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation | ||
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -S. Foundations of cellular neurophysiology. , The MIT Press. London. (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).
- Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
