Summary
Denna video artikeln illustrerar set-up, förfaranden för att lappa cell organ och hur att genomföra dynamiska clamp inspelningar från ganglion celler i hela montera mus retinae. Denna teknik gör det möjligt att utreda den exakta bidrag retande och hämmande synaptiska ingångar, och deras relativa storlek och timing till neuronal spiking.
Abstract
Ganglionceller är de utgående nervceller i näthinnan och deras aktivitet återspeglar integrering av flera synaptiska inmatningar som rör specifika neurala kretsar. Patch clamp teknik, i spänningsklämma och aktuella konfigurationer klämma, används ofta för att studera de fysiologiska egenskaperna hos nervceller och att karaktärisera sina synaptiska ingångar. Även om tillämpning av dessa tekniker är mycket informativ, utgör de olika begränsningar. Till exempel är det svårt att kvantifiera hur de exakta samspelet mellan retande och hämmande insatsvaror bestämmer svar utgång. För att lösa detta har vi använt en modifierad strömtång teknik, dynamisk klämma, även kallad konduktans klämma 1, 2, 3 och undersökt effekterna av excitatoriska och inhibitoriska synaptiska ingångar på neuronala retbarhet. Denna teknik kräver injektion av ström in i cellen och är beroende av den feedback i realtid av sin membranpotential vid den tidpunkten. Den injected ström beräknas från förutbestämda retande och hämmande synaptiska konduktanser, deras potentialer återföring och cellens momentana membran potential. Detaljer om de experimentella procedurer, patch fastspänning celler för att uppnå en hel-cell konfiguration och sysselsättning av den dynamiska klämman tekniken illustreras i denna video artikeln. Här visar vi svaren från mus näthinneganglieceller till olika konduktans vågformer erhållna från fysiologiska experiment kontrollbetingelser eller i närvaro av droger. Dessutom visar vi användning av artificiella retande och hämmande konduktanser genererats med alfa-funktioner för att undersöka svaren i cellerna.
Introduction
Näthinnan är en nästan transparent nervvävnad foder baksidan av ögat. Många studier använder näthinnan som modell för att undersöka de första stegen i visuell bearbetning och mekanismer synaptiska signaleringen. Eftersom den retinal nätverket i hela montera beredning förblir intakt efter dissektion, innebär det ett idealiskt system för att studera synaptiska interaktioner som dess fysiologiska reaktioner är mycket lik den in vivo-betingelser. Således, med hjälp av en isolerad näthinnan egenskaper dess nervceller kan studeras med hjälp av tekniker patch clamp (för omdömen på tekniken, se 6,9,13). Identifiering av det exakta bidraget av specifika kretsar och signalsubstanser gangliecell svar, dock brukar hindras som farmakologiska medel verkar på olika platser.
Fysiologiska reaktioner av näthinnans nervceller för ljus, den naturliga stimulans, kan spelas in med glaspipetter fyllda med intracellulär vätska. Använda patch clamp tekniker, neuronala svar på ljus stimulering kan registreras som membran potentiella fluktuationer (strömtång) eller som strömmar (spänningsklämma). Genom att hålla membranet potentialen vid olika spänningar och genomföra en posteriori konduktans analys, är det möjligt att isolera hämmande och excitatoriska synaptiska ingångar 5,12. Denna typ av försök kan utföras i normalt badmedium och i närvaro av olika farmakologiska medel för att isolera bidraget från de olika neurotransmittorer och receptorer till neuronala responser. En uppsjö av studier från många laboratorier kännetecknas beroendet av tillsatta produktion och retande och hämmande ingångarna på stimulans egenskaper såsom storlek, kontrast, rumsliga och tidsmässiga frekvenser, riktning, orientering och andra variabler stimulanser. Även om dessa experimentella metoder ger information om förhållandet mellan spik produktion och synaptiska ingångar som en funktion av stimulans fastigheter,tolkning av bidraget av specifika celltyper och deras synaptiska ingångar till cellen retbarhet är inte okomplicerat. Detta beror på det faktum att vanligtvis både retande och hämmande insatsvaror varierar med stimulansåtgärder egenskaper och därmed är det inte möjligt att bedöma den exakta påverkan som förändringar i någon av dessa ingångar har på neuronal spiking.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att kringgå dessa begränsningar är att utföra dynamiska clamp inspelningar, som möjliggör en kritisk utvärdering av bidragen till enskilda synaptiska ingångar till spiking utgång. Den dynamiska clamp teknik möjliggör direkt injektion av strömmen i cellen och mängden ström som matas vid en given tidpunkt beror på den inspelade membran potential på den tiden 1,2,3 (för översikt se 7,14). Det är en modifierad strömtång set-up där en realtid, snabba återkopplingskanalen växelverkan mellan cellen under inspelning och den utrustning som omfattar specialiserad hårdvara, mjukvaraoch en dator uppnås. Mängden ström som matas in i cellen beräknas i enlighet därmed. Följaktligen är fördelen med denna metod att cellen kan stimuleras med olika kombinationer av konduktans vågformer, och dess svar kommer att efterlikna aktivering av receptorer som medierar synaptiska inmatningar. Till exempel ger jämförelse av svaret på injektion av retande och hämmande konduktanser för en liten fläck med svaret till injektion av excitatoriska konduktans för en liten fläck bara information om hur hämning av cellens respons. Likaså kan andra kombinationer av fysiologiskt inspelade konduktanser vara co-injiceras för att avslöja hur stimulus-beroende förändringar av excitatoriska och / eller hämmande konduktanser påverkar spik utgång.
I vår studie, är den dynamiska klämman teknik som används för att visa på effekten av den relativa amplituden och timingen av synaptiska ingångar på skottlossningen egenskaper näthinneganglieceller. Olika konduktansererhållits från fysiologiska experiment i kontrollbetingelser eller i närvaro av farmakologiska medel användes som indata. Dessutom har artificiella konduktanser baserade på alfa-funktioner även användas för att undersöka hur synaptiska ingångar integreras av nervceller. Således är detta en mångsidig teknik som tillåter olika typer av konduktans antingen genereras fysiologiskt, farmakologiskt eller beräkningsmässigt att injiceras i samma ganglion cell, så kan jämförelse av svar på dessa insignaler göras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. General Set Up och Vävnadsberedning
- Håll musen i mörker under 30 minuter (syftar till att minska sin stress nivå). Medan du väntar, bereda 1 liter extracellulära lösning. Först upplösa 1,9 g natriumbikarbonat i en halv liter av Milli-Q-vatten. Dess pH-värdet hålles vid 7,4 genom att bubbla med 95% O2 och 5% CO2. Fem minuter senare, Lös 8,8 g Ames Medium i 100 ml Milli-Q-vatten, lägg till natriumbikarbonatlösning, fyll till 1 L med Milli-Q-vatten och blanda väl. Förvara lösningen carboxygenated för resten av experimentet.
- Ta 250 ml av carboxygenated Ames Medium och ställa in systemet vätska reperfusion i elektrofysiologiska set-up. Förvara lösningen carboxygenated.
- Enhetligt smeta ett tunt skikt av vakuum fett på botten av perfusionskammaren. Försegla den med ett täckglas och kontrollera att den är tät. Ta en liten mängd fett (~ 2 mm i diameter) och placera den på toppen ochbottenändarna av kammaren. Dessa bollar håller gallret (platina ram uppträdda med tandtråd) på plats och förhindra att det trycker för hårt på näthinnan. Fäst kammaren på plattformen och rikta båda öppningarna.
- Djuret är först bedövades med isofluran under 2 min, och sedan genom cervikal dislokation. Snabbt bort ögonen med ett par små saxar (skovlar), tvätta noggrant med carboxygenated extracellulär vätska i en liten bägare, och sedan placera i en petriskål fylld med carboxygenated extracellulära vätskan.
- Under dissektionsmikroskop, göra ett införingshål i hornhinnan (~ 2 mm från kanten) med användning av en 19 gauge nål. Upprepa för det andra ögat. Detta viktiga steg bör vara snabb att möjliggöra syresättning av både retinae. Ta en hornhinna med en liten par iris sax genom att skära parallellt med dess kant. Nästa, ta iris och linsen med ett par fina tång. Upprepa för det andra ögat. Överför ett öga kopp i en bägare innehållandecarboxygenated extracellulära lösning.
- Med en skalpell blad, skär ett öga kopp i hälften, för att kunna platta hela-fäste och att få två hela-fästen per näthinnan. Separera försiktigt näthinnan från pigmentepitel med ett trubbigt dissekera sond eller genom att försiktigt dra bort det. När fristående, är näthinnan ganska transparent. Notera den konvexa ytan är fotoreceptorer sida. Den konkava ytan är ganglion celler sida och det kan fastna på sig självt på grund av närvaron av klibbiga glaskropp.
- Med ett par fina tång, hålla in kanten av den lösgjorda näthinnevävnad nära de ora serrata och ta ora serrata med ett annat par av fin pincett, dra den mot mitten av näthinnan. Detta är en känslig process och kan ta ett par försök. Om det lyckas, är ora serrata, ciliarkroppen och glaskroppen avlägsnas genom denna process, och krökningen av näthinnan minskas (dvs. plattare).
- Trimma kanterna, och sedan överföra det till perfusion kammare med ganglieceller uppåt. Hålla vävnaden på plats genom att placera gallret på smörj bollar. Placera den återstående vävnaden med det andra ögat koppen för senare användning. Liknande förfaranden för retinal dissektion beskrivs i Middleton och Protti 16 och Pottek et al. 17.
- Montera inspelningen kammaren under en upprätt mikroskop. Omedelbart ställa in kontinuerlig perfusion av näthinnan med carboxygenated extracellulära lösning (35,5 ° C) med en hastighet av 3 - 5 ml / min. Se till jordningselektroden är på plats.
- Kopplade till mikroskop är en digital kamera tillåter visualisering av vävnaden. Hela uppsättningen sitter upp ovanför en luftbord (stötdämpning) och inuti en Faradays bur (block externa statiska och icke-statiska elektriska fält).
- Sätt på ljuskällan (infrarött,> 850 nm) och med en 40X objektiv, sätta fokus på cellkropparna av ganglion celler. Hitta den centrala delen av det hela-mount för recording.
- Upptining en fryst ampull av K +-baserad intracellulär lösning (300 | il, pH = 7,4) som innehöll (i mM) K-glukonat: 140, HEPES syra: 10, MgCl2: 4,6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0.4 och EGTA: 10. Alla reagens köptes från Sigma-Aldrich.
2. Patching cellkroppar av retinal ganglion celler
- Första brand polera ändarna av borsilikat kapillär glasrör, sedan dra dem med ett glas mikroelektrod Avdragare med två värmesystem steg (motstånd: 5 - 8 Mohm).
- Tillsätt 3 | il av Lucifer Yellow (slutlig koncentration 0,2%) till den intracellulära lösningen, blanda väl, och centrifugera den. Därefter överför den översta 85% av lösningen i en 1 ml spruta, anslut den till en 0,22 um f Ilter enhet, sedan till en 30 G återanvändbar injektionsnål. Ställ i kylskåp.
- Fäst glas pipett, av samma spets storlek som de som används för inspelningar i sin hållare och flytta den i mikroskop med hjälp av en micromanipulaTor. Enligt ett 40X objektiv, sakta sänka pipetten tills det gör en liten grop på ytan av det inre begränsande membranet. Försiktigt föra pipetten framåt tills den fångar en liten mängd vävnad, och sedan flytta den uppåt och / eller i sidled för att riva ett litet hål för att exponera cellen organ av ganglion celler. Ju mindre hål, graden av integritet av näthinnans nätverket desto högre bibehålls. Om så önskas, sulforodamin 101 (SR101, 0,5-1 ^ M) kan sättas till det extracellulära mediet för att märka skadade neuroner genom att använda fluorescensmikroskopi 15.
- Fyll en ren pipett med 8 - 10 pl intracellulär lösning. Sätt in den i hållaren fäst förstärkarens huvudet scenen och se till att den klorerade silverkloridelektrod är nedsänkt. Kassera om smuts och / eller luftbubblor är / är närvarande.
- Slå på all utrustning. Vi använde ett EPC 8 förstärkare patch clamp kontrolleras av PatchMaster att uppnå hel-cell inspelningar i spänningsklämma configuration. Observera att andra förstärkare som låter strömtång inspelningar i snabbt läge kan också användas. Tillämpa och upprätthålla positiva trycket i pipetten lösningen. Markera en cell med en stor cellkropp så troligtvis är det en gangliecell snarare än ett förskjutet amakrina cell eller en gliacell. Sakta sänker pipettspetsen så den gör en liten grop på ytan av membranet, stoppa och släppa ut trycket. Omedelbart sänka hållpotential till - 60 mV. När en gigatätning (GΩ) uppnås mellan dem, försiktigt suga att bryta membranet för att uppnå en hel-cell konfiguration patch clamp. Detta förfarande är en delikat steg, om för mycket negativt tryck anbringas på anslutningen blir otät, om för lite, förblir membranet intakt.
- Med tiden kommer Lucifer Yellow fylla cellen, vilket möjliggör visualisering av cellens morfologi. Om stabil, bör denna set-up varar 30 minuter eller mer.
Tre. Inspelningar av ganglion celler Använda dynamisktc Clamp
- Först, en ström-spänning test (från - 75 till + 35 mV varje 10 mV) utförs med hjälp PatchMaster. Fortsätt till senare test endast om en stor Na + ström (> 1 nA) är närvarande. Observera att i de sällsynta tillfällen då en förskjuten amakrina cell lappas, i detta fall, inte kommer att svara med tåg av aktionspotentialer till efterföljande löpande injektioner.
- Öppna LabVIEW och exekvera anpassade skriven Neuroakuma program, ladda sedan olika konduktans vågformer. Ställ upprepa numret till 8 (6 - 8 för statistiska ändamål). Ställ återföring potential retande och hämmande konduktanser vid 0 och - 75 mV resp. Välj ett matchande par av retande och hämmande konduktanser för testning. Excitatoriska konduktans trace (i grönt) och hämmande konduktans trace (i rött) visas i den nedre panelen.
- Gå tillbaka till PatchMaster väljer strömtång läge, och omedelbart byta förstärkaren till 'CC + Comm FAST' strömtång läge. Detta läge gör det möjligt att accurately följa snabba förändringar i membranpotential. Om en bra tätning mellan membranet och pipetten bibehålls, lite / ingen kompensation behövs, annars kommer inspelningen inte länge. I Neuroakuma, tryck på "record" knappen. Den cellulära svar (oftast med en phasic explosion av aktionspotentialer, Figur 1A) kommer att visas på den övre panelen. Injicera strömmen i cellen med låga skalning av konduktanser först, om lite / inget svar observeras, öka i små steg tills den ger en stark respons. Överdriven ströminjektion kan döda cellen. När testerna är klara, väljer ett par nya konduktans vågformer, upprepa ovanstående för alla par av fysiologiska och konstgjorda konduktanser. De fysiologiska strömmar (I) injicerade i realtid är baserade på:
I (t) = G exc (t) x (V m (t) - V exc) + G inh (t) x (V m (t) - V inv)
Conductance (G i NS) skulle kunna synaptic eller artificiellt. Retande och hämmande synaptisk konduktans vågformer samlades från tidigare experiment utförda av Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen och Solomon (opublicerade resultat) som svar på olika visuella stimuli i kontroll förhållanden och i närvaro av tetrodotoxin (TTX, 1 M) . Konstgjord konduktans vågformer modellerades med en alfa-funktion. V m (i mV) är inspelade membran potential. G exc och G inv representerar retande och hämmande konduktanser respektive medan V exc och V inv representerar återföring potentialer retande och hämmande konduktanser resp. Tid är t i ms. Samplingsfrekvens är 40 kHz.
Jag s = I 0 (t / α) e-αt
Ovanstående ekvation är en alfa-funktion (I 0 = maximal ström, 1 / α = tid till topp (sek -1) för den aktuella). Stigtiden och avklingningstiden för synaptiskaström styrs av α 4. Den excitatoriska konduktans var oförändrad medan latensen för den hämmande konduktans ändrades, minska sin försening i förhållande till uppkomsten av excitation (figur 2D).
- Efter inspelningen, försiktigt dra tillbaka pipetten så cellkroppen förblir intakt. Omedelbart fixera vävnad i 4% paraformaldehyd under 30 min, följt av tre 10 min tvättar med 0,1 M fosfatbuffert. Kylskåp och utför antikroppsfärgning följande dag eller inom en vecka.
4. Antikroppsfärgning mot Lucifer Fylld Gul Retinal ganglion celler
- Antikroppsfärgning mot Lucifer fyllda Gul ganglion celler i rumstemperatur (primär anti-Lucifer Gul kanin IgG (utspädning = 1:10000) i fem dagar, på den sjätte dagen, natten färgning med sekundär get-anti-kanin IgG (utspädning = 1:500 )). Blöt montera näthinnan i Fluorescent Bevara Media. Täckglas och försegla med spik polish.
- Ta konfokala bilder av cellens morfologi med en Leica Spec-II konfokalmikroskop (Figur 1B). Närvaron av en axon medger bekräftelse av ganglion celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bidraget från olika källor för hämmande insignaler till svar gangliecell demonstreras genom tillämpning av olika konduktans vågformer. Dessa vågformer erhölls med stimuli av olika luminans under normala förhållanden och i närvaro av TTX, en spänning-gated Na +-blockerare som blockerar aktionspotential generation endast i en delmängd av hämmande retinal interneurons. Figur 2A visar ett representativt svar på injektion av retande och hämmande konduktans vågformer in som svar på stimulering med en liten svart fläck på en grå bakgrund under normala förhållanden. När konduktans vågformer erhållna med en svart fläck av olika storlek i närvaro av TTX injicerades i samma cell, var endast en svag respons observeras (Figur 2B).
Figur 2C illustrerar svaren av en annan gangliecell till insprutning av olika par avkonduktans vågformer i vilka förhållandet mellan kontroll retande och hämmande konduktans var manipulerad (G exc: G inv förhållanden: 1:00 till 1:02). Det är tydligt att svaret hos cellen minskade när graden av hämning är ökades. Därför manipulera balansen mellan excitation och inhibition medger kvantifiering av deras inverkan på neuronal utgång.
Vi testade även effekten av att ändra den relativa timingen mellan excitation och hämning på neuronala responser. Såsom visas i figur 2D var synpunkterna av annat gangliecell reduceras då latensen hos den inhiberande konduktans minskades, vilket visar att styrkan av svaret beror på tidpunkten för dess synaptiska inmatningar.
Figur 1. (A) Experimentell ställa upp i schematisk form. Är en digitalkamera som används för att visualisera celler organ ganglieceller för att lappa klämma dem (vänster skärm). Svaren på varje cell till olika aktuella injektioner först registreras, förstärks och sedan visas på den högra skärmen. Observera att en återkopplingsslinga också sätts upp mellan datorn och cellen så att membranpotential (V) av cellen vid en given instans används för att beräkna strömmen (I) som skall injiceras. (B) Den morfologi gangliecell visualiserades under en Leica Spec-II konfokalmikroskop efter inspelningen och immunocytokemisk färgning. Slutliga bilden producerades med ImageJ efter att kollapsa en bunt bilder. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Svaren på en gangliecell till injektion av excitatoriska (gröna spår) och hämmande (röda spår) konduktans vågformer erhållna från experiment som utförts i kontrollbetingelser (A) och efter badet tillämpning av tetrodotoxin (TTX, B). (C) svar av en annan gangliecell till olika par av konduktans vågformer. Förhållandena mellan excitatoriska konduktans (G ex moms) och hämmande konduktans (G inv) ändrades från 1:00 till 1:02. Eftersom graden av hämning ökade, var svaret hos cellen minskas. (D) Respons hos en gangliecell till samma nivå av excitation i vilken uppkomsten av inhibition varierades. At representerar tidsskillnaden mellan uppkomsten av hämmande och retande konduktanser. Eftersom förseningen av hämning minskades, svaret av tHan cell blev svagare. Klicka här för att visa en större bild
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi användningen av dynamiska klämma för att bedöma inverkan av förhållandet och relativa timingen för excitation och hämning på näthinnegangliecell utgång. Dynamisk klämma använder datorsimuleringar för att införa fysiologiskt inspelade eller konstgjorda synaptiska konduktanser i levande nervceller. Denna metod ger ett interaktivt verktyg med vilket konduktanser kan modifieras och injiceras i nervceller för att beräkna deras påverkan på neurala reaktioner. Conductance vågformer kan erhållas från experiment där visuella stimuli används för att aktivera fotoreceptorer i kontroll förhållanden och i närvaro av farmakologiska medel för att isolera bidrag specifik cell eller kretsar. Injektion av olika kombinationer av dessa konduktans vågformer avslöjar deras bidrag till spiking utgång. Användningen av dynamiska clamp inspelningar kan också manipulation av halterna av bakgrundsljud, vilket kan ske under olika ljus-anpassning conditio ns. Dessutom kan konduktans vågformer även genereras från modeller av synaptiska ingångar, såsom alfa-funktioner, och även för synaptiska ingångar med spänning beroende (dvs. NMDA-receptorer) samt för spänning jonkanaler eller elektriskt kopplade celler. Därför jämförelser mellan olika villkor öppnar upp enorma möjligheter för att förstå att bidra med olika synaptiska mekanismerna till neuronala svar och signalbehandling i neurala nätverk. Det är viktigt att påpeka att även om olika typer av ganglion celler uttrycker tydligt olika typer och densiteter av spänningskänsliga kanaler, fann vi att resultaten av integreringen av synaptiska konduktanser var konsekvent över celltyper. Således var förändringar i förhållandet och tidpunkten för de retande och hämmande konduktanser liknande återspeglas i svaren även spik frekvens, inter-spik intervaller och egenskaper anpassning varierade beroende på celltyp (data visas ej).
ove_content "> Även dynamiska klämma erbjuder många fördelar, det finns vissa begränsningar inneboende i tekniken (för översyn, se 7). En stor man är att konduktans injektion i soma kanske inte korrekt representera synaptiska ingångar förmedlade av receptorer och kanaler som är specifikt fördelade längs membranet av dendritiska processer, och varje icke-linjära interaktioner som kan uppstå i dendriter. Således kan konduktanser distalt om injektionsstället simuleras endast ca. Även dynamiska klämma framgångsrikt tillämpats på dendriter i pyramidala celler gör fyrdubbla hel- cell inspelningar 8, utesluter morfologiska komplexitet dendritiska gangliecell bearbetar en realistisk simulering av den rumsliga fördelningen av synapser genom att göra dendritiska inspelningar. Det tillvägagångssätt som presenteras här använder konduktans vågformer beräknad från somatiska spänning-clamp experiment som också förlitar sig på en punkt-källelektrod och förutsätter linjära interaktioner mellan spännandeAtory och hämmande insatsvaror, ett antagande allmänt accepterade i samhället. Således är dessa studier ger viktig information om effekterna av förändringar i synaptiska konduktanser på neuronal integration på nivån av soma och axon kulle.Våra experiment inte replikeras fysiologiska reaktioner som också rekryterar spänningsöppnade konduktanser i dendriter gangliecell. Detta kan emellertid också åstadkommas genom att modifiera modellekvationer så att den ström som matas inkluderar dendritiska konduktanser och effekter kabel baserat på en multi-kompartmentmodell (enligt beskrivningen i 7).
En annan begränsning är att verksamheten är beroende av förändringar som modifierar neuronal svar, det vill säga förändringar i intracellulärt kalcium eller andra budbärare som utlöses genom aktivering av membrankanaler eller receptorer inte återges i dessa dynamiska clamp inspelningar. Även vår modell inte behandlar denna nivå av komplexitet som kan vara specifika för vissa celltyper, var simuleringar där en kalcium pool och kalciuminflöde till denna pool i realtid baserat på de spänningsvariationer i den inspelade neuron framgångsrikt genomfört 10.
Även om en samplingshastighet på 10 kHz skulle noggrant följa tidsförloppet av aktionspotentialer, våra inspelningar används istället en samplingshastighet på 40 kHz. Denna högre samplingsfrekvens krävs för att upprätthålla stabiliteten i systemet och för att möjliggöra realistiska och mycket noggrann inspelningar (för översikt se 11).
Den experimentella metod som beskrivs här kräver inte att hålla näthinnan dark-anpassad. Konduktans vågformer erhålls från mörk-anpassad retinae i fysiologiska betingelser användes för att beräkna strömmen som skall injiceras in i cellen, på detta sätt den ström som matas härmade fysiologisk stimulering med ljus. Icke desto mindre skulle det fortfarande vara möjligt att hålla vävnaden mörka-anpassas och därmed kunna compare svaren till konduktans injektion med dem till ljus stimulering. I detta fall, fysiologiska egenskaper ganglieceller (svar polaritet, dvs ON, OFF eller ON-OFF, spatial och temporal frekvens känslighet, riktning selektivitet, etc.) kan klassificeras innan applicering av olika konduktans vågformer för att bedöma huruvida injektion av konduktanser från en viss celltyp har olika effekt beroende på vilken celltyp de tillämpas.
Sammantaget anser vi att dynamiska klämman är en mycket kraftfull teknik för att hjälpa till att avslöja samspelet mellan retande och hämmande synaptiska ingångar som genererar neuronal produktionen, för att undersöka vilken roll olika spänningskänsliga konduktanser i neuronaktivitet samt att testa hypoteser om synaptiska mekanismerna . Tillämpningen av denna teknik i näthinnan är särskilt användbar, eftersom de synaptiska ingångar på flera typer gangliecell har varit noggrant karakteriserad som en funktion av den fysiologiska stimulus. På liknande sätt kan detta tillvägagångssätt ge insikter i funktionen av neuronala kretsar i andra områden av det centrala nervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla förfaranden först godkändes av Animal Care etikkommitté The University of Sydney, och sedan utförs i enlighet med riktlinjerna i den australiska uppförandekoden för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål (National Health och Medicinska forskningsrådet i Australien ).
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Australian Research Council (ARC DP0988227) och Biomedicinsk vetenskap Research Initiative Grant från Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Utrustningen Patch Clamp Förstärkare EPC 8 finansierades av Startup fonden från Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Utrustningen InstruTECH LIH 8 +8 Data Acquisition System köptes med medel från Rebecca L. Cooper Foundation och Startup fonden från Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Vi vill tacka de anonyma granskarna för deras insiktsfulla förslag och kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Micr–lectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation | ||
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -S. Foundations of cellular neurophysiology. , The MIT Press. London. (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).
- Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
