Summary
מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.
Abstract
תאי הגנגליון הם תאי עצב הפלט של הרשתית ופעילותם משקפת את האינטגרציה של קלטים סינפטיים מרובים הנובעים ממעגלים עצביים ספציפיים. טכניקות תיקון מהדק, מהדק מתח ובתצורות מהדק הנוכחי, משמשות בדרך כלל כדי ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של תאי עצב ולאפיין התשומות סינפטיים שלהם. למרות היישום של טכניקות אלה הוא אינפורמטיבי מאוד, הם מציבים מגבלות שונות. לדוגמה, קשה לכמת את האופן שבו האינטראקציות המדויקות של תשומות מעוררות ומעכבות לקבוע פלט תגובה. כדי לטפל בבעיה זו, השתמשנו בטכניקה שונה נוכחית מהדק, מהדק דינמי, המכונית גם מוליכות 1 מהדק, 2, 3 ובדקנו את ההשפעה של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות על רגישות עצבית. טכניקה זו דורשת הזרקה של זרם לתוך התא ותלוי במשוב בזמן אמת של פוטנציאל הקרום שלה באותו זמן. Injecteד הנוכחי מחושב מראש conductances מעוררים והמעכב, הפוטנציאלים סינפטיים היפוכם ואת הפוטנציאל המיידי הקרום של התא. פירוט השיטה הניסיוני, תיקון הידוק תאים כדי להשיג תצורה כל תא ותעסוקה של טכניקת המהדק הדינמית באות לידי ביטוי במאמר זה וידאו. כאן, אנו מציגים את התגובות של תאי הגנגליון ברשתית עכבר לצורות גל מוליכות שונות המתקבלות מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחותו של סמים. יתר על כן, אנו מציגים את השימוש בconductances מעוררים והמעכב המלאכותיים שנוצר באמצעות פונקציות אלפא לחקור את התגובות של התאים.
Introduction
הרשתית היא רקמה עצבית כמעט שקופה המצפה את החלק האחורי של העין. מחקרים רבים משתמשים ברשתית כמודל כדי לחקור את צעדיו הראשונים בעיבוד חזותי ומנגנונים של איתות הסינפטי. מאז רשת הרשתית בהכנה כל ההר נשארה שלמה לאחר נתיחה, הוא מייצג מערכת אידיאלית ללמוד אינטראקציות הסינפטי כתגובות הפיזיולוגיות שלו דומות מאוד לתנאים בvivo. כך, באמצעות רשתית מבודדת את המאפיינים של תאי העצב שלו ניתן ללמוד תוך שימוש בטכניקות מהדק תיקון (לביקורות על הטכניקה, ראה 6,9,13). זיהוי התרומה של מעגלים ומוליכים עצביים לתגובת תא גנגליון הספציפיים המדויקת, לעומת זאת, בדרך כלל הפריע כסוכנים תרופתיים לפעול באתרים שונים.
תגובות פיסיולוגיות של תאי עצב ברשתית לאור, הגירוי הטבעי, ניתן להקליט עם pipettes זכוכית מלא בנוזל תוך תאי. באמצעות תיקון CLטכניקות מגבר, תגובות עצביות לגירוי אור ניתן להקליט כמו תנודות פוטנציאל הממברנה (מהדק נוכחי) או כזרמים (מהדק מתח). על ידי החזקת פוטנציאל הממברנה במתחים שונים וביישום ניתוח מוליכות בדיעבד, אפשר לבודד את תשומות סינפטיים מעכבות ומעוררות 5,12. סוג זה של ניסויים יכול להתבצע במדיום רחצה רגיל ובנוכחותם של סוכנים תרופתיים שונים כדי לבודד את תרומתו של נוירוטרנסמיטורים ואת הקולטנים לתגובות עצביות שונים. שפע של מחקרים ממעבדות רבות אפיין את התלות של תפוקה ותשומות spiking מעוררות ומעכבות על נכסי תמריצים כגון גודל, בניגוד, תדרי מרחב ובזמן, כיוון, כוונה ומשתנים גירוי אחר. אם כי אלה גישות ניסיוניות לספק מידע על הקשר בין התפוקה ותשומות ספייק סינפטיים כפונקציה של מאפייני גירוי,הפרשנות של התרומה של סוגי תאים מסוימים והתשומות סינפטיים לרגישות תא היא לא פשוטה. זאת בשל העובדה שהן בדרך כלל תשומות מעוררות ומעכבות להשתנות עם מאפייני גירוי ולכן, לא ניתן להעריך את ההשפעה המדויקת ששינויים בכל אחד מתשומות אלה יש בspiking העצבי.
גישה חלופית כדי לעקוף מגבלות אלו היא לבצע הקלטות מהדק דינמיות, המאפשרות הערכה ביקורתית של התרומה של תשומות סינפטיים בודדות לspiking פלט. טכניקת המהדק הדינמית מאפשרת הזרקה ישירה של זרם לתוך התא ואת כמות המוזרקת נוכחי בזמן נתון תלויה בפוטנציאל הקרום נרשם באותה תקופה 1,2,3 (לסקירה, ראה 7,14). זוהי הגדרת מהדק נוכחי שונה שבו אינטראקציה משוב בזמן אמת, במהירות בין התא מתחת להקלטה והציוד הכולל חומרה מיוחדת, התוכנהומחשב מושגת. כמות המוזרקת הנוכחי לתוך התא מחושבת בהתאם. לפיכך, היתרון של שיטה זו הוא שהתא יכול להיות מגורה עם שילובים של צורות גל מוליכות שונות, והתגובה שלה תהיה לחקות את ההפעלה של קולטנים שמתווכים תשומות סינפטיים. לדוגמה, השוואה בין התגובה להזרקה של conductances המעוררות והמעכב לנקודה קטנה עם התגובה להזרקה של מוליכות הגירוי לנקודה קטנה מספקת מידע לגבי ההשפעה של עיכוב בתגובת תא בלבד. כמו כן, שילובים אחרים של conductances נרשם פיסיולוגיים יכולים להיות שותף הזריק לחשוף כיצד גירוי תלוי שינויים בconductances המעוררות ו / או מעכבות משפיעים על התפוקה בספייק.
במחקר שלנו, נעשתה שימוש בטכניקת המהדק הדינמית כדי להדגים את ההשפעה של המשרעת והעיתוי של תשומות סינפטיים על מאפייני הירי של תאי הגנגליון ברשתית היחסי. conductances השוניםהמתקבל מניסויים פיסיולוגיים בתנאי בקרה או בנוכחות של סוכנים תרופתיים הועסקו כתשומות. בנוסף, conductances מלאכותי המבוסס על פונקציות אלפא שמשו גם כדי לחקור כיצד תשומות סינפטיים משולבות על ידי תאי עצב. לכן זו היא טכניקה צדדי המאפשרת סוגים שונים של מוליכות נוצרו גם מבחינה פיזיולוגית, פרמקולוגית או המחשוב להיות מוזרקים לתוך אותו תא גנגליון, ולכן השוואה של תגובות לתשומות אלה יכול להתבצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הגדרה כללית והכנת רקמה
- שמור את העכבר בחושך במשך 30 דקות (במטרה להפחית את רמת המתח שלה). בזמן ההמתנה, להכין 1 ליטר של פתרון תאי. הראשון לפזר 1.9 גרם של סודה לשתייה בחץ ליטר המים מילי-Q. ה-pH שלו נשמר על ידי 7.4 מבעבעים עם 95% O 2 ו 5% CO 2. חמש דקות לאחר מכן, לפזר 8.8 גרם של איימס בינוני ב100 מ"ל של מים מילי-Q, להוסיף לפתרון סודיום ביקרבונט, עליון עד 1 ליטר עם מים מילי-Q ומערבבים היטב. שמור פתרון זה carboxygenated לשארית של הניסוי.
- קח 250 מ"ל של איימס בינוני carboxygenated ולהגדיר את המערכת בנוזל reperfusion אלקטרו ההגדרה. שמור את פתרון carboxygenated.
- אחיד למרוח שכבה דקה של שומן ואקום על החלק התחתון של חדר זלוף. לאטום אותו עם פיסת כיסוי ולוודא שהוא אוויר חזק. קח כמות קטנה של שומן (~ 2 מ"מ קוטר) ולמקם אותו בחלק העליון ומסתיים תחתון של החדר. הכדורים האלה יחזיקו את הרשת (מסגרת פלטינה מתוחה עם חוט דנטלי) במקום ולמנוע אותה לחיצה חזקה מדי על הרשתית. תקן את התא על גבי פלטפורמה וליישר את שני הפתחים.
- בעלי החיים הוא מורדמים ראשון עם Isoflurane למשך 2 דקות, ולאחר מכן הקריבו על ידי נקע בצוואר רחם. להסיר במהירות את העיניים עם זוג מספריים קטנים (להבים מעוגלים), לשטוף ביסודיות עם נוזל חוץ תאי carboxygenated בכוס קטנה, ולאחר מכן למקם בצלחת פטרי מלאה בנוזל חוץ תאי carboxygenated.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חור כניסה בקרנית (~ 2 מ"מ מהקצה) באמצעות מחט מד 19. חזור לעין השנייה. צעד חשוב זה צריך להיות מהיר כדי לאפשר חמצון של שניהם הרשתיות. הסר קרנית אחד עם מספריים קטנים קשתית על ידי חיתוך במקביל לקצה שלה. בשלב הבא, להסיר את הקשתית ועדשה עם זוג מלקחיים בסדר. חזור לעין השנייה. העבר את כוס עין אחת לתוך כוס המכילהcarboxygenated פתרון תאי.
- עם להב סכין מנתחים, לחתוך כוס עין אחת לשתיים, כדי שתוכל לשטח את כל ההר, וכדי לקבל שני שלם mounts לרשתית. להפריד בזהירות את הרשתית מאפיתל הפיגמנט באמצעות בדיקה לנתח בוטה או על ידי משייכתו בעדינות אותו. פעם אחת מנותק, הרשתית היא די שקופה. שימו לב למשטח הקמור הוא הצד הקולטני האור. המשטח הקעור הוא צד תאי גנגליון והוא עשוי להיצמד לעצמו בשל נוכחותם של הומור זגוגית דביק.
- עם זוג מלקחיים בסדר, להחזיק את הקצה של רקמת הרשתית המנותקת הקרובה לserrata האורה ולתפוס את serrata האורה עם זוג נוסף של מלקחיים עדינים, מושך אותו לכיוון מרכז הרשתית. זהו תהליך עדין ועלולים לקחת כמה ניסיונות. אם יצליח, serrata אורה, גוף הריסים והומור זגוגית יוסרו על ידי תהליך זה, והעקמומיות של הרשתית מצטמצמת (כלומר להחמיא).
- חתוך את הקצוות, ולאחר מכן להעביר אותו לכלקאמרי איחוי עם תאי הגנגליון פונים כלפי מעלה. החזק את הרקמות במקום על ידי הצבת הרשת על גבי כדורי הגריז. הנח את הרקמה שנותרה עם כוס העין השנייה לשימוש מאוחר יותר. נהלים דומים לנתיחת רשתית מתוארים במידלטון וProtti 16 וPottek et al. 17.
- הר חדר ההקלטה תחת מיקרוסקופ זקוף. מייד הקים זלוף המתמשך של הרשתית עם פתרון carboxygenated תאי (35.5 מעלות צלזיוס) בשיעור של 3 - 5 מ"ל / דקה. ודא אלקטרודה ההארקה נמצאת במקום.
- מצורף למיקרוסקופ הוא מצלמה דיגיטלית המאפשרת הדמיה של הרקמות. כל הסט עד יושב מעל שולחן אוויר (ספיגת זעזועים) ובתוך כלוב פאראדיי (שדות סטטיים ואינם סטטית חיצוניים בלוקים חשמליים).
- הפעל את מקור האור (אינפרא אדום,> 850 ננומטר) ועם מטרת 40X, להביא את המיקוד שלה על גופי התא של תאי הגנגליון. מצא את האזור המרכזי של כל ההר לrecorדינג.
- להפשיר בקבוקון קפוא של K + פתרון מבוסס תאי (300 μl, pH = 7.4) המכיל (מ"מ) K-גלוקונאט: 140, חומצת HEPES: 10, MgCl 2: 4.6, ה-ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0.4 וEGTA: 10. כל חומרים כימיים שנרכשו מסיגמה אולדריץ.
2. גופי תא תיקון של תאי הגנגליון ברשתית
- אש ראשונה ללטש את הקצוות של צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט, ולאחר מכן למשוך אותם עם חולץ microelectrode זכוכית עם שני שלבי חימום (התנגדות: 5 - 8 MΩ).
- הוסף 3 μl של צהוב לוציפר (ריכוז סופי של 0.2%) לפתרון תאי, ומערבב היטב, וצנטריפוגות זה. בשלב הבא, להעביר את 85% העליון של הפתרון לתוך מזרק 1 מ"ל, לחבר אותו ליחידת ilter F מיקרומטר 0.22, ולאחר מכן למחט מזרק לשימוש חוזר 30-G. שומר במקרר.
- תקן את פיפטה הזכוכית, בגודל קצה דומה לאלה המשמשים להקלטות, במחזיק בו ולהעביר אותו תחת מיקרוסקופ באמצעות micromanipulaטור. תחת מטרת 40X, לאט לאט להוריד את פיפטה עד שהוא עושה גומה קטנה על פני השטח של קרום הגבלה הפנימי. להתקדם בזהירות פיפטה קדימה עד שתופס כמות קטנה של רקמות, ולאחר מכן להעביר אותו כלפי מעלה ו / או לצדדים לקרוע חור קטן כדי לחשוף את גופי התא של תאי הגנגליון. קטן החור, גבוה יותר את מידת היושרה של רשת הרשתית נשמר. אם תרצה, sulforhodamine 101 (SR101; 0.5 - 1 מיקרומטר) ניתן להוסיף למדיום תאי לתייג תאי עצב שניזוקו על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי 15.
- למלא את פיפטה נקיות עם 8 - 10 μl של פתרון תאי. הכנס אותו לבעל המצורף לבמה את ראשו של המגבר ולוודא את האלקטרודה כלוריד כסף כלור היא שקועה. בטל אם לכלוך ו / או בועות אוויר היא / הם הווה.
- הפעל את כל הציוד. אנחנו השתמשנו מגבר מהדק תיקון 8 EPC הנשלט על ידי PatchMaster להשיג כל תא הקלטות בקון מהדק מתחפיגורציה. שימו לב שיכולים לשמש גם מגברים אחרים המאפשרים הקלטות מהדק הנוכחיות במצב במהירות. להחיל ולשמור על לחץ חיובי בפתרון פיפטה. בחר תא בגוף תא גדול כל כך סביר להניח שזה תא גנגליון במקום תא amacrine עקור או תא גליה. לאט לאט להוריד את קצה פיפטה כך שזה עושה גומה קטנה על פני השטח של הקרום, לעצור, ולשחרר את הלחץ. מייד להוריד את פוטנציאל ההחזקה ל-- 60 mV. ברגע שgigaseal (GΩ) מושגת ביניהם, בעדינות למצוץ לשבור את הקרום כדי להשיג תצורת מהדק תיקון כל תא. הליך זה הוא צעד עדין, אם לחץ שלילי יותר מדי מוחל, אז החיבור הופך דולף, אם מעט מדי, הקרום נשאר שלם.
- במשך זמן, לוציפר צהוב ימלא את התא, ומאפשר הדמיה של המורפולוגיה של התא. אם יציב, הגדרה זו צריכה להימשך 30 דקות או יותר.
3. הקלטות של תאי הגנגליון שימוש Dynamiג קלאמפ
- ראשית, בדיקה נוכחית במתח (מ - 75 עד 35 + mV כל 10 mV) מבוצע באמצעות PatchMaster. המשך לבדיקות מאוחרות יותר רק אם Na גדול + נוכחי (> 1 Na) הוא הווה. יצוין, כי באירוע הנדיר שבו תא amacrine העקורים הוא תוקנו, במקרה זה, לא יגיב עם רכבות של פוטנציאל פעולה לזריקות שוטפות לאחר מכן.
- LabVIEW הפתוח ולבצע את תכנית Neuroakuma נכתב המותאמת אישית, ולאחר מכן לטעון את גל מוליכות שונים. להגדיר מספר חוזר עד 8 (6 - 8 למטרה סטטיסטית). הגדר פוטנציאלי היפוך של conductances המעוררות והמעכב וב0 - 75 mV בהתאמה. בחר זוג תואם אחד conductances המעוררות והמעכב לבדיקה. עקבות מוליכות מעוררות (בירוק) ועקבות מוליכות מעכבות (באדום) יופיעו בפנל התחתון.
- חזור לPatchMaster, בחר מצב מהדק נוכחי, ולעבור באופן מיידי למצב מגבר המהדק הנוכחי "CC + תקשורת מהירה". מצב זה מאפשר לACCurately בצע שינויים מהירים בפוטנציאל הממברנה. אם איטום טוב בין הקרום ופיפטה נשמר, / אין צורך בפיצוי קטן, אחרת ההקלטה לא תימשך זמן רב. בNeuroakuma, לחץ על הכפתור "הרשומה". התגובה התאית (בדרך כלל עם פרץ phasic של פוטנציאל פעולה, איור 1 א) תופיע בפנל העליון. הזרק נוכחי לתוך התא עם דרוג נמוך של conductances הראשונה, אם מעט / אין תגובה הוא ציין, להגדיל במרווחים קטנים עד שהוא מייצר תגובה חזקה. הזרקה נוכחית מוגזמת יכולה להרוג את התא. בדיקות לאחר השלמה, בחר זוג חדש של צורות גל מוליכות, חזור מעל לכל הזוגות של conductances הפיזיולוגי והמלאכותית. הזרמים הפיסיולוגיים (אני) הוזרקו בזמן אמת המבוססים על:
אני (לא) = G exc (t) x (V מ '(t) - V exc) + G INH (t) x (V מ' (t) - V INH)
מוליכות (G בNS) יכולה להיות סאיnaptic או מלאכותי. מניסויים קודמים שבוצעו על ידי Protti, די מרקו, הואנג, Vonhoff, נגויין וסולומון (תוצאות לא פורסמו) בתגובה לגירויים חזותיים שונים בתנאי בקרה ובנוכחות של צורות גל tetrodotoxin מוליכות הסינפטי מעוררות ומעכבות נאספו (TTX, 1 מיקרומטר) . גל מוליכות מלאכותי היה מודל באמצעות פונקצית אלפא. V מ '(בmV) הוא פוטנציאל הממברנה המוקלט. G ו-G exc INH מייצגים conductances המעוררות והמעכב בהתאמה תוך exc V ו-V INH מייצגים את פוטנציאלי ההיפוך של conductances המעוררות והמעכב, בהתאמה. זמן הוא לא בטרשת נפוצה. קצב דגימה הוא 40 קילוהרץ.
אני S = אני 0 (ט / α) דואר αt
המשוואה לעיל היא פונקצית אלפא (אני 0 = זרם מרבי; 1 / α = זמן השיא (שניות -1) של נוכחי). זמן העלייה וזמן דעיכה של הסינפטינוכחי מוכתב על ידי α 4. המוליכות מעוררות נותרות ללא שינוי בזמן ההשהיה של מוליכות מעכבות שונה, הפחתת העיכוב ביחס להתפרצות של עירור (איור 2 ד).
- לאחר הקלטה, לחזור בו בזהירות פיפטה כך גוף התא נשאר ללא פגע. מייד לתקן רקמות בparaformaldehyde 4% למשך 30 דקות, ואחרי שלוש דקות עם 10 שוטף 0.1 מ 'של חיץ פוספט. מכניס למקרר ולבצע נוגדנים מכתימים את היום שלמחרת או בתוך שבוע.
4. מכתים נוגדן נגד תאי רשתית גנגליון וציפר צהובים מלאים
- מכתים נוגדן נגד תאי וציפר צהובים מלא הגנגליון בטמפרטורת חדר (העיקרי נגד לוציפר ארנב IgG הצהוב (= דילול 1:10,000) לחמישה ימים; ביום השישי, מכתים הלילה עם שני עיזים נגד ארנב IgG (= דילול 1:500 )). הרטב לעלות רשתית במדיה שימור פלורסנט. כיסוי להחליק ולאטום עם המסמר עמ 'olish.
- קח תמונות confocal של המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal Spec-השני לייקה (איור 1). נוכחותו של האקסון מאפשרת אישור לתאי גנגליון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרומתם של מקורות תשומות מעכבות לתגובות תא הגנגליון שונים באה לידי ביטוי באמצעות היישום של צורות גל מוליכות שונות. גל אלה התקבלו עם גירויים שונה של בהירות בתנאים רגילים ובנוכחותו של TTX, + חוסם מתח מגודרת Na ערוץ ש2A פעולת לוקי דור פוטנציאלי היחידה בקבוצת משנה של interneurons רשתית מעכב. איור מראה תגובה להזרקה של נציג גל מוליכות מעורר ומעכב שנרשם בתגובה לגירוי עם נקודה שחורה קטנה על רקע אפור בתנאים נורמלים. כשגל המוליכות הושג עם נקודה שחורה בגודל שונה בנוכחות TTX הוזרקו לאותו התא, רק תגובה חלשה נצפתה (איור 2).
איור 2 ג ממחיש את התגובות של תא גנגליון אחר להזרקה של זוגות שונים שלגל מוליכות שבה היחס בין מוליכות מעוררות ומעכבות שליטה היה לטפל (G exc: יחסי INH G: 1:00-01:02). ברור שהתגובה של תא ירד ככל שהרמה של עיכוב הוגדלה. לפיכך, מניפולציה האיזון בין עירור ועיכוב מאפשרת כימות של ההשפעה שלהם על תפוקה עצבית.
אנחנו גם בדקנו את ההשפעה של שינוי התזמון היחסי בין עירור ועיכוב בתגובות עצביות. כפי שמודגם באיור 2 ד, את התגובות של תא גנגליון שונה הופחתו כהשהיה של המוליכות מעכבות ירד, הוכחה כי עוצמת התגובה תלויה בתזמון של התשומות סינפטיים.
איור 1. () ניסיוני ההגדרה בצורה סכמטית. משמשת מצלמה דיגיטלית כדי להמחיש גופי תא של תאי הגנגליון כדי להטליא לצבוט אותם (מסך משמאל). תגובות של כל תא לזריקות הנוכחיות שונות נרשמו ראשון, מוגבר ולאחר מכן מוצגות על המסך הנכון. שימו לב שלולאת משוב היא גם הקימה בין המחשב לסלולרי של פוטנציאל כזה שקרום (V) של התא במקרה נתון משמש לחישוב נוכחי (אני) להיות מוזרק. (ב) המורפולוגיה של תא גנגליון דמיין תחת מיקרוסקופ confocal לייקה Spec-השני לאחר ההקלטה וimmunocytochemical מכתים. תמונה סופית הופקה באמצעות ImageJ לאחר שהתמוטט ערימה של תמונות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תגובות של תא גנגליון להזרקה של עקבות (ירוקות) מעוררות ומעכב (עקבות אדומות) מוליכות צורות גל המתקבלים מניסויים שבוצעו בתנאי בקרה () ואחרי יישום אמבט של tetrodotoxin (TTX, ב '). (ג) תגובות של תא אחר גנגליון לזוגות שונים של צורות גל מוליכות. היחסים בין מוליכות מעוררות (G exc) ומוליכות מעכבות (G INH) שונו 1:00-01:02. כמידת העיכוב גדלה, התגובה של תא ירד. (D) תגובות של תא גנגליון לאותה הרמה של עירור שבתחילת העיכוב הייתה מגוונת. Δt מייצג את הפרש הזמן בין תחילתה של conductances המעכבת והמעורר. כעיכוב של עיכוב הופחת, התגובה של לאהוא התא נחלש. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים את השימוש במהדק דינמי כדי להעריך את ההשפעה של היחס והתזמון יחסי של עירור ועיכוב בתפוקת תא הגנגליון ברשתית. מהדק דינמי עושה שימוש בסימולציות מחשב כדי להציג את conductances סינפטיים פיזיולוגית מוקלט או מלאכותי לנוירונים חיים. מתודולוגיה זו מספקת כלי אינטראקטיביים שבאמצעותו ניתן לשנות conductances ומוזרק לתוך נוירונים לחישוב השפעתם על תגובות עצביות. ניתן לקבל צורות גל מוליכות מניסויים שבהם גירויים חזותיים המשמשים להפעלה קולטנית אור בתנאי בקרה ובנוכחות של סוכנים תרופתיים לבודד את תרומתו של תא או מעגלים ספציפיים. הזרקה של שילובים של צורות גל אלה מוליכות שונים חושפת את תרומתם לspiking פלט. השימוש בהקלטות מהדק דינמיים גם מאפשרת מניפולציה של רמות רעש רקע, שעשויים להתקיים תחת conditio אור הסתגלות שונה NS. יתר על כן, ניתן גם לייצר צורות גל מוליכות מדגמים של תשומות סינפטיים, כגון פונקציות אלפא, וגם לתשומות סינפטיים עם תלות מתח (קולטני NMDA כלומר), כמו גם לתעלות יונים מתח מגודרת או תאים בשילוב חשמלי. לפיכך, השוואות שנעשו בין תנאים שונים לפתוח אפשרויות עצומות כדי להבין את התרומה של מנגנונים סינפטיים שונים לתגובות עצביות ועיבוד אותות ברשתות עצביות. חשוב להעיר כי גם כאשר סוגים שונים של תאי הגנגליון לבטא סוגים וצפיפויות של מתח מגודרת ערוצים שונים במובהק, מצאנו כי את התוצאות של שילוב של conductances סינפטיים היו עקביות בסוגי תאים. לפיכך, שינויים ביחס ותזמון של conductances המעוררות והמעכב התבטאו באופן דומה בתגובות למרות שתדר, מרווחים בין ספייק ספייק ומאפייני הסתגלות השתנו בהתאם לסוג התא (מידע לא מוצג).
> Ove_content "למרות מהדק דינמי מציע יתרונות רבים, יש כמה מגבלות פנימיות לטכניקה (לסקירה, ראה 7). אחת עיקרית היא שזריקת המוליכות בסומה לא יכול לייצג במדויק תשומות סינפטיים בתיווך קולטני וערוצים שהם במיוחד מופץ יחד הקרום של תהליכים דנדריטיים, וכל אינטראקציות שאינן ליניארי שיכול להתרחש בדנדריטים. כך, conductances דיסטלי לאתר ההזרקה ניתן לדמות רק כ. למרות מהדק דינמי יושם בהצלחה להדנדריטים בתאים פירמידליים עושים מרובע שלמה תא הקלטות 8, המורכבות צורנית של תהליכים דנדריטים תא גנגליון מונעת סימולציה ריאליסטית של ההתפלגות המרחבית של סינפסות ידי ביצוע הקלטות דנדריטים. הגישה המובאת כאן משתמשת במוליכות גל מחושב מניסויים מתח-clamp סומטיים שמסתמכים גם על האלקטרודה נקודת מקור ומניח אינטראקציות בין יניארי excitתשומות atory ומעכבות, הנחה המקובלת בקהילה. לכן, מחקרים אלה מספקים מידע משמעותי לגבי ההשפעות של שינויים בconductances סינפטיים על אינטגרציה עצבית ברמה של סומה והאקסון התלולית.הניסויים שלנו לא לשכפל את התגובות פיסיולוגיות שגם לגייס conductances מתח מגודרת בדנדריטים תא גנגליון. זה, עם זאת, יכול גם להתבצע על ידי שינוי משוואות המודל כך שהזריק הנוכחי כוללים conductances דנדריטים ואפקטי כבלים המבוססים על מודל רב תא (כפי שמתואר ב7).
מגבלה נוספת היא ששינויים בפעילות תלויות שמשנים תגובה עצבית, שינויים כלומר בסידן תוך תאי או שליחים שני מופעלים על ידי הפעלה של ערוצי קרום או קולטנים אינם מועתקות בהקלטות מהדק הדינמיות אלה. למרות שהמודל שלנו אינו עוסק בזה ברמה של מורכבות שיכולים להיות שלpecific לכמה סוגי תאים, סימולציות הכוללות בריכת סידן וזרימת סידן לבריכה זו בזמן אמת המבוססת על תנודות המתח של הנוירון הקלטות יושמו בהצלחה 10.
למרות שקצב דגימה של 10 קילוהרץ יהיה מדויק בצע את מהלך הזמן של פוטנציאל פעולה, ההקלטות שלנו משמשות קצב דגימה של 40 קילוהרץ במקום. קצב דגימה גבוהה יותר, זאת על מנת לשמור על יציבות במערכת ולאפשר להקלטות מציאותיות ומדויקות מאוד (לסקירה ראה 11).
הגישה הניסויית המתוארת כאן אינה מחייבת לשמור על הרשתית כהה מותאמת. גל מוליכות מתקבלים מרשתיות כהות מותאמות בתנאים פיסיולוגיים ששמשו בחישוב הנוכחי להיות מוזרקים לתוך התא, ובדרך זו המוזרק הנוכחית חיקתה את הגירוי פיסיולוגי עם אור. עם זאת, זה עדיין יהיה אפשרי כדי לשמור על הרקמה כהה מותאמת ובכך, תוכל גompare התגובות להזרקת מוליכות עם אלה לגירוי אור. במקרה זה, תכונות פיסיולוגיות של תאי הגנגליון (קוטביות תגובה, כלומר פועלות, כבוי או ON-OFF, רגישות תדירות מרחב ובזמן, כיוון סלקטיביות, וכו ') יכולה להיות מסווגת לפני היישום של צורות גל מוליכות שונות כדי להעריך האם או לא זריקה של conductances מסוג תא מסוים יש השפעות שונות בהתאם לסוג התא שהם מוחלים.
בסך הכל, אנו רואים כי מהדק דינמי הוא טכניקה רבה עוצמה כדי לעזור לחשוף את יחסי גומלין בין תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות שיוצרות פלט עצבי, כדי לחקור את תפקידו של conductances מתח מגודרת השונים בירי עצבי, כמו גם לבחון את ההשערות לגבי מנגנונים סינפטיים . יישום של טכניקה זו ברשתית הוא שימושי במיוחד, כתשומות סינפטיים על כמה סוגי תאי הגנגליון היו לאפיין באופן יסודיד כפונקציה של הגירוי הפיזיולוגי. כמו כן, גישה זו יכולה לספק תובנות לתוך הפונקציה של מעגלים עצביים באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל ההליכים אושרו תחילה על ידי ועדת האתיקה של הטיפול בבעלי החיים באוניברסיטה של סידני, ולאחר מכן בוצעו בהתאם להנחיות של הקוד האוסטרלי של אימון לטיפול והשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (בריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואי של אוסטרליה ).
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המועצה למחקר האוסטרלית (ARC DP0988227) וחקר המדעים ביו גרנט היוזמה מהדיסציפלינה של המדע ביו, אוניברסיטת סידני. מגבר הצמד תיקון ציוד EPC 8 מומן על ידי קרן האתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. מערכת ציוד InstruTECH LIH 8 8 נתונים הרכישה נרכשה בכספים מרבקה ל 'קופר קרן וקרן אתחול מהדיסציפלינה של מדע ביו, אוניברסיטת סידני. ברצוננו להודות לסוקרים אנונימיים לקבלת ההצעות והערות תובנה שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Micr–lectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation | ||
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -S. Foundations of cellular neurophysiology. , The MIT Press. London. (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).
- Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
