Summary
इस वीडियो लेख सेल शरीर पैच करने के लिए सेट अप, प्रक्रियाओं और कैसे पूरे माउंट माउस दृष्टिपटल में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं से गतिशील दबाना रिकॉर्डिंग को लागू करने के लिए दिखाता है. इस तकनीक को उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी आदानों की सटीक योगदान की जांच, और neuronal spiking के लिए उनके रिश्तेदार परिमाण और समय की अनुमति देता है.
Abstract
नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं रेटिना के उत्पादन न्यूरॉन्स होते हैं और उनकी गतिविधियों विशिष्ट तंत्रिका सर्किट से उत्पन्न होने वाली कई अन्तर्ग्रथनी आदानों के एकीकरण को दर्शाता है. वोल्टेज दबाना और वर्तमान दबाना विन्यास में पैच दबाना तकनीक,, आमतौर पर न्यूरॉन्स के शारीरिक गुणों का अध्ययन करने और उनके अन्तर्ग्रथनी आदानों चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन तकनीकों का प्रयोग बहुत जानकारीपूर्ण है, वे विभिन्न सीमाओं मुद्रा. उदाहरण के लिए, यह उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों की सटीक बातचीत प्रतिक्रिया उत्पादन का निर्धारण कैसे अंदाजा लगाना मुश्किल है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम भी प्रवाहकत्त्व दबाना 1, 2, 3 नामक एक संशोधित वर्तमान दबाना तकनीक, गतिशील दबाना, इस्तेमाल किया और neuronal excitability पर उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी आदानों के प्रभाव की जांच की. इस तकनीक को सेल में वर्तमान के इंजेक्शन की आवश्यकता है और उस समय इसकी झिल्ली क्षमता का वास्तविक समय प्रतिक्रिया पर निर्भर है. injecteघ मौजूदा पूर्व निर्धारित उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी conductances, उनके उलट क्षमता और सेल की तात्कालिक झिल्ली क्षमता से गणना की है. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पर विवरण, गतिशील दबाना तकनीक के एक पूरे सेल विन्यास और रोजगार प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं clamping पैच इस वीडियो लेख में सचित्र हैं. यहाँ, हम नियंत्रण की स्थिति में या दवाओं की उपस्थिति में शारीरिक प्रयोगों से प्राप्त विभिन्न प्रवाहकत्त्व waveforms के लिए माउस रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं दिखा. इसके अलावा, हम कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए अल्फा कार्यों का उपयोग कर उत्पन्न कृत्रिम उत्तेजक और निरोधात्मक conductances के इस्तेमाल को दिखाने के.
Introduction
रेटिना आंख के पीछे अस्तर एक लगभग पारदर्शी तंत्रिका ऊतक है. कई अध्ययनों से पहले दृश्य प्रसंस्करण में कदम और synaptic संकेत के तंत्र की जांच करने के लिए मॉडल के रूप में रेटिना का उपयोग करें. पूरे माउंट तैयारी में रेटिना नेटवर्क विच्छेदन के बाद भी बरकरार है, यह अपनी शारीरिक प्रतिक्रियाओं vivo परिस्थितियों में बहुत सी समानताएँ हैं के रूप में synaptic बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श व्यवस्था का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रकार, अपने न्यूरॉन्स के गुण पैच दबाना तकनीक (तकनीक पर समीक्षा के लिए, 6,9,13 देखें) का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है एक अलग रेटिना का उपयोग कर. औषधीय एजेंटों के विभिन्न स्थलों पर कार्य के रूप में विशिष्ट सर्किट और नाड़ीग्रन्थि सेल प्रतिक्रिया के लिए न्यूरोट्रांसमीटर की सटीक योगदान की पहचान है, तथापि, आमतौर पर रुकावट है.
प्रकाश को रेटिना न्यूरॉन्स की शारीरिक प्रतिक्रियाओं, प्राकृतिक उत्तेजना, intracellular द्रव से भरा गिलास pipettes के साथ दर्ज किया जा सकता है. पैच सीएल का उपयोगamp, तकनीक, प्रकाश उत्तेजना के लिए neuronal प्रतिक्रियाओं झिल्ली संभावित उतार चढ़ाव (वर्तमान दबाना) के रूप में या धाराओं (वोल्टेज दबाना) के रूप में दर्ज किया जा सकता है. विभिन्न voltages पर झिल्ली संभावित पकड़ रहा है और एक अनुमान प्रवाहकत्त्व विश्लेषण लागू करने से, यह निरोधात्मक और उत्तेजक अन्तर्ग्रथन आगतों 5,12 अलग करना संभव है. प्रयोगों के इस प्रकार के सामान्य स्नान मध्यम में और विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर और neuronal प्रतिक्रियाओं को रिसेप्टर्स के योगदान को अलग करने के लिए विभिन्न औषधीय एजेंटों की उपस्थिति में किया जा सकता है. कई प्रयोगशालाओं से अध्ययन का एक धन spiking उत्पादन और प्रोत्साहन ऐसे आकार के रूप में गुण, इसके विपरीत, स्थानिक और लौकिक आवृत्तियों, दिशा, अभिविन्यास और अन्य प्रोत्साहन चर पर उत्तेजक और निरोधात्मक आदानों की निर्भरता होती है. इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण कील उत्पादन और प्रोत्साहन संपत्तियों के एक समारोह के रूप में अन्तर्ग्रथनी सूचनाओं के बीच रिश्ते के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं,सेल excitability के लिए विशेष प्रकार की कोशिकाओं और उनके अन्तर्ग्रथनी आदानों के योगदान की व्याख्या स्पष्ट नहीं है. यह आम तौर पर उत्तेजक और निरोधात्मक दोनों आदानों प्रोत्साहन गुणों के साथ बदलती हैं और इस प्रकार, यह इन सूचनाओं के दोनों में परिवर्तन neuronal spiking पर है कि सटीक प्रभाव का आकलन करने के लिए संभव नहीं है कि इस तथ्य के कारण है.
इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण उत्पादन spiking के लिए व्यक्तिगत अन्तर्ग्रथनी आदानों के योगदान का एक महत्वपूर्ण मूल्यांकन की अनुमति जो गतिशील दबाना रिकॉर्डिंग, बाहर ले जाने के लिए है. गतिशील दबाना तकनीक सेल में वर्तमान के प्रत्यक्ष इंजेक्शन की अनुमति देता है और एक निश्चित समय पर मौजूदा इंजेक्शन की राशि उस समय 1,2,3 (समीक्षा के लिए, 7,14 देखें) में दर्ज की झिल्ली की क्षमता पर निर्भर करता है. यह एक संशोधित वर्तमान दबाना सेट अप है जहां रिकॉर्डिंग के तहत सेल और विशेष हार्डवेयर शामिल उपकरण, सॉफ्टवेयर के बीच एक वास्तविक समय, तेजी से प्रतिक्रिया बातचीतऔर एक कंप्यूटर हासिल की है. सेल में मौजूदा इंजेक्शन की मात्रा के हिसाब से गणना की जाती है. इसलिए, इस विधि का लाभ सेल प्रवाहकत्त्व waveforms के विभिन्न संयोजनों के साथ प्रेरित किया जा सकता है, और अपनी प्रतिक्रिया अन्तर्ग्रथनी आदानों कि मध्यस्थता रिसेप्टर्स की सक्रियण की नकल करेंगे. उदाहरण के लिए, एक छोटी सी जगह के लिए उत्तेजक प्रवाहकत्त्व के इंजेक्शन के जवाब के साथ एक छोटी सी जगह के लिए उत्तेजक और निरोधात्मक conductances के इंजेक्शन के जवाब की तुलना केवल सेल प्रतिक्रिया पर निषेध के प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इसी तरह, physiologically दर्ज conductances के अन्य संयोजन कील उत्पादन को प्रभावित कैसे प्रेरणा पर निर्भर उत्तेजक और / या निरोधात्मक conductances में परिवर्तन प्रकट करने के लिए सह इंजेक्शन जा सकता है.
हमारे अध्ययन में, गतिशील दबाना तकनीक रिश्तेदार आयाम और रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की फायरिंग गुण पर अन्तर्ग्रथनी आदानों के समय के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विभिन्न conductancesनियंत्रण की स्थिति में या औषधीय एजेंटों की उपस्थिति में शारीरिक प्रयोगों से प्राप्त जानकारी के रूप में कार्यरत थे. इसके अलावा, अल्फा कार्यों के आधार पर कृत्रिम conductances भी अन्तर्ग्रथनी आदानों न्यूरॉन्स द्वारा एकीकृत कर रहे हैं कि कैसे की जांच के क्रम में इस्तेमाल किया गया. इस प्रकार इस प्रवाहकत्त्व के विभिन्न प्रकार के औषधीय या computationally ही नाड़ीग्रन्थि सेल में इंजेक्ट किया, या तो physiologically उत्पन्न, इन सूचनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं की तो तुलना बनाया जा सकता है की अनुमति देता है कि एक बहुमुखी तकनीक है.
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Protocol
1. जनरल सेट अप और ऊतक तैयारी
- 30 मिनट (अपने तनाव के स्तर को कम करने का लक्ष्य) के लिए अंधेरे में माउस रखें. इंतजार करते हुए, कोशिकी समाधान के 1 एल तैयार करते हैं. पहले मिल्ली क्यू पानी का आधा लीटर में सोडियम बाइकार्बोनेट की 1.9 ग्राम भंग. इसका पीएच 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती से 7.4 पर बनाए रखा है. पांच मिनट बाद, मिल्ली क्यू पानी के साथ 1 एल के लिए टॉप अप, सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के लिए जोड़, मिल्ली क्यू पानी की 100 मिलीलीटर में एम्स माध्यम से 8.8 ग्राम भंग करने और अच्छी तरह मिलाएं. प्रयोग के आराम के लिए carboxygenated इस समाधान रखें.
- Carboxygenated एम्स मध्यम के 250 मिलीलीटर ले लो और electrophysiological में तरल पदार्थ reperfusion की व्यवस्था सेट अप स्थापित की. समाधान carboxygenated रखें.
- समान धब्बा छिड़काव चैम्बर के तल पर वैक्यूम तेल की एक पतली परत. एक कवर पर्ची के साथ मुहर और यह हवा तंग है सुनिश्चित करें. तेल (व्यास में ~ 2 मिमी) की एक छोटी राशि लेने के लिए और शीर्ष पर यह स्थिति औरनीचे चैम्बर के समाप्त हो जाती है. इन गेंदों जगह में ग्रिड (प्लैटिनम फ्रेम दंत सोता साथ अनुभूत) पकड़ और यह रेटिना पर भी मुश्किल दबाने को रोकने जाएगा. मंच पर चैम्बर को ठीक करने और दोनों के उद्घाटन संरेखित.
- पशु ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान फिर 2 मिनट के लिए, और Isoflurane साथ पहली anaesthetized है. जल्दी से छोटे कैंची (घुमावदार ब्लेड) की एक जोड़ी के साथ आंखों को हटाने, carboxygenated बाह्य तरल पदार्थ से भरा एक पेट्री डिश में जगह तो एक छोटे बीकर में carboxygenated बाह्य तरल पदार्थ के साथ अच्छी तरह से धोने, और.
- विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक 19 गेज सुई का उपयोग कॉर्निया में एक प्रविष्टि छेद (धार से ~ 2 मिमी) बनाते हैं. अन्य आंख के लिए दोहराएँ. यह महत्वपूर्ण कदम दोनों दृष्टिपटल की oxygenation अनुमति देने के लिए जल्दी होना चाहिए. इसके किनारे के समानांतर काटने से परितारिका कैंची का एक छोटा सा जोड़ी के साथ एक कॉर्निया निकालें. अगला, ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ परितारिका और लेंस को हटा दें. अन्य आंख के लिए दोहराएँ. जिसमें एक बीकर में एक आंख कप स्थानांतरणकोशिकी समाधान carboxygenated.
- एक स्केलपेल ब्लेड के साथ, पूरे माउंट समतल करने और रेटिना के प्रति पूरे दो आरोह को प्राप्त करने के लिए सक्षम होने के लिए, आधे में एक आंख कप कटौती. एक कुंद विदारक जांच का उपयोग वर्णक उपकला से या धीरे इसे खींच द्वारा रेटिना ध्यान से अलग. एक बार अलग, रेटिना काफी पारदर्शी है. उत्तल सतह फोटोरिसेप्टर की ओर होता है. अवतल सतह नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की ओर है और यह चिपचिपा शीशे हास्य की उपस्थिति के कारण खुद के लिए छड़ी सकता है.
- ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ, ora serrata को अलग रेटिना ऊतक करीब के किनारे पकड़ और ठीक संदंश की एक और जोड़ी के साथ ora serrata हड़पने, रेटिना के केंद्र की ओर खींच. यह एक नाजुक प्रक्रिया है और कुछ प्रयास ले सकता है. यदि सफल, ora serrata, सिलिअरी शरीर और शीशे हास्य इस प्रक्रिया से हटा रहे हैं, और रेटिना की वक्रता (यानी चापलूसी) कम हो जाता है.
- किनारों ट्रिम, और उसके बाद प्रति के लिए स्थानांतरणऊपर का सामना करना पड़ नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के साथ विलय चैम्बर. तेल गेंदों पर ग्रिड रखकर जगह में ऊतक पकड़ो. बाद में उपयोग करने के लिए अन्य नेत्र कप के साथ शेष ऊतक रखें. रेटिना विच्छेदन के लिए इसी तरह की प्रक्रियाओं मिडिलटन और Protti 16 और Pottek एट अल में वर्णित हैं. 17.
- एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत रिकॉर्डिंग कक्ष माउंट. 5 मिलीग्राम / मिनट - तुरंत 3 की दर से carboxygenated कोशिकी समाधान (35.5 डिग्री सेल्सियस) के साथ रेटिना की निरंतर छिड़काव की स्थापना की. ग्राउंडिंग इलेक्ट्रोड जगह में है सुनिश्चित करें.
- माइक्रोस्कोप से जुड़ी ऊतक के दृश्य की अनुमति एक डिजिटल कैमरा है. पूरे सेट अप एक हवाई तालिका (सदमे अवशोषण) ऊपर और एक फैराडे पिंजरे (ब्लॉक बाहरी स्थिर और गैर स्थैतिक बिजली क्षेत्र) के अंदर बैठता है.
- प्रकाश स्रोत (अवरक्त,> 850 एनएम) पर और एक 40x उद्देश्य के साथ बारी, नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के सेल शरीर पर अपना ध्यान केंद्रित लाने. Recor के लिए पूरे माउंट के मध्य क्षेत्र का पता लगाएंडिंग.
- Defrost कश्मीर के एक जमे हुए शीशी + आधारित intracellular समाधान (300 μl, = पीएच 7.4) युक्त (मिमी) कश्मीर gluconate: 140, HEPES एसिड: 10, 2 MgCl: 4.6, एटीपी ना +: 4, जीटीपी-ना + : 0.4 और EGTA: 10. सभी अभिकर्मकों सिग्मा Aldrich से खरीदा है.
2. रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की पट्टी सेल निकायों
- सबसे पहले आग borosilicate केशिका ग्लास टयूबिंग की छोर पॉलिश, तो दो हीटिंग कदम (: - MΩ 8 5 प्रतिरोध) के साथ एक ग्लास Microelectrode डांड़ी के साथ उन्हें खींच.
- Intracellular समाधान के लिए लूसिफ़ेर पीला के 3 μl (अंतिम एकाग्रता 0.2%) जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से, और यह अपकेंद्रित्र. इसके बाद, एक 30 जी पुन: प्रयोज्य चमड़े के नीचे सुई, तो, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान के शीर्ष 85% हस्तांतरण 0.22 माइक्रोन च ilter इकाई से कनेक्ट. ठण्डा.
- उसके डिब्बे में, रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल उन लोगों के रूप में समान टिप आकार का, कांच विंदुक फिक्स और एक micromanipula उपयोग कर खुर्दबीन के तहत यह कदमटो. यह भीतर सीमित झिल्ली की सतह पर एक छोटा सा हिलकोरे बनाता है जब तक एक 40x उद्देश्य के तहत, धीरे पिपेट कम है. यह ऊतक का एक छोटा सा राशि फैल जाती है जब तक ध्यान से आगे पिपेट अग्रिम, और फिर नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के सेल शरीर को बेनकाब करने के लिए एक छोटा सा छेद फाड़ करने के लिए ऊपर की ओर और / या बग़ल में यह कदम. छोटे छेद, उच्च रेटिना नेटवर्क की अखंडता की डिग्री बनाए रखा है. अगर वांछित, sulforhodamine 101 (SR101, 0.5-1 माइक्रोन) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 15 का उपयोग करके क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए बाह्य माध्यम से जोड़ा जा सकता है.
- Intracellular समाधान के 10 μl - 8 के साथ एक साफ पिपेट भरें. एम्पलीफायर के सिर मंच से जुड़ी धारक में डालें और क्लोरीनयुक्त चांदी क्लोराइड इलेक्ट्रोड डूबे हुए है सुनिश्चित करें. अगर गंदगी और / या हवाई बुलबुले है / मौजूद हैं त्यागें.
- सभी उपकरणों को चालू करें. हम वोल्टेज दबाना चुनाव में पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए PatchMaster द्वारा नियंत्रित एक ईपीसी 8 पैच दबाना एम्पलीफायर का उपयोग कियाअलंकरण. तेजी से मोड में वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग अनुमति अन्य एम्पलीफायरों भी इस्तेमाल किया जा सकता है ध्यान दें. पिपेट समाधान में सकारात्मक दबाव लागू करने और बनाए रखने. बल्कि यह एक विस्थापित amacrine सेल या एक glial सेल से एक नाड़ीग्रन्थि सेल है तो सबसे अधिक संभावना एक बड़ी सेल शरीर के साथ एक कक्ष का चयन करें. धीरे धीरे यह झिल्ली की सतह पर एक छोटा सा हिलकोरे बना रही है तो, पिपेट टिप कम करना बंद करो, और दबाव जारी है. 60 एम वी - तुरंत करने के लिए धारण क्षमता कम है. एक gigaseal (GΩ) उन दोनों के बीच हासिल की है एक बार, धीरे से एक पूरे सेल पैच दबाना विन्यास प्राप्त करने के लिए झिल्ली को तोड़ने के लिए चूसना. यह प्रक्रिया बहुत ज्यादा नकारात्मक दबाव लागू किया जाता है, तो कनेक्शन टपका हुआ हो जाता है, एक नाजुक कदम है, बहुत कम है, झिल्ली बरकरार है.
- समय के साथ, लूसिफ़ेर पीला है सेल आकारिकी के दृश्य की अनुमति, सेल भरना होगा. स्थिर हैं, इस सेट को 30 मिनट या अधिक पिछले चाहिए.
3. Dynami का प्रयोग नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की रिकॉर्डिंगग क्लैंप
- सबसे पहले, एक वर्तमान वोल्टेज परीक्षण (से - 75 + 35 एम वी हर 10 एम वी) PatchMaster का उपयोग कर मार डाला है. एक बड़े ना + वर्तमान (> 1 एनए) मौजूद है, केवल अगर बाद में परीक्षण करने के लिए आगे बढ़ें. एक विस्थापित amacrine सेल समझौता है जहां दुर्लभ अवसर में, उस मामले में, बाद में मौजूदा इंजेक्शन की कार्रवाई क्षमता की गाड़ियों के साथ जवाब नहीं होगा कि ध्यान दें.
- ओपन LabVIEW और कस्टम लिखा Neuroakuma कार्यक्रम पर अमल, तो विभिन्न प्रवाहकत्त्व waveforms लोड. 8 (- 8 सांख्यिकीय प्रयोजन के लिए 6) को दोहराने की संख्या निर्धारित करें. क्रमश: 75 एम वी - 0 और पर उत्तेजक और निरोधात्मक conductances के उलट क्षमता निर्धारित करें. परीक्षण के लिए उत्तेजक और निरोधात्मक conductances की एक जोड़ी मिलान का चयन करें. उत्तेजक प्रवाहकत्त्व ट्रेस (हरे रंग में) और निरोधात्मक प्रवाहकत्त्व ट्रेस (लाल रंग में) कम पैनल में दिखाई देगा.
- वापस PatchMaster में जाओ, वर्तमान दबाना मोड का चयन करें, और तुरंत 'सीसी + कॉम फास्ट' वर्तमान दबाना मोड में एम्पलीफायर स्विच. इस विधा एसीसी की अनुमति देता हैurately झिल्ली क्षमता में तेजी से बदलाव का पालन करें. झिल्ली और विंदुक के बीच एक अच्छा मुहर बनाए रखा है, तो थोड़ा / कोई मुआवजा की जरूरत है, अन्यथा, रिकॉर्डिंग लंबे समय तक नहीं होगा. Neuroakuma में, "रिकॉर्ड" बटन दबाएँ. सेलुलर प्रतिक्रिया (आमतौर पर कार्रवाई क्षमता की एक phasic फट, चित्रा 1 ए) के साथ ऊपरी पैनल पर दिखाई देगा. छोटे / कोई जवाब नहीं मनाया जाता है अगर यह एक मजबूत प्रतिक्रिया पैदा करता है, जब तक छोटे वेतन वृद्धि में वृद्धि, पहली conductances की कम स्केलिंग के साथ सेल में वर्तमान इंजेक्षन. अत्यधिक वर्तमान इंजेक्शन कोशिका को मार सकते हैं. एक बार परीक्षण पूरा कर रहे हैं, प्रवाहकत्त्व waveforms की एक नई जोड़ी का चयन शारीरिक और कृत्रिम conductances के सभी जोड़ों के लिए ऊपर दोहराएँ. वास्तविक समय में इंजेक्शन शारीरिक धाराओं (आई) पर आधारित होते हैं:
मैं (टी) = जी exc (टी) एक्स (वी मीटर (टी) - वी exc) + जी INH (टी) एक्स (वी मीटर (टी) - वी INH)
चालकता (एन एस जी) एसवाई हो सकता हैnaptic या कृत्रिम. उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी प्रवाहकत्त्व तरंग (TTX, 1 माइक्रोन) नियंत्रण की स्थिति में अलग दृश्य उत्तेजनाओं के जवाब में और tetrodotoxin की उपस्थिति में Protti, डि मार्को, हुआंग, Vonhoff, गुयेन और सुलैमान (अप्रकाशित परिणाम) द्वारा प्रदर्शन पिछले प्रयोगों से एकत्र किए गए . कृत्रिम प्रवाहकत्त्व waveforms के अल्फा एक समारोह का उपयोग कर मॉडलिंग थे. वी एम (एम वी में) दर्ज की झिल्ली क्षमता है. वी exc है और वी INH क्रमशः उत्तेजक और निरोधात्मक conductances के उलट क्षमता का प्रतिनिधित्व करते हैं whilst के जी exc है और जी INH क्रमशः उत्तेजक और निरोधात्मक conductances का प्रतिनिधित्व करते हैं. समय एमएस में टी है. नमूना दर 40 kHz है.
मैं मैं = 0 (टी / α) ई αt
उपरोक्त समीकरण एक अल्फा समारोह (; वर्तमान के शिखर पर 1 / α = समय (सेकंड -1) मैं 0 = अधिकतम वर्तमान) है. वृद्धि समय और synaptic का क्षय समयवर्तमान α 4 से निर्धारित होता है. निरोधात्मक प्रवाहकत्त्व की विलंबता उत्तेजना की शुरुआत (चित्रा 2 डी) के सापेक्ष अपनी देरी को कम करने, संशोधित किया गया था whilst के उत्तेजक चालकता अपरिवर्तित रहा था.
- सेल शरीर बरकरार रहता है तो रिकॉर्डिंग के बाद, ध्यान से विंदुक वापस लेना. तुरंत फॉस्फेट बफर के 0.1 एम साथ तीन 10 मिनट washes के द्वारा पीछा किया 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में ऊतकों को ठीक. सर्द और अगले दिन या एक सप्ताह के भीतर धुंधला एंटीबॉडी करते हैं.
4. लूसिफ़ेर पीला भरा रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला
- माध्यमिक बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (कमजोर पड़ने = 1:500 के साथ छठे दिन, रात भर धुंधला, कमरे के तापमान पर लूसिफ़ेर पीला भरा नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (पांच दिन के लिए प्राथमिक विरोधी लूसिफ़ेर पीला खरगोश आईजीजी (कमजोर पड़ने = 1:10,000) के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला )). फ्लोरिसेंट संरक्षण मीडिया में रेटिना माउंट गीले. नाखून पी के साथ पर्ची और सील कवरolish.
- एक Leica कल्पना द्वितीय confocal खुर्दबीन (चित्रा 1 बी) का उपयोग सेल आकारिकी के confocal तस्वीरें ले लो. एक अक्षतंतु की उपस्थिति नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की पुष्टि की अनुमति देता है.
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Representative Results
नाड़ीग्रन्थि सेल प्रतिक्रिया को निरोधात्मक आदानों के विभिन्न स्रोतों के योगदान को विभिन्न प्रवाहकत्त्व waveforms के आवेदन के माध्यम से प्रदर्शन किया है. इन waveforms के सामान्य परिस्थितियों में और ब्लॉकों कार्रवाई केवल निरोधात्मक रेटिना interneurons के एक सबसेट में संभावित पीढ़ी. चित्रा 2A के इंजेक्शन के लिए एक प्रतिनिधि प्रतिक्रिया से पता चलता है कि TTX, एक वोल्टेज gated ना + चैनल अवरोधक की उपस्थिति में विभिन्न luminance की उत्तेजनाओं से प्राप्त किया गया उत्तेजक और निरोधात्मक प्रवाहकत्त्व waveforms के सामान्य परिस्थितियों में एक भूरे रंग की पृष्ठभूमि पर एक छोटी सी काली स्थान के साथ उत्तेजना के जवाब में दर्ज की गई. TTX की उपस्थिति में विभिन्न आकार की एक काला टीका के साथ प्राप्त प्रवाहकत्त्व waveforms की एक ही सेल में इंजेक्ट किया गया, केवल एक कमजोर प्रतिक्रिया (चित्रा 2B) मनाया गया.
चित्रा -2 विभिन्न जोड़े के के इंजेक्शन के लिए एक और नाड़ीग्रन्थि सेल की प्रतिक्रियाओं को दिखाता हैप्रवाहकत्त्व तरंग में जो नियंत्रण उत्तेजक और निरोधात्मक प्रवाहकत्त्व के बीच अनुपात (जी INH अनुपात: 1:00-1:02 जी exc) चालाकी से किया गया था. यह निषेध के स्तर में कमी के सेल की प्रतिक्रिया बढ़ा दिया गया था कि स्पष्ट है. इसलिए, उत्तेजना और निषेध के बीच संतुलन से छेड़छाड़ न्यूरोनल उत्पादन पर उनके प्रभाव की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है.
हम भी उत्तेजना और neuronal प्रतिक्रियाओं पर निषेध के बीच सापेक्ष समय बदलने के प्रभाव का परीक्षण किया. चित्रा 2 डी में सचित्र निरोधात्मक प्रवाहकत्त्व की विलंबता कम था, के रूप में एक अलग नाड़ीग्रन्थि सेल की प्रतिक्रियाओं प्रतिक्रिया की ताकत उसकी अन्तर्ग्रथनी आदानों के समय पर निर्भर करता है कि प्रदर्शन, कम हो गई थी.
चित्रा 1. (ए) योजनाबद्ध रूप में सेट अप प्रायोगिक. एक डिजिटल कैमरा उन्हें (बाएं निगरानी) दबाना पैच करने के क्रम में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं की कोशिका निकायों कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विभिन्न मौजूदा इंजेक्शन की प्रत्येक कोशिका की प्रतिक्रियाएँ पहले, दर्ज प्रवर्धित और फिर सही मॉनीटर पर प्रदर्शित किए गए. एक राय पाश भी किसी दिए गए उदाहरण में सेल की है कि इस तरह झिल्ली क्षमता (वी) इंजेक्शन (मैं) वर्तमान गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है कंप्यूटर और सेल के बीच निर्धारित किया गया है. (बी) एक नाड़ीग्रन्थि सेल की आकारिकी रिकॉर्डिंग और immunocytochemical धुंधला के बाद एक Leica कल्पना द्वितीय confocal खुर्दबीन के तहत कल्पना. अंतिम तस्वीर छवियों का एक ढेर के ढहने के बाद ImageJ का उपयोग कर उत्पादन किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. एक नाड़ीग्रन्थि उत्तेजक (हरे निशान) के इंजेक्शन को सेल और निरोधात्मक (लाल निशान) की प्रतिक्रियाएँ चालकता (TTX, बी) के नियंत्रण शर्तों (ए) में और tetrodotoxin के स्नान आवेदन के बाद बाहर किए गए प्रयोगों से प्राप्त और. (सी) प्रवाहकत्त्व waveforms के विभिन्न जोड़े के लिए एक और नाड़ीग्रन्थि सेल का जवाब. उत्तेजक चालकता (जी exc) और निरोधात्मक चालकता (जी INH) के बीच के अनुपात 1:00 से 1:02 करने के लिए बदल गया. निषेध की डिग्री की वृद्धि हुई, सेल की प्रतिक्रिया कम था. निषेध की शुरुआत विविध किया गया था जिसमें उत्तेजना का एक ही स्तर के लिए एक नाड़ीग्रन्थि सेल (डी) जवाब. Δt निरोधात्मक और उत्तेजक conductances की शुरुआत के बीच समय के अंतर का प्रतिनिधित्व करता है. टी के निषेध की देरी कम हो गया था, के रूप में प्रतिक्रियावह सेल कमजोर हो गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें
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Discussion
यहाँ हम अनुपात और उत्तेजना और रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल उत्पादन पर निषेध के रिश्तेदार समय के प्रभाव का आकलन करने के लिए गतिशील क्लैंप के उपयोग दिखा. गतिशील दबाना रहने वाले न्यूरॉन्स में physiologically दर्ज या कृत्रिम अन्तर्ग्रथनी conductances लागू करने के लिए कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग करता है. इस पद्धति conductances संशोधित और neuronal प्रतिक्रियाओं पर उनके प्रभाव की गणना करने के लिए न्यूरॉन्स में इंजेक्ट किया जा सकता है जिसके द्वारा एक इंटरैक्टिव उपकरण प्रदान करता है. प्रवाहकत्त्व waveforms के दृश्य उत्तेजनाओं नियंत्रण की स्थिति में और विशेष सेल या सर्किट के योगदान को अलग करने के लिए औषधीय एजेंटों की उपस्थिति में photoreceptors सक्रिय करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें प्रयोगों से प्राप्त किया जा सकता है. इन प्रवाहकत्त्व waveforms के विभिन्न संयोजनों का इंजेक्शन उत्पादन spiking के लिए उनके योगदान का पता चलता है. गतिशील दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग भी अलग प्रकाश अनुकूलन conditio के तहत जगह ले सकता है जो पृष्ठभूमि शोर के स्तर के हेरफेर, सक्षम बनाता है एनएस. इसके अलावा, प्रवाहकत्त्व waveforms में भी इस तरह के अल्फा कार्यों के रूप में अन्तर्ग्रथनी आदानों, के मॉडल से उत्पन्न, और भी वोल्टेज निर्भरता (यानी NMDA रिसेप्टर्स) के साथ ही वोल्टेज gated आयन चैनल या विद्युत युग्मित कोशिकाओं के साथ synaptic आदानों के लिए. किया जा सकता है इसलिए, विभिन्न परिस्थितियों के बीच बना तुलना न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं और तंत्रिका नेटवर्क सिग्नल प्रोसेसिंग के लिए अलग अन्तर्ग्रथनी तंत्र के योगदान को समझने के लिए विशाल संभावनाएं खुली. यह नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के अलग अलग प्रकार के और वोल्टेज gated चैनलों का घनत्व व्यक्त यहां तक कि जब हम अन्तर्ग्रथनी conductances के एकीकरण के परिणाम सेल प्रकार भर में लगातार थे पाया कि टिप्पणी करने के लिए महत्वपूर्ण है. कील आवृत्ति, अंतर - कील अंतराल और अनुकूलन गुण सेल प्रकार (नहीं दिखाया डेटा) के अनुसार विविध प्रकार, हालांकि अनुपात और उत्तेजक और निरोधात्मक conductances के समय में परिवर्तन इसी तरह की प्रतिक्रियाएं में परिलक्षित किया गया.
गतिशील दबाना कई लाभ प्रदान करता है ove_content "> हालांकि, तकनीक (समीक्षा के लिए, 7 देखें) के लिए आंतरिक कुछ सीमाएं हैं. एक प्रमुख एक सोमा में कि प्रवाहकत्त्व इंजेक्शन है सही रिसेप्टर्स और विशेष रूप से कर रहे हैं कि चैनलों द्वारा मध्यस्थता अन्तर्ग्रथनी आदानों प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता वृक्ष के समान प्रक्रियाओं, और dendrites में हो सकता है कि किसी भी गैर रेखीय बातचीत की झिल्ली के साथ वितरित की. इस प्रकार, इंजेक्शन साइट के लिए बाहर का conductances केवल लगभग प्रेरित किया जा सकता है. गतिशील दबाना सफलतापूर्वक पिरामिड कोशिकाओं में डेन्ड्राइट के लिए लागू किया गया था, हालांकि कर चौगुनी पूरे सेल रिकॉर्डिंग 8, नाड़ीग्रन्थि सेल वृक्ष के समान प्रक्रियाओं का रूपात्मक जटिलता वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग कर रही द्वारा synapses के स्थानिक वितरण का एक यथार्थवादी सिमुलेशन precludes. यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण भी एक बिंदु स्रोत इलेक्ट्रोड पर निर्भर है कि दैहिक वोल्टेज दबाना प्रयोगों से प्रवाहकत्त्व waveforms की गणना का उपयोग करता है और excit के बीच रैखिक बातचीत हो जाती हैatory और निरोधात्मक आदानों, व्यापक रूप से समुदाय में स्वीकार किए जाते हैं एक धारणा है. इस प्रकार, इन अध्ययनों सोम और अक्षतंतु पहाड़ी के स्तर पर न्यूरोनल एकीकरण पर अन्तर्ग्रथनी conductances में परिवर्तन के प्रभावों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं.हमारे प्रयोगों भी नाड़ीग्रन्थि सेल डेन्ड्राइट में वोल्टेज gated conductances भर्ती कि शारीरिक प्रतिक्रियाओं को दोहराने नहीं है. यह, हालांकि, यह भी मौजूदा इंजेक्शन एक बहु डिब्बे मॉडल (के रूप में 7 में वर्णित) के आधार पर वृक्ष के समान conductances और केबल प्रभाव शामिल हैं ताकि मॉडल समीकरणों को संशोधित करके पूरा किया जा सकता है.
एक और सीमा neuronal प्रतिक्रिया को संशोधित कि गतिविधि पर निर्भर परिवर्तन, intracellular कैल्शियम या झिल्ली चैनल या रिसेप्टर्स की सक्रियता से चालू होने वाले दूसरे दूतों में यानी परिवर्तन इन गतिशील दबाना रिकॉर्डिंग में reproduced नहीं हो रहा है. हमारे मॉडल जटिलता के स्तर के साथ सौदा नहीं करता है है हो सकता हैpecific कुछ प्रकार की कोशिकाओं के लिए, दर्ज न्यूरॉन के वोल्टेज में उतार चढ़ाव के आधार पर वास्तविक समय में इस पूल के लिए एक कैल्शियम पूल और कैल्शियम बाढ़ से जुड़े सिमुलेशन सफलतापूर्वक 10 लागू किया गया.
10 kHz के एक नमूना दर सही कार्रवाई क्षमता के समय के पाठ्यक्रम का पालन करेगा, भले ही हमारे रिकॉर्डिंग के बजाय 40 kHz के एक नमूना दर का इस्तेमाल किया. यह उच्च नमूना दर प्रणाली में स्थिरता बनाए रखने के लिए और यथार्थवादी और बेहद सटीक रिकॉर्डिंग (समीक्षा के लिए 11 देखें) की अनुमति देने के लिए आवश्यक है.
यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण रेटिना काले अनुकूलित रखने की आवश्यकता नहीं है. शारीरिक स्थितियों में काले अनुकूलित दृष्टिपटल से प्राप्त प्रवाहकत्त्व waveforms के सेल में इंजेक्ट किया जा करने के लिए वर्तमान की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस तरह से मौजूदा इंजेक्शन प्रकाश के साथ शारीरिक उत्तेजना मजाक उड़ाया. फिर भी, यह अभी भी ऊतक काले अनुकूलित रखने के लिए संभव हो सकता है और इस प्रकार, ग करने में सक्षम होप्रकाश उत्तेजना को उन लोगों के साथ प्रवाहकत्त्व इंजेक्शन के लिए प्रतिक्रियाओं ompare. इस उदाहरण में, नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के शारीरिक गुणों (प्रतिक्रिया ध्रुवता, पर, यानी बंद या पर बंद, स्थानिक और लौकिक आवृत्ति संवेदनशीलता, दिशा चयनात्मकता, आदि) या नहीं, इंजेक्शन का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न प्रवाहकत्त्व waveforms के आवेदन से पहले वर्गीकृत किया जा सकता है एक विशेष सेल प्रकार से conductances की वे लागू कर रहे हैं सेल प्रकार के आधार पर अलग अलग प्रभाव पड़ता है.
कुल मिलाकर, हम है कि गतिशील दबाना neuronal फायरिंग में अलग वोल्टेज gated conductances की भूमिका की जांच करने के साथ ही अन्तर्ग्रथनी तंत्र के बारे में परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए neuronal उत्पादन उत्पन्न कि उत्तेजक और निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी आदानों, के बीच बातचीत से पता चलता है मदद करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है पर विचार . कई नाड़ीग्रन्थि सेल प्रकार पर अन्तर्ग्रथनी आदानों विशेषताएँ हैं अच्छी तरह से किया गया है के रूप में रेटिना में इस तकनीक के अनुप्रयोग, विशेष रूप से उपयोगी हैशारीरिक उत्तेजना के एक समारोह के रूप में घ. इसी प्रकार, इस दृष्टिकोण के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों में neuronal सर्किट के समारोह में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
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Disclosures
सभी प्रक्रियाओं पहले सिडनी विश्वविद्यालय के पशु देखभाल आचार समिति ने मंजूरी दे दी, और तब वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए पशु की देखभाल और उपयोग के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई संहिता के दिशा निर्देशों (राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद के अनुसार प्रदर्शन किया गया ).
Acknowledgments
इस काम बायोमेडिकल साइंस के अनुशासन से ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी DP0988227) और जैव चिकित्सा विज्ञान अनुसंधान पहल अनुदान, सिडनी विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है. उपकरण पैच दबाना एम्पलीफायर ईपीसी 8 बायोमेडिकल साइंस, सिडनी विश्वविद्यालय के अनुशासन से स्टार्टअप कोष द्वारा वित्त पोषित किया गया. उपकरण InstruTECH LIH 8 +8 डाटा अधिग्रहण प्रणाली रेबेका एल कूपर फाउंडेशन और बायोमेडिकल साइंस, सिडनी विश्वविद्यालय के अनुशासन से स्टार्टअप कोष से धन के साथ खरीदा गया था. हम उनके व्यावहारिक सुझावों और टिप्पणियों के लिए अनाम समीक्षक धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Micr–lectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation | ||
References
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