Summary
Denne video artikel illustrerer set-up, de procedurer til at lappe celle organer og hvordan man gennemfører dynamiske clamp optagelser fra ganglion celler i hel-mount mus retinae. Denne teknik gør det muligt at undersøge den præcise bidrag excitatoriske og hæmmende synaptiske input, og deres relative størrelse og timing at neuronal spiking.
Abstract
Ganglieceller er output neuroner i nethinden og deres aktivitet afspejler integration af flere synaptiske input i forbindelse med specifikke neurale kredsløb. Patch clamp teknikker i spænding klemme og strømtang konfigurationer er almindeligt anvendt til at studere de fysiologiske egenskaber af neuroner og at beskrive deres synaptiske input. Selvom anvendelsen af disse teknikker er meget informative, de udgør forskellige begrænsninger. For eksempel er det vanskeligt at kvantificere hvordan de præcise interaktioner af excitatoriske og hæmmende input bestemme respons output. For at løse dette problem, vi brugte en modificeret strømtang teknik, dynamisk klemme, også kaldet ledeevne clamp 1, 2, 3 og undersøgt virkningerne af excitatoriske og hæmmende synaptiske input på neuronal uro. Denne teknik kræver injektion af strøm ind i cellen og er afhængig af den tidstro tilbagemelding sin membranpotentiale på det tidspunkt. Den injected strøm beregnes ud fra forudbestemte excitatoriske og hæmmende synaptiske konduktanser, deres tilbageførsel potentialer og cellens øjeblikkelige membran potentiale. Nærmere oplysninger om de eksperimentelle procedurer, der er patch fastspænding celler for at opnå en hel-celle konfiguration og beskæftigelse af den dynamiske clamp teknik illustreret i denne video artiklen. Her viser vi svarene fra muse retina-ganglieceller til forskellige ledningsevne waveforms fås fra fysiologiske eksperimenter kontrol forhold eller i nærværelse af narkotika. Derudover viser vi brug af kunstige excitatoriske og hæmmende konduktanser genereret med alfa-funktioner til at undersøge svarene fra cellerne.
Introduction
Nethinden er en nær-gennemsigtig neuralt væv foring bagsiden af øjet. Mange undersøgelser bruger nethinden som model til at undersøge de første skridt i visuel bearbejdning og mekanismer synaptiske signalering. Da den retinale netværk i hele-mount præparat forbliver intakte efter dissektion, det repræsenterer et ideelt system til at studere synaptiske interaktioner dets fysiologiske reaktioner er meget lig den in vivo. Således bruger en isoleret nethinden egenskaber sine neuroner kan studeres ved hjælp af patch clamp teknikker (efter anmeldelser på teknikken, 6,9,13 se). Identifikation af den nøjagtige bidrag bestemte kredsløb og neurotransmittere til ganglioncelle respons, imidlertid sædvanligvis hindres som farmakologiske midler virker på forskellige steder.
Fysiologiske reaktioner i nethindens neuroner for lys, den naturlige stimulus, kan optages med glaspipetter fyldt med intracellulær væske. Brug patch clamp teknikker, neuronale reaktioner på lys stimulation kan optages som membranpotentialet udsving (strømtang) eller som strømme (spænding klemme). Ved at holde membranpotentialet ved forskellige spændinger og gennemføre en efterfølgende konduktans analyse er det muligt at isolere hæmmende og stimulerende synaptiske input 5,12. Denne type eksperimenter kan udføres i normal badning medium og i nærvær af forskellige farmakologiske midler at isolere bidrag af forskellige neurotransmittere og receptorer til neuronale reaktioner. Et væld af undersøgelser fra mange laboratorier præget afhængighed af spiking output og stimulerende og hæmmende indgange på stimulus egenskaber såsom størrelse, kontrast, rumlige og tidslige frekvenser, retning, orientering og andre stimulus variabler. Selv om disse eksperimentelle metoder giver oplysninger om forholdet mellem spike udgang og synaptiske input som en funktion af stimulus egenskaber,fortolkning af bidrag fra bestemte celletyper og deres synaptiske input til celle uro er ikke ligetil. Dette skyldes det faktum, at typisk både stimulerende og hæmmende input varierer med stimulerende egenskaber og dermed er det ikke muligt at vurdere den nøjagtige virkning, at ændringer i en af disse indgange har på neuronal spiking.
En alternativ metode til at omgå disse begrænsninger er at udføre dynamiske clamp optagelser, som giver en kritisk vurdering af det bidrag, de enkelte synaptiske input til spiking output. Den dynamiske clamp teknik muliggør direkte injektion af strøm i cellen, og mængden af strøm injiceret på et givet tidspunkt afhænger af den registrerede membranpotentialet dengang 1,2,3 (for en oversigt, 7,14 se). Det er en modificeret strømtang set-up, hvor en realtid, hurtige feedback samspillet mellem cellen under optagelse og udstyr, der omfatter specialiserede hardware, softwareog en computer er opnået. Mængden af strøm injiceret i cellen beregnes i overensstemmelse hermed. Derfor er den fordel ved denne fremgangsmåde er, at cellen kan stimuleres med forskellige kombinationer af konduktans bølgeformer, og dens reaktion vil efterligne aktiveringen af receptorer, der medierer synaptiske input. For eksempel kun sammenligning af respons på injektion af stimulerende og hæmmende konduktanser for en lille plet med respons på injektion af ekscitatorisk ledningsevne for en lille plet giver oplysninger om virkningen af hæmningen af celle respons. På samme måde kan andre kombinationer af fysiologisk indspillede konduktanser co-injiceres at afsløre, hvordan stimulus-afhængige ændringer i excitatoriske og / eller hæmmende konduktanser påvirker spike output.
I vores undersøgelse er den dynamiske clamp teknik, der anvendes til at påvise virkningen af den relative amplitude og timingen af synaptiske input på standpladsen egenskaber retina-ganglieceller. Forskellige konduktanseropnået fra fysiologiske eksperimenter i kontrolrum forhold eller i nærværelse af farmakologiske midler var ansat som input. Desuden blev kunstige konduktanser baseret på alfa-funktioner også anvendes med henblik på at undersøge, hvordan synaptiske input integreres af neuroner. Dette er således en alsidig teknik, der tillader forskellige typer af konduktans frembringes enten fysiologisk, farmakologisk eller beregningsmæssigt skal injiceres i den samme ganglieceller, kan så sammenligning af svarene på disse indgange gøres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. General Opsætning og vævspræparat
- Hold musen i mørke i 30 min (sigter mod at reducere sin stress-niveau). Mens vi venter, forberede 1 L af ekstracellulært løsning. Først opløses 1,9 g natriumbicarbonat i en halv liter Milli-Q-vand. Dens pH holdes på 7,4 ved gennembobling med 95% O2 og 5% CO2. Fem minutter senere opløses 8,8 g Ames Medium i 100 ml Milli-Q vand, tilsæt til natriumbicarbonatopløsning, top op til 1 l med Milli-Q vand og bland godt. Denne opløsning opbevares carboxygenated for resten af forsøget.
- Tag 250 ml carboxygenated Ames Medium og opsætte væske reperfusion system i elektrofysiologiske set-up. Hold løsningen carboxygenated.
- Ensartet smøre et tyndt lag af vakuum fedt på bunden af perfusionskammeret. Forsegle det med en dækning slip og sørg for at det er lufttæt. Tag en lille mængde fedt (~ 2 mm i diameter), og placer det på toppen ognedre ender af kammeret. Disse kugler vil holde nettet (platin frame trukket med tandtråd) på plads, og forhindre, at den trykker for hårdt på nethinden. Fastgør kammeret på platformen og justere begge åbninger.
- Dyret er først bedøvet med isofluran i 2 min, og derefter aflivet ved cervikal dislokation. Fjern hurtigt øjne med et par små sakse (skovle), vaskes grundigt med carboxygenated ekstracellulære væske i en lille bæger, og derefter placere i en petriskål fyldt med carboxygenated ekstracellulære væske.
- Under dissektionsmikroskop, gøre en indsættelse hul i hornhinden (~ 2 mm fra kanten) ved hjælp af en 19 gauge nål. Gentag for det andet øje. Dette vigtige skridt bør være hurtig til at tillade iltning af både retinae. Fjern en hornhinde med en lille par iris saks ved at skære parallelt med kanten. Dernæst fjerner iris og linsen med et par fine tænger. Gentag for det andet øje. Overfør ene øje kop i et bæger, der indeholdercarboxygenated ekstracellulære opløsning.
- Med en skalpel, skæres det ene øje cup i halve, for at være i stand til at flade hel-mount, og for at få to hel-mounts pr nethinden. Adskil forsigtigt nethinden fra pigment epitel med et stumpt dissekere sonde eller ved forsigtigt at trække det ud. Når fritstående, nethinden er forholdsvis gennemsigtig. Bemærk den konvekse overflade er fotoreceptorer side. Den konkave overflade er ganglieceller side, og det kan klæbe til sig selv på grund af tilstedeværelsen af klæbrig glaslegemet.
- Med et par fine tænger, holde på kanten af fritliggende retinavæv tæt på ora serrata og fange den ora serrata med et andet par fine tænger, træk den mod midten af nethinden. Det er en delikat proces, og kan tage et par forsøg. Hvis det lykkes, er ora serrata, corpus ciliare og glaslegemet fjernes ved denne proces, og krumningen af nethinden er reduceret (dvs. fladere).
- Trim kanterne, og derefter overføre det til perfusion kammer med ganglieceller opad. Hold vævet på plads ved at placere risten onto fedt bolde. Placer de resterende væv med det andet øje kop til senere brug. Lignende procedurer for retinal dissektion er beskrevet i Middleton og Protti 16 og Pottek et al. 17..
- Monter optagelsen kammer under en opretstående mikroskop. Straks oprette den kontinuerlige perfusion af nethinden med carboxygenated ekstracellulære opløsning (35,5 ° C) med en hastighed af 3 - 5 ml / min. Sørg for, at jordforbindelseselektroden er på plads.
- Knyttet til mikroskop er et digitalt kamera tillader visualisering af væv. Hele sættet op sidder over en luft tabel (stødabsorbering) og inde et Faradays bur (blokerer eksterne statiske og ikke-statiske elektriske felter).
- Tænd lyskilden (infrarød,> 850 nm) og med en 40X målsætning, bringe sit fokus på den celle organer gangliecellerne. Find det centrale område af hele-mount til recording.
- Optøning en frossen hætteglas med K +-baseret intracellulære opløsning (300 pi, pH = 7,4) indeholdende (i mM) K-gluconat: 140, HEPES syre: 10, MgCl2: 4,6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0,4 og EGTA: 10. Alle reagenser fra Sigma-Aldrich.
2.. Patching Cell Organer retina-ganglieceller
- Første brand polere enderne af borosilikat kapillære glasrør, og derefter trække dem med et glas mikroelektrode Puller med to varmetrin (modstand: 5-8 MOhm).
- Tilføj 3 ul Lucifer Yellow (slutkoncentration 0,2%) til det intracellulære løsning, bland godt, og centrifuger den. Dernæst overføre top 85% af opløsning i en 1 ml sprøjte, slutte den til et 0,22 um f ilter enhed, derefter til en 30 G genanvendelig kanyle. Opbevares i køleskab.
- Fastgør glaspipette, af tilsvarende spids størrelse som dem der bruges til optagelser i sin holder og bevæge den under mikroskopet med en micromanipulator. Under en 40X objektiv, sænkes langsomt pipetten indtil det gør en lille fordybning på overfladen af den indre begrænsende membran. Forsigtigt rykke pipetten fremad, indtil den fanger en lille mængde af væv, og derefter flytte det opad og / eller sidelæns for at rive et lille hul for at blotlægge cellekroppe af gangliecellerne. Jo mindre hullet, jo højere grad af integritet af nethinden nettet opretholdes. Hvis det ønskes, sulforhodamin 101 (SR101, 0,5-1 uM) kan sættes til det ekstracellulære medium at mærke beskadigede neuroner ved hjælp af fluorescensmikroskopi 15.
- Fylde en ren pipette til punkt 8 - 10 ul af intracellulært løsning. Sæt det ind i holderen er knyttet til forstærkeren hoved scenen og sørg for chlorerede sølvchlorid er neddykket. Kasseres, hvis snavs og / eller luftbobler er / er til stede.
- Tænd alt udstyr. Vi brugte en EPC 8 patch clamp forstærker styres af PatchMaster at opnå hel-celle optagelser i spænding clamp configuration. Bemærk, at andre forstærkere, der tillader strømtang optagelser i hurtig tilstand kan også bruges. Anvende og vedligeholde positivt tryk i pipette løsning. Vælg en celle med en stor celle krop, så mest sandsynligt er det en ganglioncelle snarere end en forskudt amacrine celle eller en glialcelle. Langsomt sænke pipettespidsen så det gør en lille fordybning på overfladen af membranen, stoppe og slippe trykket. Umiddelbart sænke bedrift potentialet til - 60 mV. Når en gigaseal (GQ) opnås mellem dem, forsigtigt suge at bryde membranen for at opnå en hel-celle patch clamp konfiguration. Denne procedure er en delikat trin, hvis for meget negativt tryk påføres, så forbindelsen bliver utæt, hvis for lidt, Membranen forbliver intakt.
- Over tid vil Lucifer Yellow fylde cellen, tillader visualisering af cellens morfologi. Hvis stabil, bør dette set-up sidste 30 min eller mere.
3.. Optagelser af ganglieceller Brug Dynamic Clamp
- Først en strøm-spænding test (fra - 75 til + 35 mV hver 10 mV) udføres ved hjælp PatchMaster. Fortsæt til senere tests kun hvis en stor Na + strøm (> 1 nA) er til stede. Bemærk, at i de sjældne tilfælde, hvor en fordrevne amacrine celle er lappet, i dette tilfælde, vil ikke reagere med togene fra virkningspotentialer til efterfølgende løbende injektioner.
- Open LabVIEW og udføre den brugerdefinerede skrevet Neuroakuma program, så indlæser diverse ledningsevne waveforms. Indstil gentag nummer til 8 (6 - 8 for statistisk formål). Indstil tilbageførsel potentialer af excitatoriske og hæmmende konduktanser ved 0 og - 75 mV hhv. Vælg en matchende par excitatoriske og hæmmende konduktanser til test. Excitatory ledningsevne trace (i grønt) og hæmmende ledningsevne trace (i rødt) vises i det nederste panel.
- Gå tilbage til PatchMaster vælge strømtang mode, og straks skifte forstærkeren til "CC + Comm FAST 'strømtang mode. Denne tilstand gør det muligt at accurately følge hurtige ændringer i membranpotentialet. Hvis en god tætning mellem membranen og pipetten fastholdes, lidt / ingen kompensation er nødvendig, ellers vil optagelsen ikke vare længe. I Neuroakuma trykke på "record"-knappen. Det cellulære respons (som regel med en phasic byge af aktionspotentialer, figur 1A) vises på det øverste panel. Injicere strøm i cellen med lav skalering af konduktanser først, hvis lidt / ingen reaktion observeres, øges i små trin, indtil den danner en stærk reaktion. Overdreven strøminjektion kan dræbe cellen. Once test er afsluttet, skal du vælge et par nye konduktans kurver, gentag ovenstående for alle par af fysiologiske og kunstige konduktanser. De fysiologiske strømme (I) injiceret i realtid, er baseret på:
I (t) = G exc (t) x (V m (t) - V exc) + G inh (t) x (V m (t) - V innb)
Ledningsevne (G i nS) kan være SYnaptic eller kunstig. Excitatorisk og hæmmende synaptiske ledningsevne waveforms blev indsamlet fra tidligere eksperimenter udført af Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen og Salomon (upublicerede resultater) som reaktion på forskellige visuelle stimuli i kontrolrum forhold og i overværelse af tetrodotoxin (TTX, 1 uM) . Kunstig konduktans bølgeformer blev modelleret ved hjælp af en alfa-funktion. V m (i mV) er den optagede membran potentiale. G exc og G inh repræsenterer stimulerende og hæmmende konduktanser henholdsvis mens V exc og V inh repræsenterer tilbageførsel potentialer excitatoriske og hæmmende konduktanser hhv. Tiden er t i ms. Sampling rate er 40 kHz.
I s = I 0 (t / α) e-αt
Ovenstående ligning er en alpha-funktion (I 0 = maksimal strøm, 1 / α = tid til peak (sec -1) for den aktuelle). Stigningen tid og forfald tid af synaptiskestrøm er dikteret af α 4.. Den excitatorisk konduktans var uændret, mens latenstiden for den hæmmende konduktans blev ændret, reducere dens forsinkelse i forhold til starten af excitation (fig. 2D).
- Efter optagelsen trække forsigtigt pipetten, så cellen kroppen forbliver intakt. Umiddelbart løse væv i 4% paraformaldehyd i 30 minutter, efterfulgt af tre 10 minutters vaske med 0,1 M phosphatbuffer. Afkøl og udføre antistoffarvning den følgende dag eller inden for en uge.
4.. Antistoffarvning Against Lucifer Yellow Fyldt retina-ganglieceller
- Antistoffarvning mod Lucifer Yellow fyldt ganglieceller ved stuetemperatur (primær anti-Lucifer Yellow kanin-IgG (fortynding = 1:10.000) i fem dage, og på den sjette dag, overnight farvning med sekundært gede anti-kanin IgG (fortynding = 1:500 )). Våd montere nethinden Lysstofrør Bevarelse medier. Cover glide og tætne med søm polish.
- Tag konfokale billeder af cellens morfologi ved hjælp af en Leica Spec-II konfokalt mikroskop (figur 1B). Tilstedeværelsen af en Axon tillader bekræftelse af ganglieceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bidraget fra forskellige kilder hæmmende input til ganglion celle respons demonstreres gennem anvendelse af forskellige ledningsevne kurveformer. Disse kurver blev opnået med stimuli af forskellig luminans i normale forhold og i nærvær af TTX, en spændingsstyret Na +-kanal blokker, der blokerer virkningspotentiale generation kun i en delmængde af hæmmende retinale interneuroner. 2A viser et repræsentativt respons på injektion af excitatory og hæmmende ledningsevne waveforms indspillet i respons på stimulering med en lille sort plet på en grå baggrund i normale forhold. Når ledningsevnen bølgeformer opnået med en sort plet af forskellig størrelse i nærvær af TTX blev injiceret i den samme celle, blev kun en svag respons observeret (figur 2B).
Figur 2C illustrerer svarene fra en anden ganglioncelle til injektion af forskellige par afkonduktans bølgeformer hvor forholdet mellem kontrol excitatoriske og hæmmende ledningsevne blev manipuleret (G exc: G inh forhold: 1:00 til 01:02). Det er klart, at reaktionen af cellen faldet som graden af inhibering blev forøget. Derfor manipulere balancen mellem excitation og hæmning tillader kvantificering af deres indvirkning på neuronal output.
Vi har også testet effekten af at ændre den relative timing mellem excitation og hæmning på neuronale reaktioner. Som illustreret i figur 2D blev svarene fra en anden ganglieceller reduceret som latenstiden for den hæmmende konduktans faldt, hvilket viser at styrken af reaktionen afhænger af tidspunktet for dens synaptiske input.
Figur 1.. (A) Eksperimentel set-up i skematisk form. Et digitalt kamera bruges til at visualisere cellelegemer af ganglieceller for at lappe fastspænde dem (venstre skærm). Responser i hver celle til forskellige aktuelle injektioner blev først registreret, forstærkes og vises derefter på den højre skærm. Bemærk, at en tilbagekoblingssløjfe også etableres mellem computeren og den celle, således at membranpotentialet (V) af cellen ved en given instans bruges til at beregne den aktuelle (I), der skal injiceres. (B) morfologi en ganglioncelle visualiseret under et Leica Spec-II konfokalt mikroskop efter optagelse og immuncytokemisk farvning. Endelige billede blev produceret ved hjælp ImageJ efter at være kollapset en stak billeder. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Reaktioner en ganglioncelle til injektion af excitatoriske (grønne spor) og hæmmende (røde spor) konduktans bølgeformer opnået fra forsøg udført i kontrolbetingelser (A) og efter bad anvendelse af Tetradotoxin (TTX, B). (C) Responses en anden gangliecelle til forskellige par af ledningsevne kurveformer. Forholdene mellem excitatory ledningsevne (G exc), og hæmmende ledningsevne (G inh) blev ændret fra 1:00 til 01:02. Eftersom graden af inhibering steg, blev reaktion af cellen faldt. (D) responser af en ganglioncelle til samme niveau af excitation ved hvilken indtræden af inhibering blev varieret. Δt repræsenterer tidsforskellen mellem indtræden af hæmmende og stimulerende konduktanser. Som forsinkelsen af inhibering blev reduceret, reaktion af tHan celle blev svagere. Klik her for at se større figur
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi brug af dynamisk klemme at vurdere indflydelsen af forholdet og den relative timing af excitation og hæmning af retina-ganglieceller output. Dynamisk klemme gør brug af computersimuleringer for at indføre fysiologisk optagede eller kunstige synaptiske konduktanser i levende neuroner. Denne metode giver et interaktivt værktøj, som konduktanser kan ændres og injiceres i neuroner computing deres indflydelse på neuronale reaktioner. Konduktans kurveformer kan fås fra eksperimenter, hvor visuelle stimuli anvendes til at aktivere fotoreceptorer i kontrolrum forhold og i overværelse af farmakologiske midler til at isolere bidrag bestemt celle eller kredsløb. Injektion af forskellige kombinationer af disse ledningsevne waveforms afslører deres bidrag til spiking output. Brugen af dynamiske clamp optagelser også muligt manipulation af indholdet af baggrundsstøj, som kan finde sted under forskellige lys-tilpasning conditio ns. Endvidere kan konduktans bølgeformer også genereres ud fra modeller af synaptiske input, såsom alfa-funktioner, og også for synaptiske indgange med spænding afhængighed (dvs. NMDA-receptorer), samt for spændingsstyrede ionkanaler eller elektrisk koblede celler. Derfor sammenligninger mellem de forskellige vilkår åbner enorme muligheder for at forstå det bidrag forskellige synaptiske mekanismer til neuronale reaktioner og signalbehandling i neurale netværk. Det er vigtigt at bemærke, at selv når forskellige typer af ganglieceller udtrykker tydeligt forskellige typer og tætheder af spændingsstyrede kanaler, vi fandt, at resultaterne af integrationen af synaptiske konduktanser var konsekvente i celletyper. Således blev ændringer i forholdet og timingen af de stimulerende og hæmmende konduktanser tilsvarende udtryk i svarene selv spike frekvens, inter-spike intervaller og tilpasning egenskaber varierede efter celletype (data ikke vist).
ove_content "> Selvom dynamisk klemme giver mange fordele, der er nogle begrænsninger iboende til teknikken (for gennemgang, 7 se). En vigtig ene er, at ledningsevne injektion i soma ikke nødvendigvis et præcist synaptiske input medieret af receptorer og kanaler, der er specifikt fordelt langs membranen af dendritiske processer, og eventuelle ikke-lineære interaktioner, der kan forekomme i dendritter. Således kan konduktanser distalt for injektionsstedet simuleres kun ca. Selvom dynamisk klemme held blev anvendt på dendritter i pyramidale celler gør firedobbelt hel- celle optagelser 8, den morfologiske kompleksitet ganglioncelle dendritiske processer til hinder for en realistisk simulering af den rumlige fordeling af synapser ved at gøre dendritiske optagelser. Den strategi, der fremlægges her, bruger ledningsevne waveforms beregnet fra somatiske spænding-clamp eksperimenter, der også er afhængige af et punkt-source-elektrode og påtager lineære interaktioner mellem spænatory og hæmmende indgange, en antagelse bredt accepteret i samfundet. Således er disse undersøgelser giver væsentlige oplysninger om virkningerne af ændringer i synaptiske konduktanser på neuronal integration på niveau med de soma og axon højen.Vores eksperimenter ikke replikere fysiologiske reaktioner, der også rekrutterer spændingsåbnede konduktanser i ganglion celle dendritter. Dette kunne imidlertid også opnås ved at ændre modelligningerne så den aktuelle injicerede omfatter dendritiske konduktanser og kabel virkninger baseret på en multi-compartment-model (som beskrevet i 7).
En anden begrænsning er, at aktiviteten-afhængige ændringer, der modificerer neuronal respons, dvs ændringer i intracellulær calcium eller second messengers udløst ved aktivering af membran-kanaler eller receptorer ikke er gengivet i disse dynamiske clamp optagelser. Selvom vores model ikke beskæftige sig med det niveau af kompleksitet, som kan være sPECIFIKKE for nogle celletyper, blev simuleringer omfatter et calcium pool og calciumindløb til denne pulje i realtid baseret på de spændingsudsving i det optagede neuron succes gennemført 10.
Selv om en samplingfrekvens på 10 kHz ville præcist følge tidsforløbet af aktionspotentialer, vores optagelser i stedet brugt en sampling rate på 40 kHz. Denne højere samplingfrekvens der kræves for at opretholde stabiliteten i systemet og lade realistiske og yderst præcise optagelser (til gennemgang se 11).
Den eksperimentelle fremgangsmåde er beskrevet her ikke kræver at holde nethinden mørke-tilpasset. Konduktans bølgeformer opnået fra mørke-tilpasset retinae i fysiologiske betingelser blev anvendt til at beregne den strøm, der skal sprøjtes ind i cellen, på denne måde den aktuelle injicerede efterlignede fysiologisk stimulering med lys. Ikke desto mindre ville det stadig være muligt at holde vævet mørke tilpasset og dermed være i stand til compare svarene på conductance injektion med dem for lys stimulation. I dette tilfælde, fysiologiske egenskaber af ganglieceller (, respons polaritet dvs ON, OFF eller ON-OFF, rumlige og tidsmæssige frekvens følsomhed, retning selektivitet, etc.) kunne klassificeres før anvendelsen af forskellige ledningsevne kurveformer at vurdere, hvorvidt indsprøjtning af konduktanser fra en særlig celletype har forskellige virkninger afhængigt af den celletype, de anvendes på.
Samlet mener vi, at dynamisk klemme er en meget kraftfuld teknik til at hjælpe afsløre samspillet mellem stimulerende og hæmmende synaptiske input, der genererer neuronal output, for at undersøge, hvilken rolle de forskellige spændingsåbnede konduktanser i neuronfyring samt at afprøve hypoteser om synaptiske mekanismer . Anvendelsen af denne teknik i nethinden er især nyttigt, da de synaptiske input onto flere ganglion celletyper er blevet grundigt karakterisered som en funktion af det fysiologiske stimulus. Ligeledes kan denne fremgangsmåde give indsigt i funktionen af neuronale kredsløb i andre områder af det centrale nervesystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle procedurer blev først godkendt af Animal Care Ethics Committee of The University of Sydney, og derefter foretages i overensstemmelse med retningslinjerne i den australske kodeks for Pleje og anvendelse af dyr til videnskabelige formål (National Health og Medical Research Council i Australien ).
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af Australian Research Council (ARC DP0988227) og Biomedical Science Research Initiative Grant fra Discipline of Biomedical Science, The University of Sydney. Udstyret Patch Clamp Forstærker EPC 8 blev finansieret af Startup fonden fra Discipline of Biomedical Science, The University of Sydney. Udstyret InstruTECH LIH 8 +8 Data Acquisition System blev købt med midler fra Rebecca L. Cooper Foundation og Startup fonden fra Discipline of Biomedical Science, The University of Sydney. Vi vil gerne takke de anonyme korrekturlæsere for deres indsigtsfulde forslag og kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Micr–lectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation | ||
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -S. Foundations of cellular neurophysiology. , The MIT Press. London. (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).
- Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
