Summary

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Published: May 16, 2013
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Summary

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Abstract

As células são os neurónios do gânglio da retina de saída e da sua actividade reflecte a integração de múltiplas entradas sinápticas neuronais decorrentes de circuitos específicos. Técnicas de patch clamp, na braçadeira de tensão e configurações de fixação atuais, são comumente usados ​​para estudar as propriedades fisiológicas dos neurônios e caracterizar suas entradas sinápticas. Embora a aplicação destas técnicas é altamente informativos, que representam várias limitações. Por exemplo, é difícil de quantificar a forma como as interacções precisas das entradas excitatórios e inibitórios determinar saída de resposta. Para resolver esse problema, usamos uma técnica de modificação actual braçadeira, braçadeira de dinâmica, também chamada de condutância braçadeira 1, 2, 3 e examinou o impacto dos insumos sinápticos excitatórios e inibitórios na excitabilidade neuronal. Esta técnica requer a injecção de corrente para dentro da célula e é dependente da realimentação em tempo real o seu potencial de membrana em que o tempo. O INJECTEd atual é calculado a partir predeterminados condutâncias sinápticos excitatórios e inibitórios, suas potencialidades e potencial reversão instantânea membrana da célula. Os detalhes sobre os procedimentos experimentais, as células de fixação adesivo para conseguir uma configuração de célula inteira e emprego da técnica de fixação dinâmico são ilustradas neste artigo de vídeo. Aqui, mostramos as respostas das células ganglionares da retina de rato a várias formas de onda de condutância obtidos a partir de experiências de controlo em condições fisiológicas, ou na presença de fármacos. Além disso, mostram o uso de condutâncias excitatórios e inibitórios artificiais gerados usando funções alfa para investigar as respostas das células.

Introduction

A retina é um tecido neural quase transparente que reveste a parte de trás do olho. Muitos estudos utilizam a retina como modelo para investigar os primeiros passos de processamento visual e os mecanismos de sinalização sinápticos. Uma vez que a rede de retina na preparação de toda a montagem permanece intacta após a dissecação,, representa um sistema ideal para estudar interacções sinápticas como as suas respostas fisiológicas são muito semelhantes à condições in vivo. Assim, usando uma retina isolado as propriedades de seus neurônios pode ser estudado usando técnicas de patch clamp (por comentários sobre a técnica, ver 6,9,13). Identificação da contribuição exacta dos circuitos e de neurotransmissores na resposta a células ganglionares específicos, no entanto, é geralmente dificultado actuar como agentes farmacológicos em vários sites.

Respostas fisiológicas de neurônios da retina à luz, a estímulos naturais, podem ser gravados com pipetas de vidro preenchidos com fluido intracelular. Usando cl remendotécnicas ampères, respostas neuronais à estimulação de luz pode ser registrado como flutuações potenciais de membrana (pinça de corrente) ou como correntes (braçadeira de tensão). Ao manter o potencial de membrana a voltagens diferentes e execução de uma análise de condutância a posteriori, é possível isolar entradas sinápticos excitatórios e inibitórios 5,12. Este tipo de experiências pode ser levada a cabo em meio de banho normal e na presença de diferentes agentes farmacológicos para isolar a contribuição de diferentes neurotransmissores e receptores para respostas neuronais. A riqueza de estudos de muitos laboratórios caracteriza a dependência da cravação de saída e entradas excitatórios e inibitórios em propriedades de estímulo, como o tamanho, o contraste, frequências espaciais e temporais, direção, orientação e outras variáveis ​​de estímulo. Embora essas abordagens experimentais fornecem informações sobre a relação entre a saída de pico e entradas sinápticas em função das propriedades de estímulo,interpretação da contribuição de tipos específicos de células e suas entradas sinápticas a excitabilidade das células não é simples. Isto é devido ao facto de as entradas geralmente estimulantes e inibidores variar com as propriedades de estímulo e, assim, não é possível avaliar com precisão o impacto que as alterações em qualquer destas entradas tem sobre spiking neuronal.

Uma abordagem alternativa para contornar essas limitações é realizar gravações braçadeira dinâmicos, que permitem uma avaliação crítica da contribuição de entradas sinápticas individuais para cravação de saída. A técnica de fixação dinâmica permite que a injecção directa de corrente para dentro da célula e a quantidade de corrente injectada num dado tempo depende do potencial da membrana registado naquele momento 1,2,3 (para revisão, ver 7,14). É uma pinça de corrente modificado set-up onde um tempo real, a interacção entre o retorno rápido de células sob o equipamento de gravação e que compreende hardware especializado, softwaree um computador é alcançado. A quantidade de corrente injectada para dentro da célula é calculado de acordo. Assim, a vantagem deste método é que a célula pode ser estimulada com diferentes combinações de formas de onda de condutância, e da sua resposta vai imitar a activação dos receptores que medeiam as entradas sinápticas. Por exemplo, a comparação da resposta à injecção de condutâncias excitatórios e inibitórios para um pequeno ponto com a resposta à injecção de condutância excitatória para uma pequena mancha apenas fornece informação sobre os efeitos da inibição da resposta celular. Da mesma forma, outras combinações de condutâncias fisiologicamente gravados podem ser co-injetado para revelar como as mudanças nas condutâncias excitatórios e / ou inibitórios estímulo-dependente afeta a saída de pico.

No nosso estudo, a técnica de fixação dinâmico é usado para demonstrar o impacto da amplitude relativa e de sincronização de entradas sinápticas nas propriedades de queima de células ganglionares da retina. Vários condutânciasobtidas a partir de experiências de controlo, em condições fisiológicas, ou na presença de agentes farmacológicos foram utilizados como entradas. Além disso, as condutâncias artificiais baseados em funções alfa também foram utilizados para investigar a forma como entradas sinápticas são integrados pelos neurónios. Assim, esta é uma técnica versátil, que permite que os vários tipos de condutância gerado ou fisiologicamente ou farmacologicamente computacionalmente para ser injectado na mesma célula ganglionar, para comparação de respostas a estas entradas podem ser feitas.

Protocol

1. Geral Configuração e Preparação Tissue Mantenha o mouse na escuridão por 30 min (visam reduzir o seu nível de stress). Enquanto espera, se preparar uma solução de L extracelular. Primeiro dissolver 1,9 g de bicarbonato de sódio em meio litro de água Milli-Q. O seu pH é mantido a 7,4 por borbulhamento com 95% de O2 e 5% de CO 2. Cinco minutos mais tarde, dissolver 8,8 g de Ames Médio em 100 ml de água Milli-Q, adicionar à solução de bicarbonato de sódio, superior até …

Representative Results

A contribuição das diferentes fontes de entradas inibitórias para as respostas das células ganglionares é demonstrado através da aplicação de vários condutância formas de onda. Estas formas de onda foram obtidos com estímulos de luminância diferente, em condições normais e na presença de TTX, um bloqueador por voltagem canal de Na + que bloqueia acção potencial de geração de apenas um subconjunto dos interneurónios inibitórios da retina. Figura 2A mostra uma resposta repr…

Discussion

Aqui demonstramos a utilização de uma pinça dinâmico para avaliar a influência da proporção e temporização relativa de excitação e de inibição sobre a produção de células ganglionares da retina. Braçadeira dinâmica faz uso de simulações de computador para introduzir condutâncias sinápticas fisiologicamente gravados ou artificial em neurônios vivos. Esta metodologia proporciona uma ferramenta interactiva através da qual pode ser modificado condutâncias e injectado neurónios para se calcular a su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pelo Conselho Australiano de Pesquisa (ARC DP0988227) eo Biomedical Science Research Initiative Grant da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. O Amplificador de patch clamp equipamento EPC 8 foi financiado pelo Fundo de inicialização a partir da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. O equipamento Instrutech LIH 8 8 Sistema de Aquisição de Dados foi comprado com os fundos de Rebecca L. Cooper Foundation e do Fundo de inicialização a partir da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. Gostaríamos de agradecer aos revisores anônimos por suas sugestões e comentários perspicazes.

Materials

      Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic Pharmachem    
Ames Medium with L-Glutamate (Powder) Sigma-Aldrich    
Potassium Gluconate, Anhydrous Sigma-Aldrich    
HEPES Sodium salt Sigma-Aldrich    
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) Sigma-Aldrich    
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich    
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid Sigma-Aldrich    
Paraformaldehyde Powder, 95% Sigma-Aldrich    
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) Invitrogen    
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml Invitrogen    
Fluorescent Preserving Media BioFX Laboratories Inc.    
      Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) Warner Instruments 64-0794  
Single Stage Glass Microelectrode Puller Narishinge Japan Model PP-830  
Minipuls 2 Gilson    
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit Millipore Corporation SLGV004SL  
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G Smith & Nephew (Australia)    
Single Inline Solution Heater Warner Instruments Model SH-27B  
Dual Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-344B  
Olympus Stereomicroscope SZ61 Olympus Corporation    
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective Olympus Corporation    
0-30 V 2.5 A DC Power Supply Dick Smith Electronics Q1770  
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool Jenoptik    
Micromanipulator MP-225 Sutter Instrument Company    
Patch Clamp Amplifier EPC 8 HEKA Elektronik    
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System HEKA Elektronik    
Computer: DELL Dell Corporation    

References

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Cite This Article
Huang, J. Y., Stiefel, K. M., Protti, D. A. Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (75), e50400, doi:10.3791/50400 (2013).

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