Summary

Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

Published: May 16, 2013
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Summary

In questo articolo il video illustra il set-up, le procedure per applicare le patch corpi cellulari e come implementare le registrazioni dinamiche clamp da cellule gangliari in tutto il montaggio del mouse retine. Questa tecnica permette l'indagine del contributo preciso di input sinaptici eccitatori e inibitori, e la loro portata, il tempo di spiking neuronale.

Abstract

Cellule gangliari sono i neuroni della retina uscita e la loro attività riflette l'integrazione di più ingressi sinaptici derivanti da specifici circuiti neurali. Tecniche di patch clamp, in morsetto di tensione e di configurazioni di corrente con la pinza, sono comunemente usati per studiare le proprietà fisiologiche dei neuroni e di caratterizzare i loro ingressi sinaptici. Anche se l'applicazione di queste tecniche è altamente informativo, essi rappresentano varie limitazioni. Ad esempio, è difficile quantificare le interazioni precise di ingressi eccitatori e inibitori determinano output di risposta. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato una tecnica modificata corrente morsetto, morsetto dinamica, detto anche conduttanza morsetto 1, 2, 3 e ha esaminato l'impatto di input sinaptici eccitatori e inibitori di eccitabilità neuronale. Questa tecnica richiede l'iniezione di corrente nella cella e dipende dal feedback in tempo reale del suo potenziale di membrana in quel momento. Il injectéd attuale è calcolato a partire predeterminati conduttanze sinaptiche eccitatorie ed inibitorie, le loro potenzialità di inversione e istantanea potenziale di membrana della cellula. Dettagli sulle procedure sperimentali, la patch di serraggio cellule per ottenere una cellula intera configurazione e impiego della tecnica di serraggio dinamica sono illustrati in questo articolo il video. Qui vi mostriamo le risposte di topo cellule gangliari della retina a varie forme d'onda conduttanza ottenuti da esperimenti fisiologici in condizioni di controllo o in presenza di farmaci. Inoltre, mostriamo l'utilizzo di conduttanze eccitatori e inibitori artificiali generati utilizzando le funzioni alfa per indagare le risposte delle cellule.

Introduction

La retina è un tessuto neurale quasi trasparente che riveste la parte posteriore dell'occhio. Molti studi utilizzano la retina come modello per studiare i primi passi nel processo visivo e meccanismi di segnalazione sinaptica. Poiché la rete retinica nel preparato tutto il montaggio rimane intatto dopo la dissezione, rappresenta un sistema ideale per studiare le interazioni sinaptiche come sue risposte fisiologiche sono molto simili a condizioni in vivo. Così, utilizzando una retina isolata proprietà dei suoi neuroni possono essere studiati con tecniche di patch clamp (per recensioni su questa tecnica, vedere 6,9,13). Identificazione dell'esatto contributo di circuiti e neurotrasmettitori alla risposta delle cellule gangliari specifici, tuttavia, è di solito ostacolata come agenti farmacologici agiscono su vari siti.

Risposte fisiologiche dei neuroni della retina alla luce, lo stimolo naturale, possono essere registrati con pipette di vetro riempiti di liquido intracellulare. Utilizzando cerotto cltecniche di amplificazione, le risposte neuronali alla stimolazione luminosa possono essere registrati come potenziale di membrana fluttuazioni (pinza amperometrica) o come correnti (morsetto di tensione). Tenendo il potenziale di membrana con diverse tensioni e attuare una analisi conduttanza posteriori, è possibile isolare input sinaptici inibitori ed eccitatori 5,12. Questo tipo di esperimenti può essere effettuata in normale medio balneazione e in presenza di agenti farmacologici differenti per isolare il contributo delle varie neurotrasmettitori e recettori per risposte neuronali. Un patrimonio di studi da molti laboratori caratterizza la dipendenza di chiodare di uscita e ingressi eccitatori e inibitori sulle proprietà di stimolo come la dimensione, contrasto, frequenze spaziali e temporali, la direzione, l'orientamento e altre variabili di stimolo. Anche se questi approcci sperimentali forniscono informazioni circa il rapporto tra la produzione e il picco ingressi sinaptici in funzione delle proprietà di stimolo,interpretazione del contributo di specifici tipi cellulari e le loro ingressi sinaptici a eccitabilità delle cellule non è semplice. Ciò è dovuto al fatto che gli ingressi tipicamente sia eccitatori e inibitori variano con proprietà di stimolo e, quindi, non è possibile valutare l'impatto esatto che cambiamenti in uno di questi ingressi ha sulla spiking neuronale.

Un approccio alternativo per aggirare queste limitazioni è quello di effettuare registrazioni morsetto dinamici, che consentono una valutazione critica del contributo dei singoli ingressi sinaptici a chiodare uscita. La tecnica di clamp dinamico consente l'iniezione diretta di corrente nella cella e la quantità di corrente iniettata in un dato tempo dipende dal potenziale di membrana rilevato all'epoca 1,2,3 (per una rassegna, cfr 7,14). È una pinza amperometrica modificato set-up in cui un'interazione feedback in tempo reale, rapida tra la cella sotto registrazione e l'apparecchiatura comprendente hardware specializzato, softwaree un computer è raggiunto. La quantità di corrente iniettata nella cellula viene calcolato di conseguenza. Quindi, il vantaggio di questo metodo è che la cellula può essere stimolato con diverse combinazioni di forme d'onda conduttanza, e la sua risposta sarà mimare l'attivazione di recettori che mediano ingressi sinaptici. Per esempio, il confronto della risposta alla iniezione di conduttanze eccitatori e inibitori per un piccolo punto con la risposta a iniezione di conduttanza eccitatoria per una piccola macchia fornisce solo informazioni sull'impatto di inibizione sulla risposta cellulare. Allo stesso modo, altre combinazioni di conduttanze fisiologicamente registrati possono essere co-iniettata per rivelare come i cambiamenti nella conduttanza eccitatorie e / o inibitorie stimolo-dipendente influisce uscita picco.

Nel nostro studio, la tecnica del clamp dinamico viene utilizzato per dimostrare l'impatto della ampiezza relativa e tempistica di input sinaptici sulle proprietà lancio di cellule gangliari retiniche. Vari conduttanzeottenuti da esperimenti fisiologici in condizioni di controllo o in presenza di agenti farmacologici sono stati impiegati come ingressi. Inoltre, conduttanze artificiali basati su funzioni alfa sono stati utilizzati anche per studiare come ingressi sinaptici sono integrati dai neuroni. Così questa è una tecnica versatile che consente vari tipi di conduttanza generati in modo fisiologicamente, farmacologicamente o computazionalmente per essere iniettato nella stessa cellula gangliare, così confronto delle risposte a questi ingressi può essere fatto.

Protocol

1. Generale Set Up e Preparazione del tessuto Mantenere il mouse al buio per 30 min (mirare a ridurre il suo livello di stress). Durante l'attesa, preparare 1 L di soluzione extracellulare. Prima sciogliere 1,9 g di bicarbonato di sodio in mezzo litro di acqua Milli-Q. Il suo pH è mantenuto a 7,4 facendo gorgogliare 95% O 2 e 5% di CO 2. Cinque minuti dopo, sciogliere 8,8 g di Ames medio in 100 ml di acqua Milli-Q, aggiungere alla soluzione di bicarbonato di sodio, alto fino a 1 L c…

Representative Results

Il contributo delle diverse fonti di input inibitorio per le risposte delle cellule gangliari è dimostrata attraverso l'applicazione di varie forme d'onda conduttanza. Queste forme d'onda sono stati ottenuti con stimoli di diversa luminanza in condizioni normali e in presenza di TTX, una tensione-gated Na + bloccante dei canali che un'azione blocchi generazione potenziale solo in un sottoinsieme di inibitori interneuroni retinici. Figura 2A mostra una risposta rappresentativo…

Discussion

Qui mostriamo l'uso di clamp dinamico per valutare l'influenza del rapporto e relativa tempistica di eccitazione e di inibizione sulle cellule gangliari retiniche uscita. Morsetto dinamica fa uso di simulazioni al computer per introdurre conduttanze sinaptiche fisiologicamente registrati o artificiale in neuroni viventi. Questa metodologia fornisce uno strumento interattivo con cui conduttanze possono essere modificati e iniettate in neuroni per calcolare la loro influenza sulle risposte neuronali. Conduttanza f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato dal Consiglio di Ricerca Australiano (ARC DP0988227) e il Biomedical Science Research Initiative di Grant dalla disciplina di Scienze Biomediche, Università di Sydney. L'apparecchiatura Patch Clamp Amplificatore EPC 8 è stato finanziato dal Fondo di avvio dal Disciplinare di Scienze Biomediche, Università di Sydney. L'attrezzatura InstruTECH LIA 8 +8 sistema di acquisizione dati è stato acquistato con i fondi da Rebecca L. Cooper Fondazione e Fondo di avvio dal Disciplinare di Scienze Biomediche, Università di Sydney. Vorremmo ringraziare i revisori anonimi per i loro suggerimenti e commenti penetranti.

Materials

      Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic Pharmachem    
Ames Medium with L-Glutamate (Powder) Sigma-Aldrich    
Potassium Gluconate, Anhydrous Sigma-Aldrich    
HEPES Sodium salt Sigma-Aldrich    
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) Sigma-Aldrich    
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich    
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid Sigma-Aldrich    
Paraformaldehyde Powder, 95% Sigma-Aldrich    
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) Invitrogen    
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml Invitrogen    
Fluorescent Preserving Media BioFX Laboratories Inc.    
      Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) Warner Instruments 64-0794  
Single Stage Glass Microelectrode Puller Narishinge Japan Model PP-830  
Minipuls 2 Gilson    
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit Millipore Corporation SLGV004SL  
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G Smith & Nephew (Australia)    
Single Inline Solution Heater Warner Instruments Model SH-27B  
Dual Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-344B  
Olympus Stereomicroscope SZ61 Olympus Corporation    
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective Olympus Corporation    
0-30 V 2.5 A DC Power Supply Dick Smith Electronics Q1770  
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool Jenoptik    
Micromanipulator MP-225 Sutter Instrument Company    
Patch Clamp Amplifier EPC 8 HEKA Elektronik    
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System HEKA Elektronik    
Computer: DELL Dell Corporation    

References

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Cite This Article
Huang, J. Y., Stiefel, K. M., Protti, D. A. Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (75), e50400, doi:10.3791/50400 (2013).

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