Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Summary

Dieses Video zeigt die Artikel-Set-up, die Verfahren zum Zellkörper patchen und wie man dynamische Clamp Messungen von Ganglienzellen in whole-mount Maus retinae umzusetzen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der genauen Anteil von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge und ihre relative Größe und den Zeitpunkt zu neuronalen Spiking.

Abstract

Ganglienzellen sind die Ausgangs-Neuronen der Netzhaut und ihre Tätigkeit spiegelt die Integration von mehreren synaptischen Eingänge auf Grund von spezifischen neuronalen Schaltkreisen. Patch-Clamp-Technik, in Voltage-Clamp und Stromzange Konfigurationen, werden häufig verwendet, um die physiologischen Eigenschaften von Neuronen zu untersuchen und ihre synaptischen Eingänge zu charakterisieren. Obwohl die Anwendung dieser Techniken ist sehr informativ, stellen sie verschiedene Einschränkungen. Zum Beispiel ist es schwierig zu quantifizieren, wie die genauen Wechselwirkungen der erregenden und hemmenden Eingänge Antwortausgabe bestimmen. Um dieses Problem anzugehen, verwendeten wir eine modifizierte Strom-Clamp-Technik, dynamische Klemme, die auch als Leitwert Klemme ^{1, 2, 3} und untersuchte den Einfluss von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge auf die neuronale Erregbarkeit. Diese Technik erfordert die Injektion von Strom in die Zelle und ist abhängig von der Echtzeit-Feedback der Membranpotential zu dieser Zeit. Die INJECTEd Strom von vorgegebenen erregende und hemmende synaptische Leitwerte, ihre Potenziale und Umkehrung der Zelle momentanen Membranpotential berechnet. Details zu den experimentellen Verfahren werden Patch-Clamp-Zellen, um eine Whole-Cell-Konfiguration und Einsatz der dynamischen Clamp-Technik erreichen in diesem Video-Artikel dargestellt. Hier zeigen wir die Antworten der Maus retinalen Ganglienzellen auf verschiedene Wellenformen Leitwert von physiologischen Experimenten unter Kontrolle Bedingungen oder in Gegenwart von Medikamenten erhalten. Darüber hinaus zeigen wir die Verwendung von künstlichen erregenden und hemmenden Leitwerte generiert unter Verwendung von Alpha-Funktionen, um die Reaktionen der Zellen zu untersuchen.

Introduction

Die Netzhaut ist eine nahezu transparente neuronalen Gewebe an der Rückseite des Auges. Viele Studien verwenden die Netzhaut als Modell, um die ersten Schritte in der visuellen Verarbeitung und Mechanismen der synaptischen Signalisierung zu untersuchen. Da die Netzhaut Netzwerk in der whole-mount Vorbereitung bleibt nach Dissektion, stellt es ein ideales System, um synaptische Interaktionen zu untersuchen, wie ihre physiologischen Reaktionen sehr ähnlich zu der in vivo-Bedingungen sind. Somit ist die Verwendung eines isolierten Netzhaut die Eigenschaften der Neuronen untersucht mittels Patch-Clamp-Verfahren (für Bewertungen auf der Technik, siehe ^6,9,13) werden kann. Ermittlung des genauen Beitrag der spezifischen Schaltungen und Neurotransmitter Ganglienzellen Reaktion wird jedoch üblicherweise behindert als pharmakologische Wirkstoffe an unterschiedlichen Standorten handeln.

Physiologische Reaktionen von retinalen Neuronen mit Licht, die natürliche Reiz, kann mit Glas-Pipetten mit intrazellulären Flüssigkeit gefüllt aufgezeichnet werden. Mit Patch clamp Techniken, neuronale Reaktionen auf Licht Stimulation kann als Membranpotential Schwankungen (Stromzange) oder als Ströme (Voltage-Clamp) aufgezeichnet werden. Durch Halten des Membranpotentials mit unterschiedlichen Spannungen und Umsetzung einer posteriori Leitfähigkeit Analyse ist es möglich, zu isolieren und hemmende erregenden synaptischen Eingänge ^5,12. Diese Art der Experimente sind in normalen Badmedium und in Gegenwart von verschiedenen pharmakologischen Mitteln, um den Beitrag von verschiedenen Neurotransmittern und Rezeptoren auf neuronale Reaktionen isolieren durchgeführt werden. Eine Fülle von Studien aus vielen Laboratorien dadurch die Abhängigkeit der Spick-Ausgang und erregenden und hemmenden Eingänge Reiz Eigenschaften wie Größe, Kontrast, räumlichen und zeitlichen Frequenzen, Richtung, Orientierung und anderen Stimulus Variablen. Obwohl diese experimentelle Ansätze liefern Informationen über die Beziehung zwischen Spike Ausgang und synaptische Eingänge in Abhängigkeit von Stimulus-Eigenschaften,Interpretation des Beitrags spezifische Zelltypen und deren synaptische Eingänge Zellerregbarkeit ist nicht einfach. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass in der Regel sowohl erregenden und hemmenden Eingänge mit Stimulus Eigenschaften variieren und somit ist es nicht möglich, die genaue Wirkung, dass Änderungen in diesen beiden Eingängen auf neuronale Spiking bewerten.

Ein alternativer Ansatz, diese Einschränkungen zu umgehen, ist die Durchführung von dynamischen Clamp Messungen, die eine kritische Bewertung des Beitrags der einzelnen synaptischen Eingänge Spick Ausgang zu ermöglichen. Die dynamische Clamp-Technik erlaubt die direkte Injektion von Strom in die Zelle und die Menge der injizierten Strom zu einem bestimmten Zeitpunkt hängt von der aufgezeichneten Membranpotential damals ^1,2,3 (für eine Übersicht siehe ^7,14). Es ist eine modifizierte Stromzange Set-up, wo ein Echtzeit-, schnelles Feedback Interaktion zwischen der Zelle unter Aufnahme und der Ausrüstung, die spezielle Hardware, Softwareund einen Computer erzielt wird. Die Strommenge, die in die Zelle injiziert wird entsprechend berechnet. Daher ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass die Zelle mit verschiedenen Kombinationen von Leitfähigkeit Wellenformen stimuliert werden kann, und die Antwort wird die Aktivierung von Rezeptoren, die synaptischen Eingänge vermitteln imitieren. Zum Beispiel der Vergleich der Reaktion auf Injektion von erregenden und hemmenden Leitwerte für einen kleinen Ort mit der Antwort auf Injektion von erregenden Leitwert für einen kleinen Ort nur Informationen über die Auswirkungen der Hemmung auf Zell-Antwort. Ebenso können andere Kombinationen von physiologisch aufgezeichnet Leitwerte co-injiziert werden zu zeigen, wie Stimulus-abhängigen Veränderungen in erregenden und / oder hemmenden Leitfähigkeiten beeinflussen Spike Ausgang.

In unserer Studie wird die dynamische Clamp-Technik verwendet, um die Auswirkung der relativen Amplitude und Zeitpunkt der synaptischen Eingänge der Brenneigenschaften von retinalen Ganglienzellen demonstrieren. Verschiedene Leitwerteerhalten von physiologischen Experimente in Steuerbedingungen oder in Gegenwart von pharmakologischen Mitteln wurden als Eingänge verwendet. Darüber hinaus wurden künstliche Leitwerte auf alpha-Funktionen basierend auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie synaptische Eingänge von den Neuronen integriert sind. Somit ist eine vielseitige Technik, die verschiedene Typen von Leitfähigkeit erzeugt entweder physiologisch oder pharmakologisch rechnerisch in die gleiche Ganglienzellen injiziert werden, so Vergleich der Antworten auf diese Eingaben vorgenommen werden können.

Protocol

1. Allgemeine Einrichten und Tissue Vorbereitung

1. Halten Sie die Maus in der Dunkelheit für 30 min (Zweck hat, ihren Stress zu reduzieren). Während des Wartens, bereiten 1 L von extrazellulären Lösung. Zunächst löst 1,9 g Natriumhydrogencarbonat in einem halben Liter Milli-Q-Wasser. Ihr pH-Wert wird bei 7,4 durch Durchblasen mit 95% O ₂ und 5% CO ₂ gehalten. Fünf Minuten später auflösen 8,8 g Ames Medium in 100 ml Milli-Q Wasser, fügen Sie der Natriumhydrogencarbonat-Lösung, oben bis zu 1 L mit Milli-Q-Wasser und gut mischen. Diese Lösung wird für den Rest des Experiments carboxygenated.
2. Nehmen Sie 250 ml des carboxygenated Ames Medium und stellen Sie die Flüssigkeit Reperfusion System in der elektrophysiologischen Set-up. Halten Sie die Lösung carboxygenated.
3. Einheitlich Abstrich eine dünne Schicht Vakuumfett auf der Unterseite des Perfusionskammer. Seal es mit einem Deckglas und sicherzustellen, dass es luftdicht. Nehmen Sie eine kleine Menge Fett (~ 2 mm im Durchmesser) und platzieren Sie es auf der Oberseite undunteren Enden der Kammer. Diese Kugeln werden das Raster (Platin-Rahmen mit Zahnseide besaitet) in Position zu halten und verhindern, dass es zu hart drücken auf der Netzhaut. Fix die Kammer auf die Plattform und richten die beiden Öffnungen.
4. Das Tier ist mit Isofluran betäubt zuerst für 2 min, und dann durch Genickbruch getötet. Schnelles Entfernen Augen mit einer kleinen Schere (Schaufeln), gründlich mit carboxygenated extrazellulären Flüssigkeit in ein kleines Becherglas, und legen Sie dann in einer Petrischale mit carboxygenated extrazellulären Flüssigkeit gefüllt.
5. Unter dem Binokular, stellen ein Einführloch in der Hornhaut (~ 2 mm von der Kante) mit einem 19-Gauge-Nadel. Wiederholen Sie für das andere Auge. Dieser wichtige Schritt sollte schnell sein, um Sauerstoffversorgung sowohl retinae ermöglichen. Entfernen Sie eine Hornhaut mit einem kleinen Paar Iris Schere durch Schneiden parallel zu dessen Rand. Dann entfernen Sie den Iris und Linse mit einer feinen Pinzette. Wiederholen Sie für das andere Auge. Übertragen Sie ein Auge cup in ein Becherglas mitcarboxygenated extrazellulären Lösung.
6. Mit einem Skalpell, schnitt ein Auge Tasse in die Hälfte, in der Lage sein, um die whole-mount glätten und zu zwei Ganzkörper-Aufnahmen pro Netzhaut erhalten. Sorgfältig trennen die Netzhaut vom Pigmentepithel mit einem stumpfen Sezieren Sonde oder indem Sie es vorsichtig aus. Einmal gelöst, ist die Netzhaut ziemlich transparent. Beachten Sie die konvexe Oberfläche ist die Photorezeptoren Seite. Die konkave Oberfläche der Ganglienzellen Seite und es können sich aufgrund des Vorhandenseins von klebrigen Glaskörper haften.
7. Mit einer feinen Pinzette, halten Sie den Rand der abgelösten Netzhaut Gewebe in der Nähe der Ora serrata und greifen die ora serrata mit einem anderen Paar von feinen Pinzette, ziehen Sie sie in Richtung der Mitte der Netzhaut. Dies ist ein schwieriger Prozess und kann ein paar Versuche dauern. Wenn dies gelingt, sind ora serrata, Ziliarkörper und Glaskörper durch dieses Verfahren entfernt, und die Krümmung der Netzhaut verringert wird (dh flacher).
8. Schneiden Sie die Kanten, und dann übertragen sie auf die Pro-Fusion Kammer mit Ganglienzellen nach oben. Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle, indem das Gitter auf den Fett-Bälle. Legen Sie das verbleibende Gewebe mit dem anderen Auge Tasse für die spätere Verwendung. Ähnliche Verfahren zur retinalen Dissektion in Middleton und Protti ¹⁶ und Pottek et al. ^17.
9. Montieren Sie die Aufnahme Kammer unter einem aufrechten Mikroskop. Unmittelbar Einrichten der kontinuierliche Perfusion der Netzhaut mit carboxygenated extrazellulären Lösung (35,5 ° C) bei einer Geschwindigkeit von 3 - 5 ml / min. Stellen Sie sicher, dass die Masse-Elektrode ist an Ort und Stelle.
10. An dem Mikroskop ist eine digitale Kamera ermöglicht die Visualisierung des Gewebes. Das ganze Set up sitzt über einem Luft-Tabelle (Stoßdämpfung) und innerhalb eines Faradayschen Käfigs (Blöcke externe statische und nicht-statische elektrische Felder).
11. Schalten Sie die Lichtquelle (Infrarot,> 850 nm) und einem 40X-Objektiv, bringen ihren Fokus auf die Zellkörper der Ganglienzellen. Finden Sie den zentralen Bereich der whole-mount für recording.
12. Auftauen eine gefrorene Flasche K ⁺ basierte intrazellulären Lösung (300 ul, pH = 7,4), die (in mM) K-Gluconat: 140, HEPES Säure: 10, MgCl _2: 4.6, ATP-Na ^+: 4, GTP-Na ⁺ : 0,4 und EGTA: 10. Alle Reagenzien von Sigma-Aldrich.

2. Patching Zellkörper der retinalen Ganglienzellen

1. Erstes Feuer polieren die Enden der Kapillare Borosilikatglas Glasröhren, dann ziehen Sie sie mit einem Glasmikroelektrode Abzieher mit zwei Heizstufen (Widerstand: 5 - 8 MQ).
2. In 3 ul Lucifer Yellow (Endkonzentration 0,2%) auf die intrazelluläre Lösung, gut mischen und zentrifugieren es. Als nächstes übertragen Sie die oberen 85% der Lösung in eine 1 ml Spritze, verbinden Sie es mit einem 0,22 um f ilter Einheit, dann zu einem 30 G wiederverwendbar Injektionsnadel. Kühlen.
3. Befestigen Sie die Glaspipette ähnlicher Größe wie die Spitze für Aufnahmen verwendet, in seiner Halterung und verschieben Sie sie unter dem Mikroskop mit einem micromanipulator. Unter einem 40X-Objektiv, langsam wieder die Pipette, bis er eine kleine Grübchen auf der Oberfläche der inneren Grenzmembran macht. Vorsichtig voran die Pipette nach vorne, bis es eine kleine Menge an Gewebe fängt, und bewegen Sie ihn dann nach oben und / oder seitlich ein kleines Loch, um die Zellkörper der Ganglienzellen aussetzen reißen. Je kleiner das Loch, desto höher ist der Grad der Integrität der Netzhaut Netzwerk aufrechterhalten wird. Falls gewünscht, Sulforhodamin 101 (SR101; 0,5-1 uM) kann in das extrazelluläre Medium zu beschädigten Nervenzellen durch Fluoreszenzmikroskopie ¹⁵ Bezeichnung hinzugefügt werden.
4. Füllen Sie eine saubere Pipette mit 8 - 10 ul der intrazellulären Lösung. Legen Sie es in die Halterung an der Verstärker-Kopf Bühne und stellen Sie sicher, das chlorierte Silberchloridelektrode eingetaucht ist. Verwerfen, wenn Schmutz und / oder Luftblasen vorhanden ist / sind.
5. Schalten Sie alle Geräte. Wir verwendeten einen EPC-8 Patch-Clamp-Verstärker von PatchMaster gesteuert Ganzzellableitungen in Voltage-Clamp-con erreichenFiguration. Beachten Sie, dass andere Verstärker, die Stromzange Aufnahmen erlauben im schnellen Modus können ebenfalls verwendet werden. Übernehmen und pflegen Überdruck in der Pipette Lösung. Markieren Sie eine Zelle mit einer großen Zellkörper so wahrscheinlich ist es ein Ganglienzellen anstatt einer verschobenen Amakrinzell oder Gliazellen. Langsam senken die Pipettenspitze so machen es ist ein kleines Grübchen auf der Oberfläche der Membran, zu stoppen und den Druck. Unmittelbar senken halten Potenzial - 60 mV. Sobald ein Giga (GOhm) zwischen ihnen erreicht wird, sanft zu saugen, um die Membran zu brechen, um eine Whole-Cell-Patch-Clamp-Konfiguration zu erzielen. Dieses Verfahren ist eine feine Schritt, wenn zu viel Unterdruck angelegt wird, wird die Verbindung undicht wird, wenn zu wenig, bleibt die Membran intakt.
6. Im Laufe der Zeit wird Lucifer Yellow füllen die Zelle, wodurch die Visualisierung der Zelle Morphologie. Wenn stabil, sollte dieses Set-up dauern 30 min oder mehr.

3. Aufnahmen von Ganglienzellen Mit Dynamitec Clamp

1. Zunächst wird eine Strom-Spannungs-Test (von - 75 bis + 35 mV alle 10 mV) wird unter Verwendung PatchMaster. Gehen Sie zu einem späteren Zeitpunkt Tests nur dann, wenn eine große Na ⁺ Strom (> 1 nA) vorhanden ist. Beachten Sie, dass in den seltenen Fällen, wo ein verschobener Amakrinzell gepatcht wird, in diesem Fall wird nicht mit Zügen der Aktionspotentiale nachfolgende Strominjektionen reagieren.
2. Offene LabVIEW und führen Sie die benutzerdefinierte geschrieben Neuroakuma Programm, dann laden verschiedene Wellenformen Leitwert. Set Wiederholungszahl bis 8 (6 - 8 für statistische Zwecke). Set Umkehrpotentiale von erregenden und hemmenden Leitwerte bei 0 und - 75 mV bzw.. Wählen Sie ein passendes Paar von erregenden und hemmenden Leitwerte für die Prüfung. Excitatory Leitwert trace (in grün) und hemmenden Leitwert trace (in rot), wird in der unteren Platte erscheinen.
3. Gehen Sie zurück zu PatchMaster, wählen Stromzange Modus und schalten Sie sofort den Verstärker Stromzange 'CC + Comm FAST "-Modus. Dieser Modus erlaubt es, nachurately folgen schnelle Änderungen des Membranpotentials. Wenn eine gute Abdichtung zwischen der Membran und Pipette aufrecht erhalten wird, wenig / kein Ausgleich erforderlich ist, da sonst die Aufnahme wird nicht lange dauern. In Neuroakuma, drücken Sie die "Record"-Taste. Die zelluläre Antwort (in der Regel mit einer phasischen Platzen der Aktionspotentiale, 1A) wird auf der oberen Platte erscheinen. Spritzen Strom in der Zelle mit niedriger Skalierung der Leitwerte zuerst, wenn wenig / keine Antwort beobachtet wird, in kleinen Schritten erhöhen, bis es eine starke Reaktion produziert. Übermäßige Stromeinspeisung kann töten die Zelle. Sobald Tests abgeschlossen sind, wählen Sie ein neues Paar Leitwert Wellenformen, wiederholen Sie die oben für alle Paare von physiologischen und künstliche Leitwerte. Die physiologischen Ströme (I) in Echtzeit injiziert basieren auf:
   I (t) = G _exc (t) x (V _m (t) - V _exc) + G _inh (t) x (V _m (t) - V _Inh.)

Leitwert (G in nS) konnte sy seinnaptic oder künstlich. Erregenden und hemmenden synaptischen Leitfähigkeit Wellenformen wurden aus früheren Experimenten durch Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen und Solomon (unveröffentlichte Ergebnisse) in Reaktion auf unterschiedliche visuelle Reize in Kontrollbedingungen und in Gegenwart von Tetrodotoxin durchgeführt gesammelt (TTX, 1 uM) . Künstliche Leitwert Wellenformen modelliert wurden unter Verwendung eines alpha-Funktion. V _m (in mV) ist die aufgezeichnete Membranpotential. G und G _{ohne inh} repräsentieren erregenden und hemmenden Leitwerte bzw. während V und _ohne V _Inh. stellen die Umkehrung Potenziale von erregenden und hemmenden bzw. Leitwerte. Time is t in ms. Abtastrate ist 40 kHz.
I _s = I ₀ (t / α) ^{e-&agr; t}

Die obige Gleichung ist ein Alpha-Funktion (I ₀ = maximale Strom, 1 / α = Zeit bis zur maximalen (s ^-1) des Stroms). Die Anstiegs-und Abklingzeit der synaptischenStrom wird durch α ⁴ diktiert. Die exzitatorische Leitfähigkeit war unverändert, während die Latenzzeit der inhibitorischen Leitfähigkeit geändert wurde, wodurch die Verzögerung relativ zu dem Beginn der Anregung (Fig. 2D).

4. Nach der Aufnahme sorgfältig einfahren Pipette so die Zelle Körper bleibt intakt. Sofort den Gewebe in 4% Paraformaldehyd für 30 min, gefolgt von drei Waschungen 10 min mit 0,1 M Phosphat-Puffer. Kühlen und führen Antikörper-Färbung am folgenden Tag oder innerhalb einer Woche.

4. Antikörper-Färbung gegen Lucifer Yellow Gefüllt retinalen Ganglienzellen

1. Antikörper-Färbung gegen Lucifer Yellow gefüllt Ganglienzellen bei Raumtemperatur (primäre Anti-Kaninchen-IgG Lucifer Yellow (= Verdünnung 1:10.000) für fünf Tage; am sechsten Tag, Übernachtung Färbung mit sekundären Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Verdünnung 1:500 = )). Nasspräparat die Netzhaut in Fluorescent Erhaltung Medien. Deckplättchenträger und mit Nagel p versiegelnolish.
2. Nehmen konfokale Bilder der Zellmorphologie mit einem Leica-Spec II konfokalen Mikroskop (Abbildung 1B). Die Anwesenheit eines Axons ermöglicht die Bestätigung der Ganglienzellen.

Representative Results

Der Beitrag der verschiedenen Quellen von hemmenden Eingänge Ganglienzellen Antworten wird durch die Anwendung verschiedener Leitfähigkeit Wellenformen gezeigt. Diese Wellenformen wurden mit Stimuli unterschiedlicher Leuchtdichte unter normalen Bedingungen und in Gegenwart von TTX einen spannungsgesteuerten Na ^{+-Kanal-Blocker,} der die Wirkung Potentialerzeugungsschaltung nur bei einem Teil der Retina hemmende interneurons. 2A eine repräsentative Antwort auf Injektion zeigt erhaltene erregenden und hemmenden Leitwert Wellenformen aufgezeichnet in Reaktion auf die Stimulation mit einem kleinen schwarzen Fleck auf einem grauen Hintergrund in normalen Bedingungen. Wenn die Leitfähigkeit Wellenformen mit einem schwarzen Fleck unterschiedlicher Größe in Gegenwart von TTX erhalten wird, in der gleichen Zelle injiziert wurden, wurde nur eine schwache Reaktion beobachtet (2B).

2C zeigt die Antworten der anderen Ganglienzellen der Injektion von verschiedenen Paaren vonLeitwert Wellenformen in denen das Verhältnis zwischen erregenden und hemmenden Kontrolle Leitfähigkeit wurde manipuliert (G _exc: G _Inh. Verhältnisse: 1:0 bis 1:2). Es ist klar, dass die Antwort der Zelle als der Grad der Hemmung verringert erhöht wurde. Daher Manipulation der Balance zwischen Erregung und der Hemmung ermöglicht die Quantifizierung ihrer Auswirkungen auf die neuronale Ausgabe.

Wir testeten auch den Effekt der Veränderung der relativen Zeitsteuerung zwischen Erregung und Hemmung von neuronaler Antworten. Wie in 2D dargestellt ist, wurden die Reaktionen mit einer anderen Ganglienzellen reduziert die Latenzzeit des hemmenden Leitfähigkeit verringert wurde, was zeigt, dass die Stärke der Reaktion auf den Zeitpunkt der synaptischen Eingängen abhängt.

Abbildung 1. (A) Versuchsaufbau in schematischer Form. Eine Digitalkamera wird verwendet, um Zellkörper der Ganglienzellen visualisieren, um Patch-Clamp sie (linke Monitor). Antworten jeder Zelle zu verschiedenen Strominjektionen wurden zuerst erfasst, verstärkt und dann auf der rechten Monitor. Beachten Sie, daß eine Rückkopplungsschleife auch die zwischen dem Computer und der Zelle, so dass die Membran (V) von der Zelle zu einem gegebenen Zeitpunkt verwendet wird, um den Strom (I) zu injizieren, zu berechnen ist. (B) Die Morphologie eines Ganglienzellen visualisiert unter einem Leica-Spec II konfokalen Mikroskop nach der Aufnahme und immunzytochemische Färbung. Abschließende Bild wurde mit Hilfe von ImageJ nach einem Zusammenbruch einen Stapel von Bildern. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. Antworten einer Ganglienzellen der Injektion von exzitatorischen (grün Spuren) und inhibitorische (rot Spuren) Leitfähigkeit Wellenformen von Experimenten in Kontrollbedingungen (A) und nach dem Bad Anwendung von Tetrodotoxin durchgeführt (TTX, B) erhalten. (C) Antworten von anderen Ganglienzellen zu verschiedenen Paaren von Leitwert Wellenformen. Die Verhältnisse zwischen erregenden Leitwert (G _exkl.) und hemmenden Leitwert (G _inh) wurden von 1.00 Uhr bis 01.02 Uhr geändert. Da das Ausmaß der Hemmung erhöht, wurde die Reaktion der Zelle verringert. (D) Antworten eines Ganglienzellen auf das gleiche Niveau der Anregung in dem der Beginn der Hemmung wurde variiert. At repräsentiert die Zeit zwischen dem Beginn der inhibitorischen und exzitatorischen Leitwerte. Da die Verzögerung der Hemmung reduziert wurde, die Antwort von Ter Zelle wurde schwächer. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen

Discussion

Hier zeigen wir die Verwendung von dynamischen Haken, um den Einfluß des Verhältnisses und Timing der Erregung und Hemmung von retinalen Ganglienzellen Ausgang bewerten. Dynamische Klammer nutzt Computersimulationen physiologisch aufgezeichneten oder künstliche synaptischen Leitwerte in lebende Neuronen einzuführen. Diese Methode bietet ein interaktives Werkzeug, mit dem Leitwerte können modifiziert werden und injiziert in Neuronen zur Berechnung ihres Einflusses auf neuronalen Antworten. Leitwert Wellenformen von Experimenten, bei denen optische Reize zur Photorezeptoren in Kontrollbedingungen und in Gegenwart von pharmakologischen Mitteln, um den Beitrag der bestimmten Zelle oder Schaltkreise zu isolieren aktiviert werden, erhalten werden. Die Injektion von verschiedenen Kombinationen von diesen Leitfähigkeit Wellenformen zeigt, deren Beitrag zur Spiking Ausgang. Die Verwendung von dynamischen Clamp Messungen ermöglicht auch eine Manipulation der Geräuschkulisse, die unter verschiedenen Licht-Anpassung conditio kann ns. Darüber hinaus können auch Leitfähigkeit Wellenformen von Modellen der synaptischen Eingänge, wie alpha-Funktionen erzeugt werden, und auch für die synaptische Eingänge mit Spannungsabhängigkeit (dh NMDA-Rezeptoren) sowie spannungsgesteuerten Ionenkanälen oder elektrisch gekoppelt Zellen. Somit öffnen Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen hergestellt enorme Möglichkeiten, den Beitrag der verschiedenen synaptischen Mechanismen zur neuronalen Antworten und Signalverarbeitung in neuronalen Netzen zu verstehen. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass auch bei verschiedenen Arten von Ganglienzellen deutlich verschiedene und Dichten von spannungsabhängigen Kanälen auszudrücken, fanden wir, dass die Ergebnisse der Integration der synaptischen Leitwerte konsistent Zelltypen waren. So wurden Veränderungen im Verhältnis und den Zeitpunkt der erregenden und hemmenden Leitwerte ähnlich in den Antworten wider obwohl Spikefrequenz, inter-Spike-Intervalle und Anpassung Eigenschaften variiert je nach Zelltyp (Daten nicht gezeigt).

ove_content "> Obwohl dynamische Klemme bietet viele Vorteile, gibt es einige Einschränkungen intrinsische der Technik (für eine Übersicht siehe ^7). Ein wesentlicher ist, dass Leitfähigkeit Injektion im Soma kann nicht genau darstellen synaptischen Eingänge von Rezeptoren und Kanäle, die spezifisch sind vermittelt verteilt entlang der Membran der dendritischen Prozesse, und der nicht-lineare Wechselwirkungen in den Dendriten auftreten können. Somit Leitwerte distal der Injektionsstelle nur simuliert annähernd. Obwohl dynamische Klemme wurde erfolgreich an Dendriten in Pyramidenzellen angewendet tun Vierfach ganzen Zelle Aufnahmen ^8, schließt die morphologische Komplexität der Ganglienzellen dendritischen Prozesse eine realistische Simulation der räumlichen Verteilung von Synapsen, indem Sie dendritischen Aufnahmen. Die hier vorgestellte Ansatz nutzt Leitfähigkeit berechneten Wellenformen aus somatischen Voltage-Clamp-Experimente, die verlassen sich auch auf einer Punkt-Source-Elektrode und übernimmt lineare Wechselwirkungen zwischen spannendeatory und hemmenden Eingänge, eine Annahme, die weithin in der Gemeinschaft akzeptiert. Somit liefern diese Studien wichtige Informationen über die Auswirkungen von Veränderungen der synaptischen Leitwerte auf neuronale Integration auf der Ebene des Soma und Axon Hügel.

Unsere Experimente nicht replizieren physiologischen Reaktionen, die auch rekrutieren spannungsabhängigen Leitwerte in Ganglienzellen Dendriten. Dies könnte jedoch auch durch Modifizierung der Modellgleichungen so dass die injizierten Strom dendritischen Leitwerte und Kabel Wirkungen auf einem Multi-Kompartiment-Modell (wie in ⁷ beschrieben) bezogen sind durchgeführt werden.

Eine weitere Einschränkung ist, dass leistungsabhängige Veränderungen, die neuronale Antwort zu modifizieren, dh Veränderungen in der intrazellulären Calcium-oder Botenstoffe durch Aktivierung von Membran-Kanäle oder Rezeptoren ausgelöst sind nicht in diesen dynamischen Clamp Messungen wiedergegeben. Obwohl unser Modell nicht mit dieser Komplexität umzugehen, die vielleicht s seinpecific, für einige Zelltypen wurden Simulationen mit einem Calcium-Pool und Calcium-Einstrom in diesem Pool in Echtzeit auf die Spannungsschwankungen des aufgezeichneten neuronalen Basis erfolgreich ¹⁰ implementiert.

Auch wenn eine Abtastrate von 10 kHz genau folgen würde den zeitlichen Verlauf der Aktionspotentiale, unsere Aufnahmen statt einer Abtastrate von 40 kHz verwendet. Diese höhere Abtastrate erforderlich ist, um die Stabilität des Systems zu erhalten und einen realistischen und sehr genaue Aufnahmen (für eine Übersicht siehe ¹¹⁾ zu ermöglichen.

Der experimentelle Ansatz hier beschrieben ist es nicht erforderlich, um die Netzhaut Dunkel-adaptierten halten. Leitwert Wellenformen von Dunkel-adaptierten Netzhaut unter physiologischen Bedingungen erhalten wurden, wurden verwendet, um den Strom in die Zelle injiziert, zu berechnen; auf diese Weise der injizierte Strom nachgeahmt physiologische Stimulation mit Licht. Dennoch wäre es noch möglich sein, um das Gewebe im Dunkel-adaptierten und somit in der Lage, compare antwortet Leitwert Injektion mit denen Licht Stimulation. In diesem Fall physiologischen Eigenschaften der Ganglienzellen (Antwort Polarität, dh ON, OFF oder ON-OFF, räumlichen und zeitlichen Frequenz Empfindlichkeit, Selektivität Richtung, etc.) konnte vor der Anwendung der verschiedenen Wellenformen Leitwert klassifiziert werden, ob Injektion bewerten der Leitwerte von einem bestimmten Zelltyp hat unterschiedliche Auswirkungen je nach Zelltyp sie angewendet werden.

Insgesamt halten wir fest, dass dynamische Klemme ist eine sehr mächtige Technik, um zu offenbaren, die Wechselwirkungen zwischen erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge, die neuronale Ausgabe zu erzeugen, um die Rolle der verschiedenen Spannungs-abhängigen Leitwerte in neuronale Aktivität zu untersuchen sowie Hypothesen über synaptische Mechanismen testen . Die Anwendung dieser Technik in der Netzhaut ist besonders nützlich, da die synaptischen Eingänge auf mehrere Arten Ganglienzellen detailliert beschrieben wurdend als eine Funktion des physiologischen Reizes. In ähnlicher Weise kann dieser Ansatz Einblicke in die Funktion des neuronalen in anderen Bereichen des zentralen Nervensystems zu schaffen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation