Summary
यहाँ हम गर्भनाल रक्त से अग्रदूत के सबसेट बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. पर्याप्त और न्यूक्लिक एसिड की मात्रा और गुणवत्ता कोशिकाओं से निकाला जा सकता है और बाद डीएनए या शाही सेना का उपयोग assays में इस्तेमाल किया.
Abstract
गर्भनाल रक्त अत्यधिक अलग वंश प्रतिबद्धता चरणों में hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए समृद्ध है. हम भेदभाव के चार अलग - अलग चरणों में बी कोशिकाओं अग्रदूत अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है. क्योंकि जीनों व्यक्त कर रहे हैं और epigenetic संशोधनों एक ऊतक विशिष्ट तरीके होते हैं, यह महत्वपूर्ण है के लिए ऊतकों और सेल प्रकार के बीच भेदभाव के क्रम में जीनोम और epigenome है कि इस रोग के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते में परिवर्तन की पहचान करने में सक्षम हो. इस विधि सेल गर्भनाल रक्त में भेदभाव के किसी भी स्तर पर वर्तमान के किसी भी प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस विधि में 4 मुख्य कदम शामिल हैं. पहले, mononuclear कोशिकाओं घनत्व centrifugation से अलग हो रहे हैं. दूसरा, बी कोशिकाओं बायोटिन संयुग्मित एंटीबॉडी कि पहचान और गैर mononuclear कोशिकाओं से बी कोशिकाओं को हटाने का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं. थर्ड बी कोशिकाओं fluorescently कोशिका की सतह प्रोटीन को अलग - अलग चरणों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैंबी सेल के विकास के. अंत में, fluorescently लेबल कोशिकाओं को हल कर रहे हैं और व्यक्ति आबादी बरामद कर रहे हैं. बरामद की कोशिकाओं को पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता के अनुप्रवाह न्यूक्लिक एसिड assays में उपयोग किया जा रहे हैं.
Introduction
आदेश में aberrations है कि इस बीमारी में मौजूद हैं की पहचान करने के लिए, यह vitally महत्वपूर्ण है कि हम स्वस्थ ऊतकों या कोशिकाओं है कि रोग से प्रभावित ऊतक या सेल प्रकार के अनुरूप का उपयोग करें. इसका एक कारण यह है कि ऊतक प्रकार के बीच epigenetic परिवर्तन जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार है और सामान्य मानव विकास 1,2 के दौरान सेलुलर भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है कि. एक दूसरा कारण यह है कि न्यायपालिका ऊतक विशिष्ट जीन विनियमन सामान्य विकास पर गंभीर परिणाम हो और कैंसर सहित रोग राज्यों की एक भीड़ के लिए योगदान के लिए जाना जाता है. इसलिए, एक रोग है कि hematopoietic कोशिकाओं शामिल है की एक बेहतर समझ स्वस्थ hematopoietic कोशिकाओं के ज्ञान की आवश्यकता है.
कोशिका की सतह की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की विशेषता घटनाओं की एक व्यवस्थित क्रम के माध्यम से अस्थि मज्जा आय में hematopoietic कोशिकाओं के विकास 3 मार्करों. वयस्क प्रतिभागियों को शामिल अध्ययनपता चला है कि आमतौर पर अस्थि मज्जा बी कोशिकाओं 4,5 अग्रदूत के कम संख्या में शामिल है, जबकि बाल चिकित्सा प्रतिभागियों को शामिल अध्ययन से पता चला है कि बी कोशिकाओं के अग्रदूत के प्रतिशत 6 साल की उम्र के कम से कम 5 साल के व्यक्तियों में अपेक्षाकृत अधिक है. गर्भनाल रक्त रक्त संबंधी विकारों दुर्दमताओं के उपचार में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है, गर्भनाल रक्त बैंकों के माध्यम से आसानी से उपलब्ध है और अपरिपक्व बी और टी कोशिकाओं 7 जो ल्यूकेमिया सहित कई विकारों के लक्ष्य कोशिकाओं के लिए समृद्ध है lymphomas.
अस्थि मज्जा में बी कोशिकाओं अग्रदूत बड़े पैमाने पर किया गया है 8,9 phenotyped और अलग कैंपेन्स इन कोशिकाओं को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों की उपस्थिति से परिभाषित किया जा सकता है. सामान्य बी सेल अस्थि मज्जा में जल्द से जल्द समर्थक बी कोशिकाओं के साथ शुरुआत और अपरिपक्व या भोले बी कोशिकाओं में culminating चरणों की एक श्रृंखला के माध्यम से भेदभाव आय. अनुसारवैन Zelm और उनके सहयोगियों ने 10, समर्थक बी कोशिकाओं CD34 की उपस्थिति से और 2 चरण के लिए संक्रमण (पूर्व बीआई) CD19 अधिग्रहण कर लिया है की विशेषता है. स्टेज 3 (पूर्व BII) कोशिकाओं अब CD34 व्यक्त है और cytoplasmic आईजीएम व्यक्त शुरू. अंत में, 4 चरण के एक परिभाषित विशेषता (अपरिपक्व कोशिकाओं बी) सतह आईजीएम की अभिव्यक्ति है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित रणनीति छँटाई 1 Caldwell और उनके सहयोगियों ने 6 द्वारा वर्णित किया गया था और केवल 3 कोशिका की सतह मार्करों जो बहुत जटिलता और सेल छँटाई प्रयोगों प्रदर्शन की लागत कम कर देता का उपयोग भी शामिल है. उनके काम में, CD45 के बीच एक रिश्ता और बी सेल भेदभाव के चरणों में स्थापित किया गया था. उन्होंने कहा कि अस्थि मज्जा में बी कोशिकाओं CD45 की अभिव्यक्ति के चर स्तर पर प्रदर्शित. विशेष रूप से, कोशिकाओं है कि CD45 के उच्च स्तर पर व्यक्त कोशिकाओं है कि सतह आईजीएम (अपरिपक्व कोशिकाओं बी) के लिए corresponded, जो है कि CD45 के एक मध्यवर्ती स्तर व्यक्त कोशिकाओं कि cytopl व्यक्त करने के लिए correspondedasmic (पूर्व - BII कोशिकाओं) आईजीएम, और उन है कि CD45 के निम्न स्तर व्यक्त कोशिकाओं है कि cytoplasmic आईजीएम व्यक्त नहीं कोशिकाओं (पूर्व बीआई) के लिए corresponded. इस प्रोटोकॉल Caldwell और उनके सहयोगियों ने 6 से विकसित करने के लिए गर्भनाल रक्त (1 चित्रा) से बी कोशिकाओं जो बहाव के द्वीप methylated CPG वसूली परख जैसे उच्च गुणवत्ता nucleic एसिड की आवश्यकता assays में इस्तेमाल किया जा सकता है (मीरा अग्रदूत के सबसेट अलग रणनीति का उपयोग करता है 11) और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर assays. विधि एक प्रारंभिक जुदाई चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए गर्भनाल रक्त से सभी गैर - बी कोशिकाओं व्यय को रोजगार और केवल 3 एंटीबॉडी (CD34, CD19 और CD45) के साथ धुंधला की आवश्यकता है. कोशिकाओं है कि बरामद कर रहे हैं बी सेल भेदभाव के 4 चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं: 1 CD34) + CD19 (देर समर्थक बी और पूर्व द्विपक्षीय जल्दी), 2) CD34, CD19 +, कम CD45 (देर से पूर्व बीआई); ) 3 CD34 -; CD19 +; CD45 मेड (पूर्व BII), और 4) CD34 -; सीD19 +; CD45 उच्च (अपरिपक्व कोशिकाओं बी).
Protocol
1. गर्भनाल रक्त से mononuclear कोशिकाओं का अलगाव
- तैयार करें EDTA PBS 5 मिलीग्राम गोजातीय सीरम albumin (BSA) शेयर 95 मिलीलीटर rinsing बफर (1:20 कमजोर पड़ने) समाधान बफर जोड़ने. बफर Degas और बर्फ पर बफर रखने महत्वपूर्ण: degas विफलता बफर इष्टतम परिणामों की तुलना में कम समय में परिणाम जब CD19 अलग हो सकता है क्योंकि बी कोशिकाओं बुलबुले अलगाव स्तंभ ब्लॉक कर सकते हैं.
- घनत्व ढाल centrifugation के लिए तैयार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब. गर्भनाल रक्त के प्रसंस्करण के लिए आवश्यक ट्यूबों (1 ट्यूब 8 मिलीलीटर रक्त की प्रक्रिया कर सकते हैं) की संख्या का निर्धारण और प्रत्येक ट्यूब Ficoll Paque PLUS के 15 मिलीलीटर जोड़ने.
- 24 मिलीलीटर (1x) DPBS और ध्यान से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में से प्रत्येक में PLUS Ficoll Paque के शीर्ष पर पतला गर्भनाल रक्त मिश्रण परत के साथ गर्भनाल रक्त की 8 मिलीग्राम पतला. मिश्रण नहीं रक्त और Ficoll - Paque PLUS महत्वपूर्ण: गर्भनाल रक्त और Ficoll - Paque PLUS के मिश्रण से बचने के लिए, एक 45 डिग्री के कोण पर ट्यूब पकड़ औरधीरे धीरे परत रक्त मिश्रण.
- 20 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र प्लाज्मा Ficoll Paque PLUS इंटरफ़ेस mononuclear कोशिकाओं (एमएनसी) में रहेगा जबकि granulocytes और एरिथ्रोसाइट्स तलछट Ficoll - Paque PLUS आसमाटिक दबाव में उच्च घनत्व के कारण. लेबल सात 5 मिलीलीटर दौर नीचे नमूना आईडी, दिनांक, और निम्नलिखित के साथ भाग 3 में इस्तेमाल किया जा ट्यूबों:
| ट्यूब | लेबल | उद्देश्य |
| 1 | बेदाग | प्रवाह cytometry के दौरान सामान्य के लिए बेदाग कोशिकाओं |
| 2 | 7AAD | प्रवाह cytometry दौरान व्यवहार्यता का निर्धारण |
| 3 | + + + | कोशिकाओं है कि हल किया जाएगा शामिल |
| 4 | ३४ + | CD34 + / CD19 इकट्ठा +कोशिकाओं (जल्दी पूर्व द्विपक्षीय देर समर्थक बी) |
| 5 | 45 कम | / / CD19 + कम CD45 (पूर्व बीआई) कोशिकाओं CD34 इकट्ठा |
| 6 | 45 मेड | / CD19 + / CD45 मेड कोशिकाओं (पूर्व BII) - CD34 इकट्ठा |
| 7 | 45 उच्च | / CD19 उच्च + / CD45 (अपरिपक्व बी) कोशिकाओं CD34 इकट्ठा |
कोट ट्यूबों 4, 5, 6, और 7 और 2% FBS के साथ बर्फ पर सभी ट्यूबों जगह है.
- ऊपरी प्लाज्मा परत ध्यान Aspirate और mononuclear सेल परत के साथ संपर्क से बचें. एक 10 मिलीलीटर कांच विंदुक का प्रयोग, ध्यान से एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब mononuclear सेल परत हस्तांतरण. एक एकल 50 मिलीलीटर ट्यूब में तीन ट्यूब से mononuclear कोशिकाओं के साथ गठबंधन.
- पीबीएस के साथ ट्यूब भरें, धीरे मिश्रण और 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र20 डिग्री सेल्सियस सेल गोली को परेशान करने के बिना ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate. 1x दोहराएँ. पहली धोने के बाद, छर्रों resuspend और एक एकल 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण.
- धीरे पीबीएस के 200 μl में सेल गोली resuspend. सेल निलंबन की 1 μl निकालें, पीबीएस के 1 मिलीलीटर यह एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जोड़ने और गिनती (अपकेंद्रित्र में 50 मिलीलीटर सेल निलंबन रखने के बाद कोशिकाओं गिनती) के लिए अलग सेट. पीबीएस के साथ ट्यूब भरें और 15 मिनट के लिए प्लेटलेट्स निकालने 200 XG पर अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला सेल गोली को परेशान करने के बिना पूरी तरह से हटाने के.
2. संशोधित बी सेल mononuclear कोशिकाओं का उपयोग कर एमएसीएस पृथक्करण से अलगाव
- 160 μl ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) बफर EDTA पीबीएस के साथ 1.7 कदम से गोली Resuspend.
- 40 μl बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें. मिश्रण अच्छी तरह से और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं विंदुक
- कोशिकाओं को धो - 1 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) बफर EDTA पीबीएस 10 लाख प्रति कोशिकाओं (सेल परमाणु जोड़ेंmber 1.7 कदम) में निर्धारित है और 10 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate पूरी तरह से और फिर 320 μl ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) बफर EDTA पीबीएस में सेल गोली resuspend.
- 80 μl विरोधी बायोटिन microbeads जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं
- कोशिकाओं धो - 1 मिलीग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) बफर EDTA पीबीएस 10 लाख प्रति कोशिकाओं और 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र ठंड जोड़ने. 100 मिलियन कोशिकाओं को ठंड के 500 μl (4 डिग्री सेल्सियस) बफर EDTA पीबीएस में Resuspend. स्केल बफर सेल नंबर के अनुसार मात्रा.
- Centrifugation (2.5 चरण) के दौरान तैयार एमएसीएस कॉलम और एमएसीएस विभाजक. एमएसीएस विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एक LS स्तंभ प्लेस, ठंड के 3 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) EDTA - PBS बफर स्तंभ पर जोड़ और बफर कॉलम के माध्यम से ड्रिप करने के लिए अनुमति देते हैं. एक गोदाम का उपयोग करने के लिए के माध्यम से प्रवाह पकड़ने. प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
- कॉलम के नीचे एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब प्लेस और स्तंभ पर सेल निलंबन विंदुक. Unlabeled कोशिकाओं throug ड्रिप करने के लिए अनुमति देंघंटे और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्तंभ. महत्वपूर्ण: इन कोशिकाओं है कि एंटीबॉडी लेबलिंग और सेल छँटाई के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. के माध्यम से त्यागें मत प्रवाह. 2.5 कदम से कोशिकाओं की सब ठीक, शंक्वाकार ट्यूब की दीवारों के लिए ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) बफर EDTA पीबीएस के एक अतिरिक्त 1 मिलीग्राम जोड़ने. धीरे मिक्स और स्तंभ पर शेष सेल निलंबन विंदुक. 1x दोहराएँ. 2.8 कदम unlabeled शंक्वाकार ट्यूब में कॉलम के माध्यम से गुजर जाने के बाद एकत्र की कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ें.
- शंक्वाकार ट्यूब PBS और अपकेंद्रित्र के साथ 10 मिनट के लिए 300 XG unlabeled कोशिकाओं से युक्त भरें. ध्यान से परेशान करने के बिना सेल गोली तैरनेवाला हटा दें. EDTA PBS बफर के 200 μl जोड़ें और धीरे कोशिकाओं resuspend.
3. एंटीबॉडी और सेल छँटाई लेबल के लिए तैयारी
- सेल निलंबन और लेबल "अस्थिर" (1.4 चरण) ट्यूब में जगह की 1 μl Aspirate. 500 μl EDTA - PBS बफर जोड़ें और बर्फ पर ट्यूब की दुकान.
- 20 जोड़ेंप्रत्येक एंटीबॉडी के शेष सेल निलंबन में (CD19, CD34 और CD45) μl मिलियन कोशिकाओं प्रति. अच्छी तरह मिक्स और आरटी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में ट्यूब जगह. सीडी एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील, पूर्ण कदम हैं 2-4 के साथ रोशनी बंद कर दिया.
- एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, सेल निलंबन के 40 μl aspirate और यह "7AAD" लेबल ट्यूब में जगह. ट्यूब और 2 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र में 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें. तैरनेवाला निकालें और बाध्यकारी बफर के 100 μl में कोशिकाओं resuspend. (डी 7-Aminoactinomycin) 7AAD के 7 μl जोड़ें और आरटी पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं. 10 मिनट ऊष्मायन पूरा 3.4 चरण के दौरान.
- शेष सीडी एंटीबॉडी के साथ लेबल की कोशिकाओं से युक्त ट्यूब के शीर्ष करने के लिए पीबीएस जोड़ें. 3 मिनट के लिए 500 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला निकालें, 500 μl EDTA PBS बफर जोड़ने और सेल गोली resuspend. "+ + +" लेबल ट्यूब में सेल निलंबन की पूरी मात्रा का स्थानांतरण. सेल निलंबन एक के सब ठीकdd एक अतिरिक्त 1 मिलीग्राम EDTA पीबीएस 50 मिलीलीटर शंक्वाकार और "+ + +" लेबल ट्यूब में ट्यूब के हस्तांतरण के लिए बफर.
- ऊष्मायन के बाद (3.3 चरण), 7AAD ट्यूब में 300 μl बाध्यकारी बफर जोड़ने. , "अस्थिर" 7AAD "और" + + + "नमूने और" 34 "," कम 45 "," मेड 45 "और" 45 उच्च "ट्यूब प्रवाह cytometry के लिए तैयार कर रहे हैं.
4. सेल MoFlo XDP प्रवाह cytometer क्रमित कर रहा है
- सॉर्टिंग के लिए सेट अप MoFlo: लेज़रों संरेखित करें, छोटी बूंद धारा स्थिर, ड्रॉप देरी का निर्धारण.
- एकल रंग मुआवजा Invitrogen निर्माता के निर्देशों के अनुसार एबीसी माउस मनका किट (या समान) का उपयोग करते हुए नियंत्रण तैयार. भागो एक रंग नियंत्रण, सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का इष्टतम जुदाई के लिए प्रतिदीप्ति चैनलों के voltages का समायोजन. मुआवजा coefficients सेट और मुआवजा पैरामीटर संग्रह प्रोटोकॉल के लिए लागू होते हैं. मुआवजा coefficients हर समय एंटीबॉडी का एक नया बहुत प्राप्त है पुनः स्थापित.
- भूखंडों के रूप में चित्रा 2 में दिखाया सहित प्रोटोकॉल बनाएँ.
- अस्थिर नमूना चलाएँ, वोल्टेज और आगे और पक्ष तितर बितर के लिए लाभ सेट, और नकारात्मक प्रतिदीप्ति आबादी की पहचान. क्योंकि डीएनए वसूली इस तरह के लक्ष्य है, सीमा निर्धारित कम (≤ 1%) इतना है कि डीएनए युक्त मलबे बरामद नमूने नहीं दूषित करता है. * सुनिश्चित करें कि एयरोसोल निकास प्रणाली हर समय रहते हैं कि मानव कोशिकाओं MoFlo पर चलाए जा रहे हैं पर चल रहा है.
- + + नमूना + (~ 50,000 घटनाओं) के एक छोटे अशेष भाजक भागो gating रणनीति (2 चित्रा) सेट. क्योंकि बी सेल progenitors तितर बितर हूबहू नहीं करने के लिए बी कोशिकाओं परिपक्व, ungated CD19 backgate / CD34 + + एसएससी बनाम FSC साजिश पर जनसंख्या लिम्फोसाइट फाटक संभावित प्रो - बी कोशिकाओं शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें. इस नमूने से भी 7AAD के के लिए नकारात्मक प्रतिदीप्ति जनसंख्या सेट.
- 7AAD नमूना व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए नमूना चलाएँ. केवल उच्च व्यवहार्यता के साथ एक नमूना से तरह कोशिकाओंमृत कोशिकाओं के रूप में शुरू (≥ 95%) अंधाधुंध दाग और सॉर्ट आबादी दूषित हो सकता है.
- सॉर्ट निर्णय की स्थापना चार आबादी को इकट्ठा करने के लिए: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 / CD45 कम, CD19 + / CD34 - / CD45 मध्यम, और CD19 + / CD34 - / उच्च CD45. और सभी आबादियों की तरह फैसले में लिम्फोसाइट नक़ल भेदभाव फाटकों शामिल करें.
- छँटाई टिप में मोज़री को रोकने के लिए, फिल्टर + + + तुरंत छंटाई और फिर फिल्टर अगर किसी भी एकत्रीकरण की तरह के दौरान नमूने में होता है से पहले एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से नमूना.
- एक ठंडा या बर्फ पैक ट्यूब धारक में पीबीएस में 2% FBS के साथ लेपित संग्रह ट्यूब (1.4 चरण) में कोशिकाओं की तरह.
- तरह के तुरंत बाद पूरा हो गया है, डीएनए निकाल सकते हैं.
Representative Results
नमूने के बीच भिन्नता सेल तरह (1 टेबल) की सफलता में एक भूमिका निभाता है. अच्छी सफलता दर के साथ नमूने contaminating मलबे के निम्न स्तर (चित्रा 3) है और गरीब सफलता दर के साथ नमूने contaminating मलबे के उच्च स्तर (3B चित्रा). नमूने के बीच भिन्नता कुछ हद तक जा सकता है अगर गर्भनाल रक्त नमूना लदान (/ ओ एन पहली प्राथमिकता) के 24 घंटे के भीतर एकत्र किया गया था नियंत्रित किया जा सकता है.
प्रत्येक अग्रदूत सबसेट बी सेल से प्रवाह क्रमबद्ध कोशिकाओं को पर्याप्त मात्रा में और लिए न्यूक्लिक एसिड isolations प्रदर्शन गुणवत्ता के हैं. पृथक डीएनए उच्च गुणवत्ता की है और बहाव के विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम नियमित रूप से 11 मीरा में यह डीएनए का उपयोग करने के लिए डीएनए methylated (4 चित्रा) के लिए समृद्ध है.
| गर्भनाल रक्त सुविधा डेटा | गरीब क्रमबद्ध करें | |
| कार्य anticoagulant के साथ रक्त की मात्रा (एमएल) | 110 | 104 |
| सफेद रक्त कोशिकाओं [10 3 μl /] | 8.68 | 11.19 |
| लिम्फोसाइटों [10 3 μl /] | 3.88 | 3.76 |
| लिम्फोसाइट (%) | 44.70 | 33.6 |
| लाल रक्त कोशिकाओं [10 6 μl /] | 3.65 | 3.05 |
| घर में डेटा | ||
| Ficoll Paque के बाद सेल नंबर | 206 एम | 309 एम |
| एमएसीएस पृथक्करण के बाद सेल नंबर | 22 एम | 16.5 मीटर |
| कुल घटनाक्रम काउंट (MoFlo XDP) | 30.57 एम | 19.97 एम |
| व्यवहार्यता (%) | 98.00 | 98.00 |
| लिम्फोसाइट गेट में कक्ष (%) 17.00 | 50.00 | |
| CD19 / CD34 + + | ||
| कुल सेल नंबर | 10959 | 48316 |
| कुल ईवेंट का% | 0.04 | 0.24 |
| दक्षता | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - कम / CD45 | ||
| कुल सेल नंबर | 16619 | 26941 |
| कुल ईवेंट का% | 0.05 | 0.13 |
| दक्षता | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 मेड | ||
| कुल सेल नंबर | 469745 | 507540 |
| कुल ईवेंट का% | 1.54 | 2.54 |
| दक्षता | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / उच्च CD45 | ||
| कुल सेल नंबर | 1896062 | 2047142 |
| कुल ईवेंट का% | 6.2 | 10.25 |
| दक्षता | 91% | 90% |
तालिका 1. प्रतिनिधि सेल तरह आँकड़े पंक्तियाँ 1-5 गर्भनाल रक्त सुविधा प्रदान मायने रखता हैं. शेष पंक्तियाँ हमारी प्रयोगशाला में एकत्र आंकड़ों हैं. गरीब तरह मलबे के उच्च स्तर और लिम्फोसाइट फाटक में एक कोशिकाओं के कम प्रतिशत निहित.
Figu1 रहे हैं. प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट गर्भनाल रक्त और संसाधित mononuclear कोशिकाओं Ficoll paque प्लस का उपयोग कर से अलग कर रहे हैं. एक अतिरिक्त कदम धोने contaminating प्लेटलेट्स को दूर करने के लिए शामिल है. बी कोशिकाओं mononuclear एमएसीएस मानव अलगाव बी सेल किट (बी CLL) कोशिकाओं का उपयोग कर से अलग कर रहे हैं. बायोटिन - संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी इस कदम (CD2, CD4, CD11b, CD36, विरोधी IgE और CD235a) का उपयोग करता है के लिए सभी गैर - बी कोशिकाओं को दूर कर सकते हैं. बरामद बी कोशिकाओं CD19-APC, CD34 पीई और CD45-FITC एंटीबॉडी तो MoFlo XDP प्रवाह अग्रदूत बी सेल सबसेट ठीक cytometer का उपयोग कर हल के साथ चिह्नित कर रहे हैं: CD19 + / CD34 + CD19 + / CD34 - / CD45 कम ; CD19 + / CD34 / CD45 मेड, और CD19 + / CD34 - / उच्च CD45.
चित्रा 2. पॉप के लिए पहचान करने और छँटाई Gating रणनीतिulations लाल तीर गेट से संकेत मिलता है कि बाद में भूखंड के लिए लागू किया जाता है. R4, R5, R6 और R7 फाटकों क्रमबद्ध आबादी से संकेत मिलता है) आगे बनाम ओर तितर बितर समृद्ध लिम्फोसाइट आबादी दिखा साजिश. R1, लिम्फोसाइट फाटक ख) लंबाई बनाम एकल कक्षों बनाम दोहरी की पहचान करने के लिए आगे तितर बितर साजिश की चौड़ाई. R2, एकल कोशिका फाटक ग) CD19 APC सकारात्मक कोशिकाओं CD34 पीई नकारात्मक और सकारात्मक आबादी में गिर जाते हैं. R3, CD19 + / CD34 - गेट, R4, CD19 / CD34 + + फाटक का संकेत वांछित तरह जनसंख्या घ CD19) / + CD34 कोशिकाओं तीन कुछ अलग CD45 FITC आबादी में गिर जाते हैं. R5 और R6, + / CD34 CD19 / CD45 कम और CD19 + / CD34 - / CD45 मेड आबादी, क्रमशः. R7, + / CD19 CD34 में उच्च सेल नंबर की वजह से / CD45 उच्च जनसंख्या, इस तरह केवल गेट शामिलआबादी का एक भाग है. इस आबादी की सभी कोशिकाओं को बहाव के विश्लेषण के लिए एकत्र होने की जरूरत नहीं है.
चित्रा 3.) स्तंभ संवर्धन के बाद मलबे contaminating के निम्न स्तर. R1, लिम्फोसाइट फाटक). ख स्तंभ संवर्धन के बाद मलबे contaminating के उच्च स्तर है.
4 के बाहर चित्रा. डीएनए methylated के संवर्धन. बी कोशिकाओं के अग्रदूत के सबसेट से एक) sonicated अग्रदूत बी सेल सबसेट से अलग डीएनए उच्च गुणवत्ता की है. पुस्तकालय निर्माण डीएनए के लिए 200-600 बीपी के एक औसत sonicated है. लेन 1: 100 बीपी PROMEGA कैटलॉग (# G2101) सीढ़ी, 2 लेन: कुल पृथक डीएनए CD19 से + / CD34 + कोशिकाओं, 3 लेन: कुल CD19 से पृथक डीएनए + कम कोशिकाओं, 4 लेन: 100 एनजी डीएनए CD19 + / CD34 से अलग - / CD45 मेड कोशिकाओं, 5 लेन: 100 एनजी CD19 + / CD34 से अलग डीएनए / CD45 उच्च कोशिकाओं. डीएनए 9 मिनट (, 30 सेकंड से 30 सेकंड) के एक कुल के लिए उच्च पर Diagenode Bioruptor का उपयोग sonicated किया गया था. डीएनए स्तंभ शुद्ध था और SYBR हरी न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के साथ एक 1% agarose जेल पर visualized ख. मीरा ActivMotif MethylCollector अल्ट्रा किट, SLC25A37 साथ पीसीआर (1-6) और APC1 (7-12) का उपयोग करने के बाद) पुष्टि करने के लिए किया जाता है डीएनए methylated के संवर्धन. 1 और 7: (कोई मीरा) sonicated जीनोमिक डीएनए, 2 और 8: मीरा - CD19 + / CD34 डीएनए +, 3 और 9: मीरा - CD19 / CD34 + - CD45 / कम डीएनए, 4 और 10: मीरा - CD19 / + CD34 - / CD45 मेड डीएनए, 5 और 11: मीरा CD19 / + CD34 - / CD45 उच्च डीएनए, 6 और 12: जल नियंत्रण. SLC25A37 की उच्च प्रवर्धन डीएनए methylated के संवर्धन की पुष्टिबी कोशिकाओं के अग्रदूत के सबसेट में.
Discussion
प्रोटोकॉल की सफलता पर सबसे बड़ा प्रभाव के साथ कारक मलबे contaminating की उपस्थिति है. यदि एक गर्भनाल रक्त बैंक से रक्त का अनुरोध यह महत्वपूर्ण है के लिए रक्त के रूप में संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके भेज दिया. इसके अलावा, नमूने कि lymphocytosis के रूप में वर्गीकृत किया जाता है लिम्फोसाइटों के अधिक संख्या में होते हैं, लेकिन, इन नमूनों बी कोशिकाओं के अग्रदूत की पर्याप्त संख्या नहीं है और नहीं किया जाना चाहिए. कोशिकाओं के अग्रदूत सबसेट हम गर्भनाल रक्त की कम से कम 85 मिलीलीटर के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं में से प्रत्येक के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने की संभावना को बढ़ा सकते हैं.
यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि वयस्क परिधीय रक्त separations के विपरीत, जब गर्भनाल रक्त fractionating mononuclear परत अक्सर लाल रक्त कोशिकाओं के साथ 12 दूषित है. इस प्रोटोकॉल एक अतिरिक्त धोने contaminating प्लेटलेट्स को दूर करने के लिए कदम भी शामिल है. गर्भनाल रक्त से mononuclear separations का वर्णन प्रोटोकॉल एक lysis कदम टी सहित सुझावओ लाल अवांछित कोशिकाओं को हटाने हैं. हम इस कदम की सिफारिश नहीं है क्योंकि यह contaminating मलबे उत्पादन और सेल प्रकार की सफलता पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है.
आदेश में कोशिकाओं है कि प्रवाह cytometry से प्रतिष्ठित किया है की संख्या को कम करने के लिए यह जरूरी है कि एक बी कोशिका संवर्धन सेल छँटाई करने से पहले प्रदर्शन. Miltenyi बायोटेक, कि बी - सेल अलगाव किट (बी CLL) के साथ प्रदान की प्रोटोकॉल परिधीय रक्त के लिए अनुकूलित किया गया है और 10 μl 10 मिलियन कोशिकाओं प्रति बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल इस्तेमाल की सिफारिश की है. CD4 (टी कोशिकाओं) CD11b (granulocytes, monocytes, मैक्रोफेज), CD16 (एन.के. कोशिकाओं, मैक्रोफेज, मस्तूल कोशिकाओं), CD36 (प्लेटलेट्स), CD235a (erythroid सेल), यह कदम (एन.के. कोशिकाओं टी कोशिकाओं) CD2 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करता है गर्भनाल रक्त से गैर - बी कोशिकाओं खलाना. यह वर्णित किट और बी सेल अलगाव नहीं किट द्वितीय का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि पूर्व किट CD43 जो समर्थक बी कोशिकाओं पर मौजूद है के खिलाफ एक एंटीबॉडी शामिल हैं. हमारे सेशन के दौरानइस प्रोटोकॉल के timization, हमने पाया है कि बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 40 μl के एक कुल के लिए एक सकारात्मक सेल सॉर्ट परिणाम का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है. इसके अलावा हम पाया कि बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के रूप में छोटे रूप में 5 μl अधिक का उपयोग करने के लिए सेल प्रकार पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ा. इसलिए, हम अत्यधिक बी CLL बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 40 μl कुल 175-250000000 के बीच mononuclear सेल नंबर के लिए उपयोग करने की अनुशंसा. यदि कोशिकाओं की संख्या कम या अधिक के साथ शुरू करने के लिए यह आवश्यक हो अभिकर्मकों तदनुसार पैमाने पर हो सकता है.
वहाँ कई परस्पर विरोधी मार्करों कि बी कोशिकाओं के उप आबादी भेद किया जा सकता का वर्णन प्रकाशनों हैं. विसंगति की अधिकांश तथ्य यह है कि भेदभाव एक प्रक्रिया पर जा रहा है और या कोशिका की सतह मार्करों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के बजाय एक सब कुछ या कुछ तरीके में क्रमिक ढंग से होता है कि द्वारा समझाया जा सकता है. / CD19 + और + CD45 की तीव्रता के स्तर (- इस प्रोटोकॉल CD34निम्न, मध्यम, उच्च) अभिव्यक्ति CD45 6 भेदभाव की प्रगति के लिए इसी अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि के साथ पूर्व द्विपक्षीय, पूर्व BII और अपरिपक्व बी कोशिकाओं भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्रो बी कोशिकाओं में कुछ लोगों द्वारा वर्णित किया गया है CD19 हो / CD34 + 13 + जबकि दूसरों को पता चला है कि समर्थक बी कोशिकाओं CD19 - / CD34 और पूर्व द्विपक्षीय कोशिकाओं CD19 / CD34 + 9,10 + +. इन विसंगतियों के आधार पर हम देर समर्थक बी कोशिकाओं / जल्दी पूर्व बीआई कोशिकाओं के रूप में CD19 + / CD34 + कोशिकाओं में नामित किया है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इस रणनीति बी कोशिकाओं है कि रोग तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं के अनुरूप अग्रदूत के सबसेट को अलग करने के लिए विकसित किया गया था. हालांकि, वहाँ कई छँटाई रणनीतियों कि ब्याज की सेल subtype पर निर्भर करता है नियोजित किया जा सकता हैं.
एंटीबॉडी fluorochrome संयोजन उपलब्ध सेल सॉर्टर की क्षमताओं के आधार पर चुना जाना चाहिए. एक generaएल नियम, अपने पैनल में प्रतिभाशाली fluorochrome कम से कम अधिक आबादी वाला प्रतिजन और ठीक इसके विपरीत लेबल करने के लिए किया जाना चाहिए. डबल दाग आबादी, विशेष रूप से इस तरह के रूप में इन दुर्लभ घटनाओं का पता लगाने, नक़ल भेदभाव (चित्रा 2B) gating की रणनीति का एक vitally महत्वपूर्ण हिस्सा है. यह सुनिश्चित करता है कि डबल सकारात्मक घटनाओं वास्तव में एकल दोनों एंटीबॉडी और दो नहीं केवल एकल दाग कोशिकाओं को एक दूसरे के पालन के साथ दाग कोशिकाओं रहे हैं.
उच्च गति, 4 तरह सेल छँटाई जरूरी एक नियंत्रित एयरोसोल वातावरण बनाता है. इसलिए, जीना मानव सेल छँटाई महान देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. प्रकाशित सुरक्षा और परिशोधन दिशानिर्देश उपलब्ध हैं और समीक्षा की जानी चाहिए और 14 तरह से पहले लागू किया है. संस्थागत जैवसुरक्षा समितियों या उनके समकक्ष से स्वीकृति छंटाई करने के लिए पहले की आवश्यकता हो सकती है. छंटाई के बाद उचित परिशोधन के लिए, ब्लीच अपशिष्ट कंटेनर के लिए 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा जाना चाहिए. सीmilarly, सभी नमूनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्यूबिंग तत्काल क्षेत्र में सभी सतहों को अच्छी तरह से एक नया बना 10% ब्लीच समाधान के साथ decontaminated किया जाना चाहिए.
सारांश में, इस प्रोटोकॉल बी कोशिकाओं के अग्रदूत के दुर्लभ आबादी को प्राप्त करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है और किसी भी दुर्लभ hematopoietic स्टेम कोशिकाओं और टी कोशिकाओं अपरिपक्व सहित कॉर्ड रक्त में मौजूद आबादी को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. हाल ही में, अपरिपक्व बी कोशिकाओं परिधीय रक्त में उन्नत एचआईवी के साथ 15 व्यक्तियों की पहचान की गई है. इसलिए, इस पद्धति की उपयोगिता रक्त कैंसर के अध्ययन से परे फैली हुई है. अंत में, हम अभी तक प्रवाह क्रमबद्ध कोशिकाओं पर आरएनए isolations प्रदर्शन किया है, हालांकि, इस पद्धति चेतावनी के साथ अनुकूलनीय है कि सेल के दौरान छँटाई कोशिकाओं trizol या RLT के रूप में इस तरह के एक बराबर आरएनए संगत समाधान में सीधे चाहिए RNeasy किट से हल करना चाहिए Qiagen के माध्यम से उपलब्ध है.
Disclosures
लेखक खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R00 NCI CA132784) द्वारा समर्थित किया गया के.टी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
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