Summary
여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.
Abstract
탯줄 혈액은 매우 다른 계보 (Lineage) 헌신의 단계에서 조혈 전구 세포에 풍부합니다. 우리는 B-세포 분화의 네 가지 단계에서 전구체를 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다. 유전자가 표현과 epigenetic 수정은 조직 특정 방식으로 발생되기 때문에,이 게놈과 질병의 발전으로 이어질 수 있습니다 epigenome의 변경을 식별 할 수하기 위해 조직 및 세포 유형 간의 차별하는 매우 중요합니다. 이 방법은 차별화의 단계에서 탯줄 혈액에서 세포 존재하는 모든 종류의에 적응 할 수 있습니다.
이 방법은 4 주 단계를 포함한다. 첫째, mononuclear 세포 밀도 원심 분리에 의해 구분됩니다. 둘째, B-세포 mononuclear 세포에서 비 B-세포를 인식하고 제거 비오틴 복합 항체를 사용하여 풍부하고 있습니다. 제 B-셀은 휘황 개별 단계에 해당 세포 표면 단백질 항체으로 분류됩니다B-세포 개발. 마지막으로, 휘황 레이블 셀이 정렬되어 있으며 각각의 인구가 복구됩니다. 복구 세포는 하류 핵산 assays에서 이용 될 수있는 충분한 수량과 품질입니다.
Introduction
질병에 존재 aberrations를 확인하기 위해, 우리가 건강한 조직 또는 질병에 의해 영향을 조직 또는 세포 유형에 해당하는 세포를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 이것에 대한 이유 중 하나는 조직 유형 간의 epigenetic 변화는 유전자 발현을 조절하기위한 책임이 있으며 정상적인 인간 개발 1,2 동안 세포 차별화에 중요합니다. 두 번째 이유는 비정상 조직 특정 유전자 조절은 정상 개발에 끔찍한 결과가 초래 될 수 있습니다 및 암 등의 질병 상태의 다수에 기여하는 것으로 알려져이다. 따라서, 조혈 세포를 포함 질병의 더 나은 이해가 건강한 조혈 세포에 대한 지식이 필요합니다.
세포 표면의 표현의 변경을 특징으로 사건의 체계적인 순서를 통해 골수 진행에 조혈 세포의 개발은 3 마커. 성인 참가자를 포함하는 연구가소아 참가자를 포함한 연구 전구체 B-세포의 비율이 덜 5 세 6 개인의 상대적으로 높은 것으로 나타났습니다 반면, 골수는 보통 B-세포 4,5 전구체의 낮은 번호를 포함 표시. 탯줄 혈액은 혈액 관련 질환과 malignancies의 치료에 조혈 줄기 세포의 원천으로 사용 탯줄 혈액 은행을 통해 쉽게 사용할 수 있으며 대상 백혈병 등의 여러 질환의 세포이며 미성숙 B와 T 세포 7 농축되어있다 lymphomas.
골수의 전구체 B-세포가 광범위하게 8,9를 phenotyped 된 독특한 하위 집합으로 셀을 정렬하는 데 사용할 수있는 특정 세포 표면 마커의 존재로 정의 할 수 있습니다. 일반 B-세포 분화의 초기 프로-B 세포로 시작하고 미숙 또는 순진한 B-세포에 culminating 골수의 단계 일련의를 통해 진행. 에 따르면반 Zelm 및 동료 10, 프로-B 세포는 CD34의 존재에 의해 무대 2의 전환 (사전 BI)에 CD19이 취득 특징을 가지고 있습니다. 3 단계 (사전 BII) 세포는 더 이상 CD34 Express 및 세포질 IgM을 표현하기 시작합니다. 마지막으로, 4 단계의 정의 특징은 (B-세포 미숙) 표면 IgM의 표현입니다. 이 프로토콜에 설명 된 정렬 전략이 처음 콜드웰 및 동료 6 설명과 크게 복잡성과 셀 정렬 실험을 수행 비용을 절감 불과 3 세포 표면 마커의 사용을 포함했다. 자신의 작품에서 CD45 사이의 관계와 B-세포 분화의 단계가 설립되었습니다. 그들은 골수에서 B-세포가 CD45의 표현의 변수 수준을 표시 관찰했다. 특히, CD45 높은 수준의 표현 세포 표면 IgM을 표명 세포 (미숙 한 B-세포)에 대응, CD45의 중간 수준을 표시하는 페이지는 cytopl을 표명 셀에 대응asmic IgM (예정 BII 세포) 및 CD45의 낮은 수준을 표시하는 페이지는 (예정 BI 세포) 세포질 IgM을 표현하지 않은 셀에 대응. 이 프로토콜은 methylated - 포장 소비재 섬의 복구 분석 등 고품질 핵산의 산을 필요로하는 다운 스트림 assays에서 사용할 수있는 탯줄 혈액 (그림 1)에서 B-세포 (MIRA 전구체의 일부를 분리 할 수 콜드웰 및 동료 6 개발 전략을 사용하여 ) 11 및 정량 실시간 PCR의 assays. 방법은 탯줄 혈액에서 모든 비-B 세포를 고갈에 자기 구슬을 사용하여 초기 분리 직원을 고용하고 있으며 단 3 항체 (CD34, CD19 및 CD45)와 얼룩 필요합니다. 복구하는 세포는 B-세포 분화의 4 단계를 나타냅니다 : 1) CD34 +; CD19 + (후반 프로-B 및 사전 BI 초), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 낮은 (말 사전 BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 메드 (예정 BII) 및 4) CD34 -; CD19 +; CD45 높은 (미숙 한 B-세포).
Protocol
1. 탯줄 혈액에서 Mononuclear 세포의 분리
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 95 ML 린스 버퍼 (1시 20분 희석) 5 ML 소 혈청 알부민 (BSA) 재고 솔루션을 버퍼 추가 준비합니다. 가스를 제거하다 버퍼과 얼음의 버퍼를 유지 중요 :. 가스를 제거하다에 실패 CD19을 분리 할 때 버퍼가 최적의 결과보다이 발생할 수 있습니다 + 거품 절연 열을 차단할 수 있습니다 B-세포 때문입니다.
- 밀도 기울기 원심 분리 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 탯줄 혈액을 처리하는 데 필요한 튜브의 수 (1 관 8 ML의 피를 처리 할 수)를 결정하고 각 튜브에 Ficoll-Paque PLUS 15 ML를 추가합니다.
- 24 ML의 DPBS (1X)과 조심스럽게 층 50 ML 원뿔 튜브의 각 Ficoll-Paque PLUS 상단에 희석 코드 혈액 혼합물을 함께 탯줄 혈액 8 ML을 희석. 피와 Ficoll-Paque PLUS를 섞지 마십시오 중요 :. 코드 혈액과 Ficoll-Paque PLUS의 혼합 방지하기 위해, 45도 각도로 관을 잡고레이어 혈액 혼합 천천히.
- 20 ° C.에 40 분 400 XG에 원심 분리기 Mononuclear 세포 (MNC)은에 유지됩니다 플라스마 Ficoll-Paque PLUS 인터페이스 Ficoll-Paque PLUS의 삼투압에 높은 밀도로 인해 침전 과립 성 백혈구와 적혈구 반면. 샘플 ID, 날짜 및 다음과 같은 제 3 부에 사용되는 라벨 칠 5 ML 내내 아래로 튜브 :
| 관 | 상표 | 목적 |
| 1 | 흠없는 | 유동 세포 계측법 동안 정상화를위한 흠없는 세포 |
| 이 | 7AAD | 유동 세포 계측법 동안 생존을 확인하려면 |
| 3 | + + + | 정렬 될 셀을 포함 |
| 4 | 34 + | CD34 + / CD19를 수집하려면 +(후반 프로-B - 초 전 BI) 세포 |
| 5 | 낮은 45 | / CD19 낮은 + / CD45 (예정 BI) 세포 - CD34를 수집하려면 |
| 6 | 45 메드 | / CD19 + / CD45 메드 (예정 BII) 세포 - CD34를 수집하려면 |
| 7 | 고 45 | / CD19 + / CD45 고 (미숙 B) 세포 - CD34를 수집하려면 |
코트 튜브 4, 5, 6, 7 2퍼센트 FBS로하고 얼음에있는 모든 튜브를 놓습니다.
- 주의 깊게 상위 플라즈마 층을 기음과 mononuclear 세포 층과의 접촉을 피하십시오. 10 ML 유리 피펫 사용하여, 신중하게 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 mononuclear 세포 레이어를 전송할 수 있습니다. 하나의 50 ML 튜브에 함께 셋 튜브에서 mononuclear 세포를 결합합니다.
- PBS로 관을 채우기에서 10 분 300 XG에 부드럽게 혼합 원심 분리기20 ° C. 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 1X를 반복합니다. 첫 번째 세척 후 알약을 resuspend하고 단일 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 부드럽게 PBS 200 μl의 세포 펠렛을 resuspend. , 세포 현탁액 1 μl를 제거 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 PBS 1 ML에 추가하고 (원심 분리기에서 50 ML 세포 현탁액을 삽입 한 후 셀을 계산) 계산을 위해 따로 설정합니다. PBS로 관을 입력하고 혈소판을 제거하는 15 분을 위해 200 XG에 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서 완전히 표면에 뜨는을 제거합니다.
2. 맥 분리를 사용하여 Mononuclear 세포에서 수정 된 B-세포 절연
- 160 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼로 단계 1.7에서 펠렛을 Resuspend.
- 40 μl B-CLL 비오틴 항체 칵테일을 추가합니다. 4 ° C.에 잘 섞어 10 분에 품다하는 피펫
- 세포를 씻으 - 1 ML 감기 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 만 10 당 세포 (세포 뉴 추가mber 단계 1.7)에 결정하고 10 분 300 XG에 원심 분리기. 완전히 표면에 뜨는을 대기음 후 320 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼에있는 셀 펠렛을 resuspend.
- 80 μl 방지 비오틴 MicroBeads을 추가, 4 ° C.에 잘 섞어 15 분에 품다
- 세포를 씻으 - 1 ML 추위 10 분 300 XG에서 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 만 10 당 세포와 원심 분리기를 추가합니다. 감기에 500 μl (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼으로 1 억 명의 셀 Resuspend. 휴대폰 번호에 따라 크기 버퍼 볼륨입니다.
- 원심 분리 (단계 2.5) 동안 맥 열 및 Mac 구분 기호를 준비합니다. 맥 구분의 자기장에 LS 열을 놓고, 차가운 3 ML (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 열로를 추가하고 버퍼 칼럼을 통해 똑 할 수 있습니다. 를 통해 흐름을 잡아 소켓을 사용합니다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오.
- 항목 아래의 50 ML 원뿔 튜브를 놓고 열에 세포 현탁액을 피펫. 라벨이없는 세포 통해서을 똑 할 수 있도록 허용H는 열 및 50 ML 원뿔 튜브에. 중요 :이 항체 라벨과 셀 정렬에 사용되는 셀입니다. 을 통해 흐름을 폐기하지 마십시오. 단계 2.5에서의 모든 셀을 복구하려면, 원추형 튜브의 벽에 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼의 추가 한 ML을 추가합니다. 부드럽게 섞어서 열에 남아있는 세포 현탁액을 피펫. 1X를 반복합니다. 열 통과 후 원뿔 튜브에 수집 된 라벨이없는 세포를 사용하여 2.8 단계로 진행합니다.
- 10 분 300 XG에서 PBS와 원심 분리기와 라벨이없는 세포를 포함하는 원뿔 튜브를 입력합니다. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 제거합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼 200 μl를 추가하고 부드럽게 세포를 resuspend.
3. 셀 정렬에 대한 항체 라벨링 및 준비
- (단계 1.4) "흠없는"이라는 튜브에 세포 현탁액 및 장소 1 μl를 대기음. 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼를 추가하고 얼음에 튜브를 저장합니다.
- 20 추가나머지 세포 현탁액에 백만 셀 당 각 항체의 μl (CD19, CD34 및 CD45). 잘 섞어서 RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 튜브를 놓습니다. 불이 해제와 함께 CD 항체 2-4 빛에 민감한, 완료 단계입니다.
- 항체와 부화의 30 분 후, 세포 현탁액의 40 μl를 기음과 "7AAD"이라는 튜브에 넣습니다. 2 분 500 XG에서 튜브와 원심 분리기로 1 ML PBS를 추가합니다. 표면에 뜨는를 제거하고 바인딩 버퍼 100 μl의 세포를 resuspend. 7AAD 7 μl (7 Aminoactinomycin D)를 추가하고 RT에서 10 분 동안 짙은 어둠 속 품다. 10 분 부화 단계를 완료 3.4 동안.
- CD 항체가 표시된 남아있는 세포를 포함하는 관의 상단에 PBS를 추가합니다. 3 분 500 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는을 제거, 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼를 추가하고 셀 펠렛을 resuspend. "+ + +"이라는 튜브에 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송합니다. 세포 현탁액의 모든 복구하려면"+ + +"표시 관에 50 ML 원뿔 튜브 및 전송에 DD는 추가 한 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - PBS 버퍼.
- 부화 후 (단계 3.3), 7AAD 튜브에 300 μl 바인딩 버퍼를 추가 할 수 있습니다. "흠없는", "7AAD"와 "+ + +"샘플 "34 +", "45 낮은", "45 메드"와 "45 고"튜브는 유동 세포 계측법에 대한 준비가되어 있습니다.
4. MoFlo XDP 흐름 Cytometer를 사용하여 셀 정렬
- 정렬에 대한 설정 MoFlo는 : 레이저를 정렬, 비말 스트림을 안정화, 드롭 지연을 결정합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen ABC 마우스 구슬 키트를 (또는 이와 유사한 것)를 사용하여 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다. 긍정적이든 부정적 인구의 최적 분리에 대한 형광 채널의 전압을 조정, 단일 색상 컨트롤을 실행합니다. 보상 계수를 설정하고 보상 매개 변수를 수집 프로토콜에를 적용 할 수 있습니다. 보상 계수에게 항체의 새 많은 취득 때마다 다시 설정합니다.
- 그림 2와 같이 플롯 등의 프로토콜을 만듭니다.
- , 흠없는 샘플을 실행 전압과 순방향 및 측면 분산을위한 게인을 설정하고 부정적인 형광 인구를 식별합니다. DNA 복구는 종류의 목표이기 때문에, 기준 액은 DNA 함유 파편 복구 샘플을 오염하지 않습니다 (≤ 1 %) 낮은 수 있도록 설정해야합니다. * 에어로졸 피난 시스템은 인간의 세포는 MoFlo에서 실행되는 생활을 항상 실행되고 있는지 확인합니다.
- 게이팅 전략 (그림 2)를 설정합니다 + + + 샘플 (~ 50,000 이벤트)의 작은 나누어지는을 실행합니다. B-세포 progenitors은 B-세포를 성숙에 동일하게 분산하지 않으므로, 림프구 게이트 잠재적 인 프로-B 세포를 포함하기 위해 SSC 대 FSC 계획에 + / CD34 + 인구 ungated CD19을 backgate. 이 샘플에서도 7AAD에 대한 부정적인 형광 인구를 설정합니다.
- 샘플 생존을 결정하는 7AAD 샘플을 실행합니다. 에서 높은 경쟁력있는 샘플에서 정렬 셀죽은 세포와 같은 초기은 (≥ 95 %) 무차별 착색하고 정렬 인구를 오염 할 수 있습니다.
- 네 인구를 수집하기 위해 정렬 결정을 설정 : CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 낮은, CD19 + / CD34 - / CD45 의대, 그리고 CD19 + / CD34 - 고 / CD45. 모든 인구의 정렬 결정에 림프구와 쌍으로 된 것 차별 게이트를 포함합니다.
- 정렬 팁에 나막신을 방지하기 위해 필터 + + 바로 정렬 및 집계는 정렬하는 동안 샘플에서 발생하는 경우 다시 필터 전에 40 μm 셀 스트레이너를 통해 + 샘플.
- 냉각 또는 얼음 포장 튜브 홀더에 PBS에서 2퍼센트 FBS으로 코팅 수집 튜브 (단계 1.4)으로 세포를 정렬합니다.
- 정렬이 완료 직후, DNA의 압축을 풉니 다.
Representative Results
샘플 사이에 차이는 셀 정렬 (표 1)의 성공에 역할을합니다. 좋은 성공 속도로 샘플 오염 파편의 낮은 수준 (그림 3A)가 가난한 성공 속도로 샘플 오염 파편 높은 수준의 (그림 3B)가. 코드 혈액 샘플을 선적 24 시간 (O / N 우선) 내에서 수집 한 경우 샘플 사이에 변화가 다소 제어 할 수 있습니다.
각 전구체 B-세포 부분 집합의 흐름 정렬 전지는 충분한 수량과 핵산 isolations을 수행 할 품질입니다. 고립 된 DNA는 높은 품질이며, 하류 분석에 사용할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 methylated DNA (그림 4)에 대한 풍부 MIRA 11이 DNA를 사용합니다.
| 탯줄 혈액 시설 데이터 | 나쁨 정렬 | |
| 항응고제와 협력 혈액 양 (ML) | 110 | 104 |
| 백혈구 [10 3 / μl] | 8.68 | 11.19 |
| 림프구 [10 3 / μl] | 3.88 | 3.76 |
| 림프구 (%) | 44.70 | 33.6 |
| 적혈구 [10 6 / μl] | 3.65 | 3.05 |
| 자체 데이터 | ||
| Ficoll-Paque 후 휴대폰 번호 | 206 M | 309 M |
| 맥 분리 후 휴대폰 번호 | 22 M | 16.5 M |
| 총 이벤트 수 카운트 (MoFlo XDP) | 30.57 M | 19.97 M |
| 생존 (%) | 98.00 | 98.00 |
| 림프구 게이트의 셀 (%) 17.00 | 50.00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| 총 휴대폰 번호 | 10,959 | 48,316 |
| 총 이벤트 수 비율 (%) | 0.04 | 0.24 |
| 능률 | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - 낮은 / CD45 | ||
| 총 휴대폰 번호 | 16,619 | 26,941 |
| 총 이벤트 수 비율 (%) | 0.05 | 0.13 |
| 능률 | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 메드 | ||
| 총 휴대폰 번호 | 469745 | 507540 |
| 총 이벤트 수 비율 (%) | 1.54 | 2.54 |
| 능률 | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - 고 / CD45 | ||
| 총 휴대폰 번호 | 1896062 | 2047142 |
| 총 이벤트 수 비율 (%) | 6.2 | 10.25 |
| 능률 | 91% | 90% |
표 1. 대표 셀 정렬 통계. 행 1-5 탯줄 혈액 시설에서 제공하는 중요합니다. 나머지 행은 우리의 연구실에서 데이터를 수집합니다. 가난한 정렬은 파편 높은 수준의와 림프구 게이트에서 세포의 낮은 비율이 포함되어 있습니다.
Figu1 다시. 절차의 흐름 차트입니다. 탯줄 혈액이 처리되고 mononuclear 세포는 Ficoll-paque 플러스를 사용하여 절연하고 있습니다. 추가 세척 단계는 오염 혈소판을 제거하는 포함되어 있습니다. B-세포는 맥 인간 B 세포 절연 키트 (B-CLL)를 사용하여 mononuclear 세포로부터 분리되어 있습니다. 이 단계는 모든 비-B 세포를 제거하는 (CD2, CD4, CD11b, CD36, 안티 IGE와 CD235a) 비오틴 - 복합 단클론 항체를 사용합니다. 복구 B-세포는 다음 전구체 B-세포 하위 집합을 복구 할 수있는 MoFlo XDP 흐름 cytometer를 사용 정렬 CD19-APC, CD34-PE 및 CD45-FITC 항체으로 분류됩니다 : CD19을 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 , CD19 + / CD34 - / CD45 의대, 그리고 CD19 + / CD34 - 고 / CD45.
그림 2. 팝업을 파악하고 분류 게이팅 전략ulations. 빨간색 화살표는 다음 플롯에 적용됩니다 게이트를 나타냅니다. R4, R5, R6 및 R7 문은 정렬 인구를 나타냅니다.) 앞으로 대 강화 림프구 인구를 보여주는 사이드 분산 형 플롯. R1, 림프구 게이트. b)는 높이 대 단일 세포 대 doublets를 식별하기 위해 앞으로 분산 형 플롯의 너비. R2, 단일 셀 게이트. C) CD19-APC 긍정적 인 세포는 CD34-PE 부정적 및 긍정적 인 인구로 나눌 수 있습니다. R3, CD19 + / CD34 - 게이트, R4, CD19 + / CD34 + 게이트 나타내는 원하는 정렬 인구 D) CD19 + / CD34 - 세포 세 다소 독특한 CD45-FITC 인구로 나눌 수 있습니다.. R5 및 R6, CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 CD19 + / CD34 - / CD45 의대 인구, 각각. R7은 때문에 CD19 + / CD34 높은 세포 숫자 - 높은 인구 / CD45, 이러한 종류의 게이트 만 포함인구의 부분입니다. 이 인구의 모든 세포는 하류 분석을 위해 수집 할 필요가 없습니다.
그림 3.) 항목을 농축 한 후 파편을 오염 낮은 수준. R1, 림프구 게이트. b)는 열 농축 한 후 파편을 오염 높은 수준의.
4 그림. 전구체 B-세포의 하위 집합에서 methylated DNA의 농축이 있습니다. 전구체 B-세포 하위 집합에서 격리) Sonicated DNA는 높은 품질입니다. 도서관 건설 DNA를 들어 200-600 BP의 평균 sonicated 수 있습니다. 레인 1 : Promega 100 BP의 사다리 (카탈로그 # G2101), 차선 2 : 격리 총 DNA CD19에서 + / CD34 + 세포, 차선 3 : CD19로부터 격리 총 DNA + - / CD45 낮은 세포, 차선 4 : CD19 + / CD34로부터 격리 100 NG DNA - / CD45 의대 세포, 차선 5 : CD19 + / CD34로부터 격리 100 NG DNA - / CD45 높은 세포. DNA는 9 분 (; 30 초 OFF ON 30 초)의 총 고등학교에 Diagenode의 Bioruptor를 사용하여 sonicated되었습니다. DNA는 열 정화이고 SYBR 녹색 핵산 젤 얼룩과 1 % 아가로 오스 겔에 시각화. B) MIRA는 ActivMotif MethylCollector 울트라 키트, SLC25A37과 PCR (1-6)와 APC1 (7-12)를 사용 후는 확인을 위해 수행됩니다 methylated DNA의 농축. 1 & 7 : Sonicated 게놈의 DNA (NO MIRA), 2 및 8 : MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 & 9 : MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 낮은 DNA, 4 & 10 : MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 의대 DNA, 5 & 11 : MIRA - CD19 + / CD34 - / CD45 높은 DNA, 6 & 12 : 물 제어 할 수 있습니다. SLC25A37 높은 증폭는 methylated DNA의 농축을 확인전구체 B-세포의 하위 집합 인치
Discussion
프로토콜의 성공에 가장 큰 영향 요인은 파편을 오염의 존재입니다. 코드 혈액 은행에서 혈액을 요청하는 경우에는 혈액이 빨리 수집 한 후 가능한 한 출하하는 것이 중요합니다. 또한, lymphocytosis으로 분류 된 샘플 림프구 높은 숫자를 포함하지만, 이러한 샘플 전구체 B-세포의 충분한 숫자가없는 사용하지 않아야합니다. 우리는 탯줄 혈액의 적어도 85 ML로 시작하는 것이 좋습니다 전구체 하위 집합 각각에 대해 세포의 충분한 숫자를 획득 확률을 증가 할 수 있습니다.
그것은 성인 말초 혈 분리는 달리, 탯줄 혈액을 fractionating 때 mononuclear 레이어가 종종 적혈구 12 오염이 오니, 이용에 참고하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 오염 혈소판을 제거 할 수있는 별도의 세척 단계가 포함되어 있습니다. 탯줄 혈액에서 mononuclear 분리를 설명하는 프로토콜은 용해 단계 t 등의 제안원치 않는 붉은 세포를 제거 O. 이 오염 파편을 생산하고 세포 종류의 성공에 부정적인 영향을 가지고 있기 때문에 우리는이 단계를하지 않는 것이 좋습니다.
유동 세포 계측법에 의해 구별 할 필요가 세포의 수를 줄이기 위해 그 전에 셀 정렬에 B-세포 농축을 수행 할 필요가 있습니다. B-셀 절연 키트 (B-CLL)을 함께 Miltenyi Biotec,에서 제공 프로토콜은 말초 혈에 대해 최적화되어 있으며 10,000,000 세포 당 10 μl B-CLL 비오틴 항체 칵테일을 사용하는 것이 좋습니다되었습니다. , CD4 (T 세포), CD11b (과립 성 백혈구, 단핵 세포, 대 식세포), CD16 (NK 세포, 대 식세포, 마스트 세포), CD36 (혈소판), CD235a (erythroid 세포),이 단계 CD2 (NK 세포 T 세포)에 대해 항체를 사용 탯줄 혈액에서 비-B 세포를 고갈합니다. 이 전 키트는 프로-B 세포에 존재하는 CD43에 대한 항체가 포함되어 있기 때문에 설명 된 키트가 아닌 B-세포 분리 키트 II를 사용하는 것이 중요합니다. 우리 조합 중이 프로토콜의 timization, 우리는 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 40 μl의 총 긍정적 인 셀 정렬 결과를 생산하기에 충분한 것으로 나타났습니다. 또한 우리는 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 최소 5와 μl 더를 사용하여 셀 정렬에 부정적 영향을 가지고있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 고도의 175-250000000 사이의 총 mononuclear 세포 숫자를 B-CLL 비오틴 항체 칵테일의 40 μl를 사용하는 것이 좋습니다. 세포의 낮은 또는 높은 숫자로 시작하는 경우가 그에 따라 시약을 확장 할 필요가있을 수 있습니다.
B-세포의 하위 인구 구별하는 데 사용할 수 있습니다 마커를 설명하는 수많은 충돌 간행물가 있습니다. 차이의 대부분은 차별화가 지속적 과정이며, 세포 표면 마커의 유무가 점진적 방식으로 대신 전부 또는 아무것도 방식으로 발생한다는 사실에 의해 설명 될 수있다. / CD19 + 및 CD45 + (의 강도 수준 -이 프로토콜 CD34에낮은) 높은, 중간 표현은 차별화 6의 진행에 해당하는 CD45 표현의 수준 증가와 함께 사전 BI, 사전 BII와 미숙 한 B-세포를 구별하는 데 사용되었다. 프로 B 세포는 CD19 할 몇 가지에 의해 설명 된 + / CD34 + 13 다른 프로-B 세포가 CD19 아르 것으로 나타났습니다 동안 - / CD34 + 및 사전 BI 세포가 CD19 + / CD34 + 9,10 있습니다. 이러한 불일치를 바탕으로 우리는 늦은 프로-B 세포 / 초 사전 BI 세포로 CD19 + / CD34 + 세포를 지정하고 있습니다. 그것은이 전략을 구체 질병 급성 lymphoblastic 백혈병에 의해 영향을 세포에 해당하는 B-세포의 일부를 분리하기 위해 개발 된 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 관심의 세포 하위 유형에 따라 사용될 수있다 여러 정렬 전략이 있습니다.
항체 - fluorochrome 조합은 사용 가능한 셀 정렬의 기능에 따라 선택해야합니다. 장군으로리터 규칙, 당신 패널의 밝은 fluorochrome은 적어도 인구가 항원과 반대의 라벨을 사용해야합니다. 특히 이중 스테인드 인구, 다음과 같은 희귀 한 이벤트를 감지에서 이중 어 차별 (그림 2B)는 게이팅 전략의 극히 중요한 부분입니다. 이것은 두 번 긍정적 인 이벤트가 항체와 서로 준수 단순히 두 개의 싱글 - 스테인드 세포 모두 물들 진정으로 하나의 세포 보장합니다.
고속, 4 방향 전지 정렬 반드시 통제 된 에어로졸 환경을 만듭니다. 따라서, 라이브 인간의 세포 정렬은 아주 조심 수행해야합니다. 게시 안전 및 오염 제거 지침은 가능하며 정렬 14 전에 검토하고 구현해야합니다. 기관 바이오위원회 또는 등가물의 승인을 분류하기 전에해야 할 수 있습니다. 정렬 후 적절한 정화를 들어, 표백제는 10 %의 최종 농도에 폐기물 컨테이너에 추가해야합니다. 시milarly, 모든 샘플 튜브뿐만 아니라이 지역의 모든 표면은 철저하게 갓 만든 10 % 표백제 용액으로 소독해야합니다.
요약이 프로토콜은 전구체 B-세포의 희귀 한 인구를위한 전략을 제공하며, 조혈 줄기 세포와 T-세포 미숙 등의 탯줄 혈액에 존재하는 희귀 한 인구를 분리하도록 수정 될 수 있습니다. 최근 미숙 한 B 세포는 고급 HIV 15 개인의 말초 혈에서 확인되었습니다. 따라서,이 방법의 유틸리티는 혈액 암의 연구 초과합니다. 마지막으로, 우리는 아직 흐름이 정렬 세포에서 RNA의 isolations를 수행하지 않은하지만,이 방법은 셀 동안 세포 RNeasy 키트에서 trizol이나 RLT 등 상응하는 RNA 호환 솔루션에 직접 정렬해야 정렬한다는 점을 유의 적응해야합니다 Qiagen를 통해 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 수 없어요.
Acknowledgments
이 작품은 KT에 국립 보건원 (NCI R00 CA132784)에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
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