Summary
Her beskriver vi en protokol til isolering af undergrupper af precursor B-celler fra navlestrengsblod. En tilstrækkelig mængde og kvalitet af nukleinsyrer kan ekstraheres fra cellerne og anvendt i efterfølgende assays under anvendelse af DNA eller RNA.
Abstract
Navlestrengsblod er stærkt beriget med hæmatopoietiske progenitorceller ved forskellige linjeforpligtelse faser. Vi har udviklet en protokol til isolering af precursor B-celler ved fire forskellige stadier af differentiering. Fordi gener udtrykkes og epigenetiske ændringer forekommer i en vævsspecifik måde, er det vigtigt at skelne mellem væv og celletyper med henblik på at kunne identificere ændringer i genomet og epigenome som kan føre til udvikling af sygdommen. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til enhver type celle i navlestrengsblod på ethvert stadium af differentiering.
Denne fremgangsmåde omfatter 4 vigtigste trin. Det første er mononukleære celler separeret ved densitetscentrifugering. For det andet er B-celler beriget med biotin konjugerede antistoffer, som genkender og fjerne ikke-B-celler fra mononukleære celler. Tredje B-cellerne fluorescensmærkes med celleoverfladeprotein antistoffer specifikke for de enkelte faseraf B-celleudvikling. Endelig er de fluorescensmærkede celler sorteret og enkelte populationer udvindes. De udvundne celler er af tilstrækkelig mængde og kvalitet til at blive anvendt i efterfølgende nukleinsyre-assays.
Introduction
For at identificere afvigelser, der er til stede i sygdom, er det meget vigtigt, at vi bruger sunde væv eller celler, der svarer til det væv eller celletype er ramt af sygdommen. En af grundene hertil er, at epigenetisk variation blandt vævstyper er ansvarlig for at regulere genekspression og er kritisk for cellulær differentiering under normal human udvikling 1,2. En anden grund er, at afvigende vævsspecifik genregulering kan have alvorlige konsekvenser for normal udvikling og er kendt for at bidrage til en lang række sygdomstilstande, herunder cancer. Derfor er en bedre forståelse af en sygdom, hvor hæmatopoietiske celler kræver viden om sunde hæmatopoietiske celler.
Udviklingen af hæmatopoietiske celler i knoglemarven fortsætter gennem en systematisk rækkefølge af begivenheder er kendetegnet ved ændringer i ekspressionen af celleoverflademarkører 3. Undersøgelser med voksne deltagere harvist, at knoglemarv indeholder sædvanligvis et lavt antal precursor B-celler 4,5, mens undersøgelser med pædiatriske deltagere har vist, at procentdelen af precursor B-celler er relativt høj i individer under 5 år 6. Navlestrengsblod anvendes som kilde til hæmatopoietiske stamceller til behandling af blod-relaterede lidelser og maligniteter, er let tilgængelige via ledningen blodbanker og er beriget for umodne B-og T-celler 7, som er målcellerne af flere lidelser, herunder leukæmi og lymfomer.
Precursor B-celler i knoglemarven er blevet grundigt fænotypebestemt 8,9 og kan defineres ved tilstedeværelsen af specifikke celleoverflademarkører, som kan anvendes til at sortere disse celler til distinkte undergrupper. Normale B-celledifferentiering forløber gennem en række trin i knoglemarven begynder med de tidligste pro-B-celler og kulminerer i umodne eller naive B-celler. Ifølgetil van Zelm og kolleger 10, er pro-B-celler er karakteriseret ved tilstedeværelsen af CD34 og i overgangen til 2. trin (Pre-BI) CD19 erhverves. Trin 3 (Pre-BII) celler ikke længere udtrykker CD34 og begynder at udtrykke cytoplasmatisk IgM. Endelig et iboende træk ved trin 4 (umoden B-celler) er udtryk for overfladen IgM. Den sortering strategi, der beskrives i denne protokol, blev først beskrevet af Caldwell og kolleger 6 og indbefatter anvendelsen af kun 3 celleoverflademarkører som i høj grad reducerer kompleksiteten og omkostningerne ved at udføre cellesortering eksperimenter. I deres arbejde blev et forhold mellem CD45 og stadier af B-celledifferentiering etableret. De bemærkede, at B-celler i knoglemarven viser variable niveauer af ekspression af CD45. Specifikt celler, som udtrykte høje niveauer af CD45 svarede til celler, som udtrykte overflade IgM (umodne B-celler), de, der udtrykte et mellemliggende niveau af CD45 svarede til celler, som udtrykte cytoplasmic IgM (præ-BII celler), og de, der udtrykte lave niveauer af CD45 svarede til celler, som ikke udtrykker cytoplasmatisk IgM (præ-BI-celler). Denne protokol anvender den strategi, som Caldwell og kolleger 6 til isolere undergrupper af precursor B-celler fra navlestrengsblod (fig. 1), som kan anvendes i efterfølgende assays, der kræver høj kvalitet nukleinsyrer såsom methyleret CpG-ø recovery assay (MIRA ) 11 og kvantitative real-time PCR assays. Fremgangsmåden anvender en indledende adskillelse ved hjælp af magnetiske perler at udtømme alle ikke-B-celler fra navlestrengsblod og kræver farvning med kun 3-antistoffer (CD34, CD19 og CD45). De celler, der er udvundet repræsenterer fire stadier af B-celledifferentiering: 1) CD34 +, CD19 + (sene pro-B og tidlige præ-BI), 2) CD34 -, CD19 +, CD45 lav (sene pre-BI); 3) CD34 -, CD19 +, CD45 with (pre-BII) og 4) CD34 -; CD19 +; CD45 high (umodne B-celler).
Protocol
1. Isolering af mononukleære celler fra navlestrengsblod
- Forbered EDTA-PBS-puffer-tilsæt 5 ml bovint serumalbumin (BSA) stamopløsning til 95 ml skyllepuffer (1:20 fortynding). Afgasses pufferen og holde bufferen på is VIGTIGT:. Manglende afgasse bufferen kan resultere i mindre end optimale resultater ved isolering af CD19 + B-celler, fordi bobler kan blokere isolation kolonnen.
- Forbered 50 ml koniske rør til densitetsgradientcentrifugering. Bestemme det antal rør, der kræves til forarbejdning af navlestrengsblod (1 rør kan behandle 8 ml blod), og der tilsættes 15 ml Ficoll-Paque PLUS til hvert rør.
- Fortynd 8 ml navlestrengsblod med 24 ml DPBS (1x) og forsigtigt lag den fortyndede navlestrengsblod blanding oven på Ficoll-Paque PLUS i hver af de 50 ml koniske rør. Bland ikke blod og Ficoll-Paque PLUS VIGTIGT:. At undgå blanding af navlestrengsblod og Ficoll-Paque PLUS, holde røret i en 45 graders vinkel oglag blodet blandingen langsomt.
- Centrifuger ved 400 x g i 40 minutter ved 20 ° C. Mononukleare celler (MNC) vil forblive på plasma-Ficoll-Paque PLUS grænseflade henviser til granulocytter og erythrocytter sediment som følge af højere densitet ved det osmotiske tryk af Ficoll-Paque PLUS. Label syv 5 ml rundbundet rør, der skal anvendes i del 3 med prøve-ID, dato og følgende:
| Tube | Label | Formål |
| 1 | Ufarvet | Ufarvede celler til normalisering under flowcytometri |
| 2 | 7AAD | At bestemme levedygtighed under flowcytometri |
| 3 | + + + | Indeholder de celler, der vil blive sorteret |
| 4 | 34 + | At indsamle CD34 + / CD19 +(Sen pro-B - tidlig pre-BI) celler |
| 5 | 45 ringe | At indsamle CD34 - / CD19 + / CD45 lav (pre-BI) celler |
| 6 | 45 with | At indsamle CD34 - / CD19 + / CD45 MED (pre-BII) celler |
| 7 | 45 høj | At indsamle CD34 - / CD19 + / CD45 high (umodne B-celler) |
Coat rør 4, 5, 6 og 7 med 2% FBS og anbringe alle rør på is.
- Aspirer øvre plasmalaget omhyggeligt og undgå kontakt med den mononukleære cellelag. Anvendelse af en 10 ml glas-pipette forsigtigt det mononukleære cellelag til en ny 50 ml konisk rør. Kombiner de mononukleære celler fra tre rør sammen til en enkelt 50 ml rør.
- Fyld røret med PBS, bland forsigtigt og centrifuger ved 300 x g i 10 minutter ved20 ° C. Forsigtigt sug supernatanten uden at forstyrre cellepelleten. Gentag 1x. Efter den første vask, resuspenderes pellets og overførsel til en enkelt 50 ml konisk rør.
- Forsigtigt resuspendere cellepelleten i 200 pi PBS. Fjern 1 pi af cellesuspensionen, føje den til 1 ml PBS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og sat til side til optælling (tælle celler efter anbringelse af 50 ml cellesuspension i centrifugen). Fyld røret med PBS og centrifugeres ved 200 x g i 15 minutter til fjernelse af blodplader. Supernatanten fjernes fuldstændigt uden at forstyrre cellepelleten.
2. Modificeret B-celle Isolering af mononukleære celler ved anvendelse af MACS Separation
- Resuspender pellet fra trin 1,7 med 160 pi kold (4 ° C) EDTA-PBS-buffer.
- Tilsæt 40 ul B-CLL biotin antistof cocktail. Pipetteres at blande brønd og inkuberes i 10 min ved 4 ° C.
- Vask cellerne - tilføj 1 ml kold (4 ° C) EDTA-PBS buffer per 10 millioner celler (celle nowmber bestemt i trin 1.7) og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter. Aspirer supernatanten helt og derefter resuspendere cellepelleten i 320 pi kold (4 ° C) EDTA-PBS-buffer.
- Der tilsættes 80 ul anti-biotin-mikrokugler, bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellerne - tilføj 1 ml kold (4 ° C) EDTA-PBS buffer per 10 millioner celler og centrifugeres ved 300 xg i 10 min. Resuspendere op til 100 millioner celler i 500 pi kold (4 ° C) EDTA-PBS-buffer. Scale buffervolumen ifølge celleantal.
- Forbered MACS Kolonner og Macs Separatorer under centrifugering (trin 2,5). Placer en LS kolonnen i det magnetiske felt af MACS separatoren, tilsættes 3 ml kold (4 ° C) EDTA-PBS-puffer på søjlen og tillade, at pufferen at dryppe gennem søjlen. Brug en beholder til at fange gennemstrømningen. Kassér gennemstrømningen.
- Anbring en 50 ml konisk rør under kolonnen og pipetteres cellesuspensionen på søjlen. Tillad de umærkede celler at dryppe through søjlen og ind i 50 ml konisk rør. VIGTIGT: Disse er de celler, der skal anvendes til antistofmærkning og cellesortering. Smid ikke gennemstrømningen. At genvinde alle cellerne fra trin 2.5, tilsættes yderligere 1 ml kold (4 ° C) EDTA-PBS-buffer til væggene i den koniske rør. Bland forsigtigt og pipetteres den resterende cellesuspension på søjlen. Gentag 1x. Fortsæt til trin 2,8 ved hjælp af de umærkede celler opsamlet i den koniske rør efter at have passeret gennem søjlen.
- Fyld den koniske rør indeholdende umærkede celler med PBS og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter. Omhyggeligt fjerne supernatanten uden at forstyrre cellepelleten. Der tilsættes 200 pi EDTA-PBS-buffer og forsigtigt resuspendere cellerne.
3. Antistof Mærkning og forberedelse til cellesortering
- Aspirere 1 ml af cellesuspensionen og anbringes i rør mærket "ufarvet" (trin 1.4). Der tilsættes 500 pi EDTA-PBS-buffer og opbevares røret på is.
- Tilsæt 20pi af hvert antistof (CD19, CD34 og CD45) per million cells ind i den resterende cellesuspension. Bland godt og anbring røret i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur. CD-antistoffer er lysfølsomme, komplet trin 2-4 med lysene slukkes.
- Efter 30 minutters inkubation med antistoffer, aspireres 40 pi af cellesuspensionen og placere den ind i røret mærket "7AAD". Tilsæt 1 ml PBS ind i røret og der centrifugeres ved 500 x g i 2 min. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 100 ul bindingsbuffer. Tilsættes 7 pi af 7AAD (7-Aminoactinomycin D) og inkuberes i mørke i 10 minutter ved stuetemperatur. I løbet af 10 min inkubation komplet trin 3.4.
- Tilsættes PBS til toppen af røret, der indeholder de resterende celler mærket med CD-antistoffer. Centrifuger røret ved 500 x g i 3 min. Supernatanten fjernes, tilsættes 500 pi EDTA-PBS-buffer og resuspender cellepelleten. Overfør hele mængden af cellesuspensionen i røret mærket "+ + +". At kræve den cellesuspension endd yderligere 1 ml EDTA-PBS-puffer til 50 ml konisk rør og overførsel ind i røret mærket "+ + +".
- Efter inkubering (trin 3.3), tilsættes 300 pi bindingspuffer i 7AAD rør. The "unstained", "7AAD" og "+ + +" prøverne og "34 +", "45 lav", "45 with" og "45 high" rør er klar til flowcytometri.
4. Cellesortering ved hjælp af MoFlo XDP Flow Cytometer
- Set-up MoFlo til sortering: Juster lasere, stabilisere dråbestrøm, bestemme drop forsinkelse.
- Forbered enkelt farvekompensationsindstillinger kontrol ved hjælp af Invitrogen AbC Mouse perle kit (eller lignende) i henhold til producentens anvisninger. Kør enkelt farve kontrol, justering af spændinger på fluorescenskanaler for optimal adskillelse af positive og negative populationer. Indstil kompensation koefficienter og anvende kompenseret parameter til samling protokol. Genetablere kompensation koefficienter hver gang et nyt parti af antistof opnås.
- Opret protokol herunder plots som vist i figur 2.
- Kør ufarvet prøve, indstille spænding og gevinst for fremad og sidespredning, og identificere negative fluorescens befolkninger. Fordi DNA recovery er formålet med den slags, bør tærsklen sættes lavt (≤ 1%), således at DNA-holdige rester ikke kontaminerer de genvundne prøver. * Sørg for, at Aerosol Evacuation System kører på alle tidspunkter, der lever humane celler bliver kørt på MoFlo.
- Kør en lille prøve af de + + + sample (~ 50.000 hændelser) for at indstille gating strategien (figur 2). Idet B-celle-progenitorer ikke scatter identisk til modne B-celler, backgate den ungated CD19 + / CD34 +-populationen på SSC vs FSC plot for at sikre lymfocytporten indbefatter potentielle Pro-B-celler. Fra denne prøve også indstille negative fluorescens befolkning for 7AAD.
- Kør 7AAD prøve at bestemme prøve levedygtighed. Kun Sorter celler fra en prøve med høj levedygtighed påbegyndelsen (≥ 95%) som døde celler vil farve flæng og kan forurene sortere populationer.
- Nedsat sortere beslutninger om at indsamle fire populationer: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 lav, CD19 + / CD34 - / CD45 with og CD19 + / CD34 - / CD45 high. Medtag lymfocyt og dublet diskrimination porte i sorteringsvalg beslutninger for alle bestande.
- For at undgå tilstopning i sorteringsanlægget spids, filter + + + prøve gennem en 40 um celle si umiddelbart før sortering og re-filter, hvis nogen aggregering forekommer i prøven under sortering.
- Sortere cellerne i opsamlingsrør (trin 1.4) overtrukket med 2% FBS i PBS i en afkølet eller is-pakket rørholder.
- Umiddelbart efter sortering er afsluttet, ekstrahere DNA.
Representative Results
Mellem prøve variation spiller en rolle for succesen af cellen slags (tabel 1). Prøverne med god succesrate har lave niveauer af forurenende affald (figur 3A) og prøverne med dårlig succesrater har høje niveauer af kontaminerende rester (figur 3B). Mellem prøvevariation kan være lidt styres hvis ledningen blodprøve blev indsamlet inden for 24 timer for forsendelsen (O / N første prioritet).
Flowet sorterede celler fra hver precursor B-celle delmængde er af tilstrækkelig mængde og kvalitet til at udføre nucleinsyre-isoleringer. Det isolerede DNA af høj kvalitet og kan anvendes i efterfølgende analyser. Vi rutinemæssigt udnytte dette DNA i MIRA 11 til berige for methyleret DNA (figur 4).
| Cord Blood Facility data | Dårlig Sorter | |
| Arbejde blodvolumen med antikoagulant (ml) | 110 | 104 |
| Hvide blodlegemer [10 3 / ul] | 8,68 | 11,19 |
| Lymfocytter [10 3 / ul] | 3,88 | 3,76 |
| Lymfocyt (%) | 44,70 | 33,6 |
| Røde blodlegemer [10 6 / ul] | 3,65 | 3,05 |
| In-house data | ||
| Cell Antal efter Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| Cell Antal efter MACS Separation | 22 M | 16,5 M |
| Total Events Count (MoFlo XDP) | 30,57 M | 19,97 M |
| Levedygtighed (%) | 98,00 | 98,00 |
| Celler i lymfocytporten (%) 17,00 | 50,00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| Total Cell Number | 10.959 | 48.316 |
| % Af Begivenheder i alt | 0,04 | 0,24 |
| Effektivitet | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 lav | ||
| Total Cell Number | 16.619 | 26.941 |
| % Af Begivenheder i alt | 0,05 | 0,13 |
| Effektivitet | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 with | ||
| Total Cell Number | 469.745 | 507.540 |
| % Af Begivenheder i alt | 1,54 | 2,54 |
| Effektivitet | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 høj | ||
| Total Cell Number | 1896062 | 2047142 |
| % Af Begivenheder i alt | 6,2 | 10,25 |
| Effektivitet | 91% | 90% |
Tabel 1. Repræsentative celle sortere statistikker. Rækker 1-5 er tæller leveres af navlestrengsblod facilitet. De resterende rækker er data indsamlet i vores laboratorium. Den stakkels slags indeholdt høje niveauer af snavs og en lav procentdel af celler i lymfocytporten.
Figure 1. Rutediagram over proceduren. Navlestrengsblod behandlet og mononukleære celler isoleres under anvendelse af Ficoll-Paque Plus. Et yderligere vasketrin er inkluderet til fjernelse af kontaminerende blodplader. B-celler isoleres fra mononukleære celler ved anvendelse af MACS human B-celle isolation kit (B-CLL). Dette trin anvender biotin-konjugerede monoklonale antistoffer (CD2, CD4, CD11 b, CD36, anti-IgE og CD235a) for at fjerne alle ikke-B-celler. De udvundne B-celler er mærket med CD19-APC, CD34-PE-og CD45-FITC-antistoffer derpå sorteres ved hjælp af MoFlo XDP flowcytometret til at inddrive precursor-B-celle-undergrupper: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 lav , CD19 + / CD34 - / CD45 with og CD19 + / CD34 - / CD45 high.
Figur 2. Gating-strategi til at identificere og sortering popfolkninger. røde pile markerer porten, der anvendes til efterfølgende plot. R4, R5, R6 og R7 porte indikerer sorteret populationer. A) Forward versus Side Scatter plot viser beriget lymfocytpopulationen. R1, lymfocytporten. B) højde i forhold til bredden af forward scatter plot til identifikation af enkelte celler versus dubletter. R2, enkeltcelle-gate. C) CD19-APC-positive celler falder i CD34-PE negative og positive populationer. R3, CD19 + / CD34 - gate, R4, CD19 + / CD34 + gate angiver den ønskede sort befolkning d) CD19 + / CD34 - celler falder i tre lidt adskilte CD45-FITC befolkninger.. R5 og R6, CD19 + / CD34 - / CD45 lav og CD19 + / CD34 - / CD45 with populationer hhv. R7, på grund af høje celletal i CD19 + / CD34 - / CD45 høj befolkning, omfatter denne slags gate kunen del af befolkningen. Alle cellerne i denne population er ikke nødvendigt at indsamle for downstream analyser.
Figur 3. A) Lave niveauer af forurenende affald efter kolonne berigelse. R1, lymfocytporten. B) Høje niveauer af forurenende affald efter kolonne berigelse.
Figur 4. Berigelse af methyleret DNA fra delmængder af precursor B-celler. A) sonikeret DNA isoleret fra precursor-B-celle-undergrupper er af høj kvalitet. Til bibliotekskonstruktion DNA sonikeret til et gennemsnit på 200 til 600 bp. Bane 1: Promega 100 bp stige (katalog # G2101), bane 2: Total isoleret DNA fra CD19 + / CD34 + celler, bane 3: Totalt DNA isoleret fra CD19 + - / CD45 lave celler, bane 4: 100 ng DNA isoleret fra CD19 + / CD34 - / CD45 with celler, Bane 5: 100 ng DNA isoleret fra CD19 + / CD34 - / CD45 høje celler. DNA blev sonikeret ved brug af Diagenode Bioruptor på High i alt 9 min (30 sek ON, 30 sek OFF). DNA blev søjlen renset og visualiseret på en 1% agarosegel med SYBR green nukleinsyre gel stain. B) Efter MIRA hjælp af ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR med SLC25A37 (1-6) og APC1 (7-12) udføres for at bekræfte berigelse af methyleret DNA. 1 & 7: sonikerede genomisk DNA (ingen MIRA), 2 & 8: MIRA-CD19 + / CD34 +-DNA, 3 & 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 lav DNA, 4 & 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 with DNA, 5 & 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 high DNA, 6 & 12: Vandkontrol. Højere forstærkning af SLC25A37 bekræfter berigelsen af methylerede DNAi undergrupper af precursor B-celler.
Discussion
Den faktor, der har størst indflydelse på succesen af protokollen er tilstedeværelsen af kontaminerende vragrester. Hvis anmodende blod fra en ledning blod bank er det vigtigt at have blod afsendt så snart efter opsamling som muligt. Desuden indeholder prøver, der klassificeres som lymfocytose større antal af lymfocytter, imidlertid har disse prøver ikke har tilstrækkeligt mange precursor B-celler og bør ikke anvendes. For at øge sandsynligheden for at opnå et tilstrækkeligt antal celler for hver af de precursor-delmængder anbefaler vi begynder med mindst 85 ml navlestrengsblod.
Det er vigtigt at bemærke, at i modsætning til voksne perifert blod separationer ved fraktionering af navlestrengsblod det mononukleare lag er ofte forurenet med røde blodlegemer 12. Denne protokol omfatter et ekstra vasketrin til fjernelse af kontaminerende blodplader. Protokoller beskriver mononukleare separationer fra navlestrengsblod foreslå herunder en lysis trin to fjerne uønskede røde blodlegemer. Vi anbefaler ikke dette skridt, fordi det producerer forurenende affald og har en negativ indvirkning på succesen af cellens slags.
For at reducere antallet af celler, der skal adskilles ved hjælp af flowcytometri er det nødvendigt at udføre en B-celle-berigelse før cellesortering. Protokollen fra Miltenyi Biotec, der følger med B-Cell Isolation Kit (B-CLL), er optimeret til perifert blod, og anbefaler anvendelse af 10 ul B-CLL biotin antistof cocktail af 10 millioner celler. Dette trin anvender antistoffer mod CD2 (T-celler, NK-celler), CD4 (T-celler), CD11b (granulocytter, monocytter, makrofager), CD16 (NK-celler, makrofager, mastceller), CD36 (blodplader), CD235a (erythroide celler) at udtømme ikke-B-celler fra navlestrengsblod. Det er vigtigt at anvende den beskrevne kit og ikke B-celle-isolation kit II, fordi den tidligere kit indeholder et antistof mod CD43, som findes på pro-B-celler. Under vores optimization af denne protokol, fandt vi, at i alt 40 pi B-CLL biotin antistof cocktail er tilstrækkelig til at frembringe et positivt celle slags resultat. Derudover fandt vi, at anvendelse af så lidt som 5 pi mere af B-CLL biotin antistof cocktail virkede negativt på cellen art. Derfor vil vi stærkt anbefale at bruge 40 ul af B-CLL biotin antistof cocktail for den samlede mononukleære celle tal mellem 175 til 250.000.000. Hvis man starter med lavere eller højere antal celler kan det være nødvendigt at skalere reagenser i overensstemmelse hermed.
Der er mange modstridende publikationer, der beskriver de markører, der kan anvendes til at skelne subpopulationer af B-celler. Det meste af uoverensstemmelse kan forklares ved, at differentiering er en løbende proces, og at tilstedeværelsen eller fraværet af celleoverflademarkører forekommer i en gradvis måde i stedet for på en alt eller intet måde. I denne protokol CD34 - / CD19 + og intensitetsniveauet af CD45 + (lav, middel og høj) udtryk blev anvendt til at skelne pre-BI, præ-BII og umodne B-celler med en stigning i niveauet af CD45 ekspression svarende til progression af differentiering 6. Pro-B-celler er blevet beskrevet af nogle at være CD19 + / CD34 + 13, mens andre har vist, at pro-B-celler er CD19 - / CD34 + og præ-BI celler er CD19 + / CD34 + 9,10. Baseret på disse forskelle, vi har udpeget de CD19 + / CD34 + celler som sene pro-B-celler / tidlige pre-BI celler. Det er vigtigt at bemærke, at denne strategi blev udviklet til at isolere undergrupper af precursor B-celler, der svarer til de celler påvirket af sygdommen akut lymfoblastisk leukæmi. Der er imidlertid flere sortering strategier, der kan anvendes, afhængigt af celletypen undertype af interesse.
Antistof-fluorochrom kombinationer skal vælges på grundlag af funktionerne i den disponible cellesorteringsapparat. Som slægterl regel, den lyseste fluorochrom i panelet skal anvendes til mærkning af mindst folkerige antigen og omvendt. Ved detektering af dobbelt-farvede befolkningsgrupper, især sjældne begivenheder som disse, er dublet diskrimination (figur 2B) en meget vigtig del af gating-strategi. Dette sikrer, at dobbelt-positive begivenheder er virkelig enkeltceller farvet med begge antistoffer og ikke blot to enkelt-farvede celler adhæreret til hinanden.
Høj hastighed, 4-vejs cellesortering skaber nødvendigvis en kontrolleret aerosol miljø. Derfor bør levende menneske cellesortering udføres med stor omhu. Offentliggjorte sikkerhed og dekontaminering Retningslinjerne findes og bør revideres og gennemføres før den slags 14. Godkendelse fra Institutionelle biosikkerhed komitéer eller deres ækvivalenter kan kræves forud for sortering. For korrekt dekontaminering efter sortering bør blegemiddel tilsættes til affaldsbeholderen til en slutkoncentration på 10%. Similarly, bør alle prøverne slanger samt alle overflader i området øjeblikkelig renses grundigt med en frisk gjort 10% blegemiddelopløsning.
Sammenfattet indeholder denne protokol en strategi til opnåelse af sjældne populationer af precursor B-celler og kan modificeres til at isolere en sjælden population stede i navlestrengsblod herunder hæmatopoietiske stamceller og umodne T-celler. For nylig er umodne B-celler blevet identificeret i det perifere blod hos individer med fremskreden HIV 15. Derfor er anvendeligheden af denne fremgangsmåde går ud over studiet af blod kræft. Endelig har vi endnu ikke udført RNA isoleringer på strømmen sorterede celler, men bør denne metode kunne tilpasses med det forbehold, at der under cellesortering cellerne skal sorteres direkte ind i Trizol eller en tilsvarende RNA kompatibel opløsning såsom RLT fra RNeasy kit tilgængelig via Qiagen.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) til KT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W. Fates of human B-cell precursors. Blood. 96 (1), 9-23 (2000).
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
